全 文 ：植物病理学报
ACTAPHYTOPATHOLOGICASINICA　38(2):199-202(2008)
收稿日期:2006-10-11;修回日期:2007-09-24
基金项目:国家自然科学基金(30660006);云南省科技攻关项目(2003NG01)
通讯作者:杨根华 ,副教授 ,主要从事植物病理学方面的研究;Tel:0871-5227096, E-mail:ghyang2000@yahoo.com。
研究简报
云南香石竹立枯病病原的鉴定及致病性研究
李艳琼 1 , 杨根华1＊ , 孔宝华1 , 陈海如 1 , 杨泮川 2
(1云南农业大学 ,云南省植物病理学重点实验室 , 昆明 650201;2云南省英茂花卉公司 , 昆明 650228)
IdentificationandpathogenicityofRhizoctoniasolanicausingdamping-offofcarnation
inYunnan　LIYan-qiong1 , YANGGen-hua1 , KONGBao-hua1 , CHENHai-ru1 , YANGBan-chuan2
(1KeyLaboratoryforPlantPathologyofYunnanProvince, YunnanAgricultureUniversity, Kunming650201, China;2Yingmao
FlowerCompanyofYunnan, Kunming650228, China)
Abstract:27Rhizoctoniasolaniisolatesfromcarnationwithdamping-ofsymptomswereidentifiedasanasto-
mosisgroupAG-4 basedonculturalcharacteristicsandanastomosisinYunnan.Sequenceanalysisof5.8S
rDNA-ITSofyxandtxpresented99% sequencesimilaritywithAG-4 HGⅠ testerisolate.Pathogenicitytests
showedthatisolatesofAG-4HGⅠ werepathogenictocarnation.Thisisthefirstrecordofdamping-ofof
carnationcausedbyAG-4 HGⅠ inChina.
Keywords:carnation;damping-off;Rhizoctoniasolani;AG-4 HGⅠ;5.8SrDNA-ITS
文章编号:0412-0914(2008)02-0199-04
　　香石竹 (DianthuscaryophylusL.)又名康乃
馨(Carnation),原产于南欧 ,为石竹科石竹属宿根
草本花卉。现在世界各地广泛栽培 ,被列为世界主
要切花之一 [ 1] 。近几年来 ,香石竹成为云南外销
花卉的主创品牌 ,发展前景广阔 。然而香石竹立枯
病在香石竹产区普遍发生 ,严重影响了其切花的产
量和品质。
在国外 [ 2]及我国台湾 [ 3]已报道了香石竹立枯
病丝核菌融合群和致病性的研究状况 ,但没有鉴定
到亚群 。我国内地仅综述性报道了引起香石竹立
枯病的病原菌为丝核菌属的立枯丝核菌(Rhizocto-
niasolaniKǜhn),对香石竹立枯病病原菌的分类
地位和致病性的研究尚无报道。本研究通过对病
原菌的培养性状观察 , 5.8SrDNA-ITS序列分析及
致病性研究 ,确定其分类地位及致病性 ,为防治该
病害提供依据。
1　材料与方法
1.1　病样采集
从云南昆明 、玉溪 、曲靖等地采集表现立枯病症
状的香石竹病害标本 ,用于病原菌的分离(表 1)。
1.2　丝核菌的鉴定
1.2.1　丝核菌的分离和纯化　采用常规组织分离
法 ,即在无菌条件下把病组织接种到 2%的水琼脂
培养基上 ,待长出的菌丝经镜检确认是丝核菌后再
转移到 PDA培养基上 。
1.2.2　菌丝形态及培养性状观察　将纯化后的菌
株在 25℃的恒温下培养 5 ～ 7 d,用镊子或解剖针
在菌落边缘取少量菌丝放在一载玻片上 ,用 3%的
KOH溶液和 0.05%番红染液染色做成玻片 ,即可
通过显微镜观察到其菌丝形态和细胞核的数目 。
培养 14 d后观察其培养性状 。
　
植物病理学报 38卷
Table1　Rhizoctoniasolaniisolatesisolatedfrom carnation
Isolatesno. Origin Time Cultivar
dnx Chenggongcounty 11-9-2005 Master
dnx1 Chenggongcounty 11-9-2005 Master
dnx2 Chenggongcounty 11-9-2005 Master
dnx3 Chenggongcounty 11-9-2005 Fenhongbabala
yzx Yuxicounty 13-9-2005 Master
yzx1 Yuxicounty 13-9-2005 Master
yzx2 Yuxicounty 13-9-2005 Master
dyx Chenggongcounty 19-9-2005 Master
dyx1 Chenggongcounty 19-9-2005 Master
dyx2 Chenggongcounty 19-9-2005 Master
dyx3 Chenggongcounty 19-9-2005 Master
dyx4 Chenggongcounty 19-9-2005 Fenhongbabala
yx Yiliangcounty 26-9-2005 Fenhongbabala
yx1 Yuxicounty 26-9-2005 Fenhongbabala
yx2 Yuxicounty 26-9-2005 Master
yx3 Yuxicounty 26-9-2005 Dalasi
yx4 Yuxicounty 26-9-2005 Dalasi
yx5 Yuxicounty 26-9-2005 Taipingyang
yx6 Yuxicounty 26-9-2005 Taipingyang
tx Tonghaicounty 1-10-2005 Unknown
tx1 Yuxicounty 1-10-2005 Unknown
tx2 Yuxicounty 1-10-2005 Unknown
wlx Chenggongcounty 11-10-2005 Master
wlx1 Chenggongcounty 11-10-2005 Babala
qjx Qujingcounty 19-11-2005 Hongbabala
qjx1 Qujingcounty 19-11-2005 Master
qjx2 Qujingcounty 19-11-2005 Master
1.2.3　菌丝融合群的测定　将测试的菌株与标准
菌株(AG1-8,由日本北海道大学提供)相配对 ,配
对的菌丝块以间距 0.5 ～ 1 cm放在灭菌玻璃纸上
后 ,在 25℃培养箱中培养 。待两菌落的菌丝尖端
接触并交叠 2 ～ 3 mm(约培养 12 ～ 24 h)时 ,在显
微镜下观察两个不同菌株菌丝间的融合情况。
1.2.4　菌株全基因组 DNA提取和 PCR扩增　参
照文献 [ 4]的方法 。
1.2.5　检测与分析　取 5 μLPCR产物在 0.5×
TBE缓冲液中用 1%琼脂糖凝胶电泳进行检测。
对扩增出目的片段的 PCR产物用 DNA纯化试剂
盒(上海申友生物技术有限公司)进行纯化后送大
连 TaKaRa公司进行序列测定。并通过软件
(DNAMAN, Version4.0)进行序列分析 。
1.3　菌株致病性测定
1.3.1　供试菌株　由于分离到的 27个丝核菌菌
株通过培养性状和菌丝融合群的鉴定均一致 ,因
此 ,从不同地方分离到的菌株随机选出下列菌株作
为供试菌株:dnx、2yzx、dyx1、dyx4、yx、yx3、yx5、
tx、wlx1和 qjx2。将供试菌株在无菌条件下接种于
直径为 9 cm的 PDA平板培养皿中 ,在 25℃条件
下恒温培养至菌丝长满全皿时 ,用约 20 g灭菌土
200
　
　2期 李艳琼 ,等:云南香石竹立枯病病原的鉴定及致病性研究
覆盖 ,再置于 25℃的恒温箱中培养 3 ～ 4 d,作为接
种土。
1.3.2　供试品种　供试香石竹品种为白雪公主 、
自由 、马斯特和魅丽。
1.3.3　接种　将健康香石竹品种栽入盆钵 ,置于
28℃左右温室中 。接种时 ,在每株苗的根部周围
盖上约 7 g的接种土 ,浇透水后用保鲜袋罩起 ,以
覆盖灭菌土的植株为对照 。每个品种 10株香石竹
为 1个处理 ,每处理重复 3次 。接种 7d后按下列
分级标准观察其发病情况 。划分 0 ～ 4级的分级标
准为:0级 ,无症状;1级 ,叶基部有斑点或腐烂 ,茎
部无症状;2级 , 叶基部腐烂 ,茎部病斑 <1 cm;
3级 ,叶基部腐烂 ,茎部病斑 >1cm;4级 ,幼苗全部
死亡。
1.3.4　再分离　在接种 7 d后 ,对发病的植株用
常规组织分离法进行分离 ,比较接种前后分离到的
丝核菌的形态特征 ,并对分离到的菌株再做融合群
测定。
2　结果与分析
2.1　立枯病危害情况和症状
根据田间调查和病样观察 ,此病广泛分布于昆
明呈贡的斗南 、大渔和乌龙 ,玉溪 、通海。在宜良和
曲靖发病率较低 。感病植株近土表的根茎处褐色
腐烂 ,病部缢缩 ,幼苗期造成倒伏(图 1),较大的植
株则立枯 ,在潮湿条件下 ,腐烂组织表面可以看到
褐色菌丝。
Fig.1　Symptomsofdamping-ofofcarna-
tion
2.2　分离菌株的初步鉴定结果
所分离到的 27个丝核菌菌株 ,均具有立枯丝
核菌的形态特征 。即有明显的桶孔隔膜 ,分枝一般
呈直角 ,分枝发生点附近缢缩并形成一隔膜 ,菌丝
呈深浅不同的褐色 ,菌丝细胞多核 。其培养性状
均一致 , 3 d后开始形成菌核 ,到第 14 d,菌核长满
全皿 。经菌丝融合群鉴定 ,所分离到的丝核菌均为
立枯丝核菌 AG-4。
2.3　供试菌株 5.8SrDNA-ITS区段 PCR扩
增结果
菌株 yx和 tx均扩增到约 750 bp的片段 。菌
株 yx和 tx序列的同源性达 100%,与 AG-4HGⅠ
序列同源性达到 99%,与 AG-4 HGⅡ序列的同源
性达 97%,与 AG-4 HGⅢ序列的同源性达 91%
(图 2)。说明菌株 yx和 tx属于 AG-4HGⅠ 。
Fig.2　Homologicaltreeconstructedbyana-
lysisof5.8SrDNA-ITSnucleotidese-
quences from 5 isolates of
Rhizoctoniasolani
2.4　致病性测定结果
接种试验结果表明 ,供试菌株对供试的 4个香
石竹品种均具有不同程度的致病性。接种 7 d后 ,
魅丽 、自由 、白雪公主和马斯特的发病率分别为
100%、80%、60%和 50%,说明供试菌株对魅丽的
致病性最强 ,对自由的致病性稍弱 ,对白雪公主和
马斯特的致病性最弱;在对照中 ,魅丽和马斯特有
发病的植株 ,其发病率均为 10%,自由和白雪公主
却没有发病现象。从所有发病的植株上均只分离
到丝核菌 ,通过与标准菌株融合鉴定所有菌株均为
AG-4。说明香石竹立枯病的病原菌为立枯
丝核菌。
201
　
植物病理学报 38卷
3　结论与讨论
香石竹立枯病的病原菌为立枯丝核菌中的
AG-4HGⅠ 。
据国外资料报道 ,从香石竹立枯病病样分离到
的丝核菌有立枯丝核菌和双核丝核菌 ,其中 ,立枯
丝核菌又包括 AG-4、AG-6和 AG-7[ 2] 。而在本研
究中 ,从香石竹立枯病病样所分离到的 27个丝核
菌菌株为立枯丝核菌 AG-4。之所以存在此差异 ,
可能是由于各个地区的生态条件存在差异所致 。
菌丝融合群分类法虽然是当前丝核菌最成功
的分类手段 ,但它不能提供丝核菌属融合群间或亚
群间以及融合群内或亚群内更多遗传多样性。因
此 ,本研究在融合群鉴定的基础上又对菌株 yx和
tx进行了 rDNA-ITS序列的分析 ,将其确定为 AG-
4 HGⅠ 。
由于立枯丝核菌 AG-4内有 3个亚群(AG-4
HGⅠ, Ⅱ, Ⅲ ),不同亚群的致病性存在差异[ 5] ,关
于立枯丝核菌 AG-4对香石竹的致病性的报道存
在差异 ,有资料报道 AG-4对香石竹具有弱致病
性 [ 2] ,也有资料报道 AG-4对香石竹(CultivarRag-
gio和 Murcia)具有强致病性 [ 3] , 但是国外 [ 2]及我
国台湾 [ 3]并没有将 AG-4鉴定到亚群 ,可能是由于
亚群的不同造成致病性的差异 。
在本研究中 ,马斯特和白雪公主这两个品种的
抗病性较强 ,自由的抗病性较差 ,魅丽的抗病性最
差。供试菌株的接种试验结果表明 ,空白对照的植
株虽也有发病 ,但其发病率却远远低于接种的植
株 ,说明香石竹立枯病的病原菌为 AG-4 HGⅠ 。
空白对照有发病植株 ,是由于我们所用的土是没灭
菌的 ,而丝核菌是一类在自然界中广泛存在于各类
土壤中的土壤习居性真菌 。
参考文献
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责任编辑:张国珍
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