全 文 ：云南杓兰和紫点杓兰菌根真菌 rDNA ITS序列
及共生专一性分析
*
赵欣宇1，缪福俊2，3，李 璐1，王 娟2，3
(1. 西南林业大学，云南 昆明 650224;2. 云南省林业科学院，云南 昆明 650201;3. 国家林业局
重点开放性实验室云南珍稀濒特森林植物保护和繁育实验室;云南省森林植物培育与开发利用重点实验室，云南 昆明 650201)
摘要:杓兰属植物具有很高的观赏和药用价值，但因被过度采集，已成为濒危植物。菌根真菌是杓兰栽培与繁
育是否成功的关键因子。本实验采用 rDNA ITS序列扩增技术和 MEGA软件对滇西北的云南杓兰和紫点杓兰的菌
根真菌进行研究，结果表明:云南杓兰和紫点杓兰的菌根真菌存在显著的物种层面的专一性关系，即菌根真菌
与杓兰属植物有较强的共生趋势。分离得到的菌根真菌序列已上传至 NCBI，登录号为 lcl51879、lcl25153、
lcl48033、lcl38377、lcl14203、lcl24557、lcl52287 以及 lcl46937。
关键词:云南杓兰;紫点杓兰;rDNA ITS;菌根真菌;专一性
中图分类号:S 718. 81 文献标识码:A 文章编号:1672 － 8246 (2014)03 － 0057 － 05
Mycorrhizal Fungus rDNA ITS and Specificity of Cypripedium yunnanens and
Cypripedium guttatum
ZHAO Xin-Yu1，MIAO Fu-Jun2，3，LI-Lu1，WANG Juan2，3
(1. Southwest Forestry University，Kunming Yunnan 650224，P. Ｒ. China;2. Yunnan Academy of Forestry，Kunming Yunnan 650201，P. Ｒ. China;
3. Yunnan Laboratory for Conservation of Ｒare，Endangered ＆ Endemic Forest Plants，Public Key Laboratory of the State Forestry Administration;
Yunnan Provincial Key Laboratory of Cultivation and Exploitation of Forest Plants，Kunming Yunnan 650201，P. Ｒ. China)
Abstract:Wild lady’s slipper orchids (Cypripedium calceolus)as an ornamental plant with highly medicinal val-
ue，are being seriously threatened due to over collection，and are becoming endangered species． For a success
cultivation and breeding of Cypripedium，mycorrhizal fungus is playing a very important role in this process． In this
test，mycorrhizal fungus extracted from C. yunnanense and C. guttatum which distributed in northwest Yunnan，were
studied through method of rDNA ITS (internal transcribed spacer)sequences analysis，and MEGA software． The
results showed that there was significant relation between the mycorrhizal fungus of C. yunnanense and that of
C. guttatum，in terms of specificity． In another word ，mycorrhizal fungus has a obvious tendency in symbiosis with
specific Cypripedium． The sequences of mycorrhizal fungus were uploaded to NCBI，and the access numbers were
lcl51879，lcl25153，lcl48033，lcl38377，lcl14203，lcl24557，lcl52287 and lcl46937．
Key words:Cypripedium yunnanense;C. guttatum;rDNA ITS;mycorrhizal fungus;specificity
第 43 卷 第 3 期
2014 年 6 月
西 部 林 业 科 学
Journal of West China Forestry Science
Vol. 43 No. 3
Jun. 2014
* 收稿日期:2014 － 02 － 11
基金项目:国家林业公益性行业科研专项项目 (201204110)，云南省社会事业发展专项 (2010CA010) :云南藏区典型区域生态安全
与防控技术研究及应用示范，云南省应用基础研究重点项目 (2013FA054) ，云南省中青年学术技术带头人后备人才培养
项目 (2010CI016) ，云南省教委湿地生态学创新团队项目，云南省应用基础研究计划青年项目 (201401YC00439)等资助。
第一作者简介:赵欣宇 (1986 －)，男，吉林吉林人，硕士研究生，主要从事生物分子方面的研究。
通讯作者简介:王 娟 (1966 －)，女，云南建水人，教授，博士，主要从事生物多样性保护、生态学和竹类植物研究。
兰科植物 (Orchidaceae)是被子植物中传统
四大科之一，全世界约有 700 属 20 000 多种以及
大量的变种，主要分布于热带、亚热带和温带地
区［1］。兰花由于花型独特，颜色美丽，气味芳香，
在全世界倍受人们的青睐。兰科植物在花卉和天然
药物等诸多产业中日益显示出巨大的经济价值和利
用潜力［2］。然而，兰科植物的人工栽培及其产业
化的形成依旧是一个挑战，自然条件下大多数兰花
种子的萌发率低，组培苗移栽时成活率也不高，其
主要原因在于大多数兰花在短期内无法与相关的真
菌形成菌根［3 ～ 4］，因此，兰科的菌根菌则成为某些
兰科植物人工培育的关键。早在 20 世纪初 Bernard
和 Burgeff真正揭开兰科植物菌根之谜后，有关菌
根真菌的种类和真菌对兰科植物种子、幼苗和成年
植株作用的研究得到广泛开展。有学者从兰科植物
杓兰属 (Cypripedium)上分离到真菌，并在培养
中观察到其子实体的形成，将其命名为 Corticium
catotiio［5］，在培养基上成功诱导和形成子实体，推
动了兰科菌根真菌的分离和鉴定等研究工作。余知
和等以盆栽春兰 (Cymbidium goerngii)和野生春
兰的根为材料，利用形态分类学和纯培养技术分离
得到 21 个真菌菌株［6］。然而，以往兰科菌根真菌
的分离和鉴定工作主要通过诱导菌根菌形成产孢结
构进行形态学鉴定，而大量非培养真菌的存在，给
鉴定工作带来了不确定性。近几年，随着分子生物
学的发展，很多学者开始利用分子生物学手段对其
进行分离鉴定，如利用石蜡切片技术对实验室收集
保存的 25 种野生兰科植物的菌根结构进行显微观
察和分子生物学鉴定，对春兰和蕙兰 (Cymbidium
faberi)菌根真菌进行了 rDNA ITS 序列分析，且证
明菌根真菌与其共生兰属植物在种的层面具有显著
的专一性［7］。杓兰属是兰科植物中较为原始的种
类，全世界约 50 种杓兰属植物，叶形奇特、花姿
优美、花色丰富，具有较高的观赏价值，且具有消
肿、利尿和镇痛功能，有较好的药用价值［8］。但
是，近年来过度采挖杓兰属植物的现象十分严重，
不少种类已处于严重濒危状态［9］。研究杓兰属植
物菌根菌的共生关系、菌根菌的分离、培养、种质
资源保存库及其菌根菌的鉴定，遗传多样性的系统
重建等，将有利于杓兰属植物的人工无菌萌发和栽
培驯化，为杓兰属植物的人工繁殖奠定基础。
rDNA是真菌基因组中的一类中度或高度重复
序列，每一重复单位包括高度保守、中度保守和不
保守 3 类区段，在真菌的系统发育分析和鉴定中，
rDNA是十分重要的把序列。本研究应用 rDNA ITS
技术对野生云南杓兰 (C. yunnanense)和紫点杓兰
(C. guttatum)的菌根真菌进行遗传多样性研究，
旨在掌握云南杓兰和紫点杓兰的菌根真菌在同一居
群中物种层面的专一性关系，将得到的 ITS 序列通
过与载体连接，对重组子进行测序，比对重组子的
差异，研究杓兰属植物的菌根真菌多样性，为杓兰
的成功引种栽培提供科学依据。
1 材料与方法
1. 1 实验材料
材料于 2012 年 6 月上旬采自滇西北地区 (见
表 1)，用于 DNA提取所需要的植物菌根在同一植
株采集，每种植株挑取菌根 4 ～ 5 根，用软刷洗去
泥土，流水冲洗过夜。用剪刀把根剪成长短约为 3
～ 4 cm，用 70 %的乙醇消毒 30 s 再放入升汞 1 %
消毒 10 min，用无菌水冲洗 4 ～ 5 次，材料于 4℃
保存 (3 次重复试验)。
表 1 采样记录
Tab. 1 Ｒecord memo of samples
株号 物种 样品编号 居群名称
采集日期
年-月-日
海拔
/m
纬度
(N)
经度
(E)
1 云南杓兰 C. yunnanense Ncy1 纳帕村 2012-6-2 3 349 27°5140″ 99°3751″
2 云南杓兰 C. yunnanense Ncy2 纳帕村 2012-6-2 3 349 27°5140″ 99°3751″
1 紫点杓兰 C. guttatum Ncg1 纳帕村 2012-6-2 3 349 27°5140″ 99°3751″
2 紫点杓兰 C. guttatum Ncg2 纳帕村 2012-6-2 3 349 27°5140″ 99°3751″
3 紫点杓兰 C. guttatum Ncg3 纳帕村 2012-6-2 3 349 27°5140″ 99°3751″
1 云南杓兰 C. yunnanense Jcy1 吉能村 2012-6-3 3 399 27°4757. 4″ 99°392. 8″
2 云南杓兰 C. yunnanense Jcy2 吉能村 2012-6-3 3 399 27°4757. 4″ 99°392. 8″
1 紫点杓兰 C. guttatum Jcg1 吉能村 2012-6-3 3 399 27°4757. 4″ 99°392. 8″
2 紫点杓兰 C. guttatum Jcg2 吉能村 2012-6-3 3 399 27°4757. 4″ 99°392. 8″
注:采集地点为云南省迪庆藏族自治州的香格里拉县纳帕海自然保护区纳帕村和建塘镇吉能村。
85 西 部 林 业 科 学 2014 年
1. 2 方法
1. 2. 1 基因组 DNA提取
本实验在菌根基因组 DNA 的提取的过程中采
用两种方法:液氮研磨法 (参考李潞滨等的方
法［1］)与天根 DNA提取试剂盒 〔宝生物工程 (大
连)有限公司〕，其具体方法参照说明书。
1. 2. 2 菌根真菌菌株 rDNA ITS区段的 PCＲ扩增、
产物纯化以及测序
(1)采用真菌的特异引物 ITS1-F (CTTGGT-
CATTTAGACGAAGTAA)和 ITS4-B (CTGGACCGT-
GTACAAGTCTCCTG)［10］进行 rDNAITS 区段 PCＲ 扩
增和测序。
(2) PCＲ 反应体系 (25 μL)组成:Mix 为
12. 5 μL;引物 1 为 1 μL;引物 2 为 1 μL;模板为
1 μL;ddH2O为 9. 5 μL。
(3)PCＲ 反应循环参数为:预变性 95℃，1
min;变性 95℃，30 s;退火 52℃，1 min;延伸
72℃，1 min;36 个反应循环;延伸 72℃，10 min。
(4)PCＲ产物经纯化后与 pMD-18T (TaKaＲa)
载体连接，转化大肠杆菌 DH-5a，选取阳性克隆测
序［11］。
(5)重组子的 PCＲ检测以 ITS1-F和 ITS4-B为
引物，以上述培养的菌液为模版进行 PCＲ 扩增鉴
定，其反应体系和反应参数同上。反应结束后，将
样品上样于 1 %的琼脂糖凝胶进行电泳检测。
1. 3 数据分析
将测序结果通过序列的 BLAST 同源比对，相
关菌株进行同源性分析。
利用 MEGA5. 2 软件对测序结果进行聚类分
析［12］。
2 结果与分析
2. 1 菌根总 DNA基因组的提取结果
1 ～5号样品均为植物与真菌总 DNA，分别来自
于纳帕村采集的 2株云南杓兰，样品编号为 Ncy1 与
Ncy2，以及 3 株紫点杓兰，样品编号为 Ncg1、Ncg2
与 Ncg3。1 ～4 号样品条带清晰并均有 DNA 条带产
生 (由天根 DNA 提取试剂盒提取获得，见图 1)，
而第 5泳道没有得到 DNA条带，可能是由于在杓兰
菌根 DNA提取过程中缓冲液的 pH值较低，无法得
到质量较高的杓兰菌根真菌的 DNA。而来自于吉能
村采集的 2 株云南杓兰，样品编号为 Jcy1 与 Jcy2，
以及 2株紫点杓兰样品编号为 Jcg1 与 Jcg2，4 个样
品条带清晰并均有 DNA条带产生。
图 1 部分菌根提取的 DNA电泳检测结果
注:1 ～5分别为植物与菌根真菌的总 DNA电泳条带，1为云
南杓兰(Ncy1)，2为云南杓兰(Ncy2) ，3为紫点杓兰(Ncg1) ，
4为紫点杓兰(Ncg2) ，5为紫点杓兰(Ncg3) ，M:marker
Fig. 1 Electrophoresis results of fungi DNA
2. 2 ITS区段 PCＲ扩增结果
将可进行 ITS区段 PCＲ扩增的 8 个 DNA样品，
即 Ncy1、Ncy2、Ncg1、Ncg2、Jcy1、Jcy2、Jcg1 以
及 Jcg2，在 1 %的琼脂糖凝胶上进行电泳，溴化乙
锭染色，紫外灯下观察，以引物 ITS1-F /ITS4-B 扩
增 8 个菌株的 ITS序列，或得约 640bp的 PCＲ产物
片段 (图 2)。
图 2 部分菌株的 rDNAITS区段 PCＲ产物电泳结果
注:1 ～ 8 分别为菌株 rDNA ITS区段 PCＲ产物电泳结果，
M:marker
Fig. 2 Electrophoresis result of some strains，
rDNA ITS PCＲ products
95第 3 期 赵欣宇等:云南杓兰和紫点杓兰菌根真菌 rDNA ITS序列及共生专一性分析
图 2 中 1 ～ 8 号分别为 Ncy1、Ncg1、 Jcy1、
Jcg2、Jcy2、Jcg1、Ncg2、Ncy2 8 个样品的 ITS 扩
增结果。5、6、7、8 号条带清晰，已进行回收纯
化，1、2、3、4 号样品没有出现特意条带，只挑
取 5、6、7、8 号样品进行克隆。
2. 3 重组子鉴定结果
将重组子与 1 %的琼脂糖凝胶进行电泳检测
(见图 3)。1 ～ 6 泳道为云南杓兰的菌根真菌重组
子，8 ～ 13 为紫点杓兰的菌根真菌重组子。云南杓
兰挑取图中 1 (Ncy1)、2 (Ncy2)、5 (Jcy1)、6
(Jcy2)号，紫点杓兰挑取图中 8 (Ncg1)、10
(Ncg2)、12 (Jcg1)、13 (Jcg2)号样品交上海生
工进行测序分别编号:1-1、1-2、1-5、1-6、1-8、
1-10、1-12、1-13，其中 1-1、1-2、1-5、1-6 为云
南杓兰菌根的测序结果，1-8、1-10、1-12、1-13 为
紫点杓兰菌根的测序结果。
图 3 重组子 PCＲ电泳检测结果
注:1-6，8-13，分别为重组子 rDNA ITS区段
PCＲ产物电泳结果，M:marker
Fig. 3 Electrophoresis result of recombinant
2. 4 菌根真菌 rDNA ITS序列的 Blast比对结果
将编号为 1-1、1-2、1-5、1-6、1-8、1-10、1-
12、1-13 样品的测序结果提交至 GenBank 同源比
对，获得的序列已经在 genbank 注册，所得结果如
下:由菌根真菌 rDNA ITS 序列的 Blast 同源比对
(表 2 可知)，自滇西北中甸吉能村与纳帕村野生
杓兰 8 个样品中共获得菌株 8 株，其中 4 株来自云
南杓兰，4 株来自紫点杓兰。1-1 号菌株与 Gen-
Bank登录号为 HM037680 的 Uncultured soil fungus
同源性为 100 %;1-2 号菌株与 GenBank 登录号为
HM037676 的 Uncultured soil fungus同源性为 99 %;
1-5 号菌株与 GenBank登录号为 JX391948 的 Uncul-
tured soil fungus 同源性均为 99 %;1-6 号菌株与
GenBank登录号为 HG422164 的 Uncultured soil fun-
gus同源性为 99 %;1-8号菌株与GenBank 登录号为
HM132003的 Uncultured soil fungus 同源性为 100 %;
1-10 与 1-12 号菌株与 GenBank 登录号为 AB520415
的 Uncultured soil fungus 同源性为 99 %;1-13 号菌
株与 GenBank 登录号为 HM131987 的 Uncultured
soil fungus 同源性为 100 %。
表 2 菌根真菌 ITS序列聚类结果
Tab. 2 Ｒesults of mycorrhizal fungus ITS sequence clustering
菌株
号
GenBank
登录号
GenBank中
最相近菌株
GenBank
登录号
相似
度 /%
1-1 lcl38377 Uncultured soil fungus HM037680 100
1-2 lcl51879 Uncultured soil fungus HM037676 99
1-5 lcl14203 Uncultured soil fungus JX391948 99
1-6 lcl24557 Uncultured soil fungus HG422164 99
1-8 lcl52287 Uncultured soil fungus HM132003 100
1-10 lc125153 Uncultured soil fungus AB520415 99
1-12 lcl48033 Uncultured soil fungus AB520415 99
1-13 lcl46937 Uncultured soil fungus HM131987 100
2. 5 菌根真菌 rDNA ITS序列聚类结果
采自滇西北的云南杓兰、紫点杓兰菌根真菌菌
株 rDNA ITS序列聚类结果见图 4。Ncy1、Ncy2 与
Jcy1、Jcy2 分别来自 2 个不同的居群，但是同源性
为 100 %，说明两个居群的云南杓兰为同一种共生
真菌，以及同一种类的共生真菌对同一物种有专一
性关系。
图 4 菌根真菌 rDNA ITS序列聚类图
Fig. 4 Dendrogram of mycorrhizal fungi based on rDNA ITS
sequences cluster analysis
06 西 部 林 业 科 学 2014 年
3 结语
(1)本研究从滇西北中甸吉能村与纳帕村编
号 Ncy1、Ncy2、Ncg1、Ncg2、Jcy1、Jcy2、Jcg1 以
及 Jcg2 ，8 个野生杓兰样品中，获得了 8 个菌根真
菌 ITS 序列，编号分别为 1-1、1-2、1-5、1-6、1-
8、1-10、1-12、1-13，通过 rDNA ITS 序列的 Blast
比对，获得 8 株共生真菌均为普遍认可的兰科菌根
真菌，鉴定结果与先前诸多报道一致［13 ～ 14］。
(2)聚类结果表明 8 株共生真菌目前为止还
没有进行人工培养为未培养菌，序列差异较大，并
非是同一种真菌，并且分离自该地区的两种杓兰植
物菌根真菌的多样性较低，该地区菌根真菌与兰科
植物存在显著的物种层面的专一性关系，即菌根真
菌与特定兰花物种有较强的共生趋势。8 个菌株的
rDNA ITS区段 PCＲ 产物的测序表明，杓兰属植物
菌根真菌之间的序列具有高度同源性的同时，也存
在着较丰富的长度多态性信息，可以有效的通过兰
属植物菌根真菌之间的 rDNA ITS 区段序列差异来
鉴别杓兰属植物菌根真菌。也证实了杓兰属植物地
理分布、所属种是影响菌根真菌与兰花间专一性关
系的关键因素。该种方法允许少量的序列分析误差
或者错配，不仅用于菌根真菌的分类鉴定，还可对
真菌类群作系统发育分析［15］。
(3)从杓兰植物中分离获得的菌根真菌均为
非培养菌，所以无法从形态学角度进行鉴定，分离
自同一地域的不同种兰属植物菌根真菌有着明显的
差异，表明兰花种类与菌根真菌存在专一性关系。
有关兰科菌根还有许多问题尚未搞清:如兰科植物
与真菌的专一问题，真菌入侵的条件和机理，共代
谢的机制［16］。这些问题是实现兰科植物规模化栽
培的关键，还需要科技工作者的不懈努力。
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