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濒危植物扇脉杓兰野生居群遗传多样性的AFLP分析



全 文 :濒危植物扇脉杓兰野生居群遗传
多样性的 AFLP分析*
钱 鑫
1
李全健
1,2
连静静
1
王彩霞
1
田 敏
1**
( 1 中国林业科学研究院亚热带林业研究所,浙江富阳 311400; 2中国科学院上海辰山植物科学研究中心,上海 201602)
摘 要 扇脉杓兰(Cypripedium japonicum)是一种珍稀的地生兰。为了探索并制定针对性
的保护措施,采用 AFLP 分子标记技术对现存于浙江省的 6 个扇脉杓兰天然居群进行了遗
传多样性和遗传结构的研究。筛选出的 7 对引物共扩增出 377 条清晰条带,多态性比率为
20. 95%。居群总 Nei基因多样性指数为 0. 0512,其中居群内基因多样性为 0. 0247,居群平
均 Shannon多态性信息指数为 0. 0417,群体间总遗传分化系数为 0. 5178,基因流为 0. 4655,
表明扇脉杓兰居群的遗传多样性较低,居群间出现一定程度的遗传分化。UPGMA 聚类和
Mantel检测分析结果表明,居群间的地理位置与遗传距离之间不存在显著相关性(r = 0. 16,
P=0. 242)。基于本研究结果并结合扇脉杓兰的生物学特性,初步提出了相应的保育策略。
关键词 扇脉杓兰;AFLP;遗传结构;遗传距离;基因流;保育策略
中图分类号 Q75 文献标识码 A 文章编号 1000-4890(2013)6-1445-06
Genetic diversity of endangered wild Cypripedium japonicum populations:An AFLP analy-
sis. QIAN Xin1,LI Quan-jian1,2,LIAN Jing-jing1,WANG Cai-xia1,TIAN Min1** (1Research
Institute of Subtropical Forestry,Chinese Academy of Forestry,Fuyan 311400,Zhejiang,China;
2Shanghai Chenshan Plant Science Research Center,Chinese Academy of Sciences,Shanghai
201602,China). Chinese Journal of Ecology,2013,32(6) :1445-1450.
Abstract:Cypripedium japonicum is a rare and endangered terrestrial orchid. To explore and for-
mulate the pertinent conversation strategies of this species,this paper analyzed the genetic diver-
sity and genetic structure of six natural C. japonicum populations in Zhejiang Province of East
China by the method of AFLP. A total of 377 distinct bands were amplified by 7 pairs of selected
primers. The percentage of polymorphic loci was 20. 95%,Nei’s genetic diversity index was
0. 0512,Shannon information index was 0. 0417,genetic differentiation coefficient was 0. 5178,
and gene flow was 0. 4655,indicating that there was a relatively low genetic diversity within the
C. japonicum populations,and a certain degree of genetic divergence existed among the popula-
tions. The analyses of UPGMA clustering and Mantel test showed that there was no significant
correlation between the geographical distance and genetic distance (r=0. 16,P=0. 242). Some
conservation strategies were proposed based on this study and the biological properties of C. ja-
ponicum.
Key words:Cypripedium japonicum;AFLP;genetic structure;genetic distance;gene flow;
conversation strategy.
* 浙江省重大科技攻关项目(2010C02004-2)资助。
**通讯作者 E-mail:tmin115@ 163. com
收稿日期:2012-11-11 接受日期:2013-02-28
扇脉杓兰(Cypripedium japonicum)是一种温带
多年生宿根草本植物,隶属于兰科(Orchidaceae)杓
兰亚科 (Subfam. Cypripedioideae Lindl.)杓兰属
(Cypripedium)。生于海拔 1000 ~ 2000 m的林缘、林
下、荫蔽山坡、溪谷旁等湿润和腐殖质丰富的土壤
上,我国是扇脉杓兰的分布中心(郎楷永等,1997)。
其花型奇特,唇瓣大而艳丽,叶型圆润,植株挺拔,具
有很高的观赏价值;其根状茎具有理气镇痛,祛风解
毒、调经活血等功效,具有一定的药用开发价值(丁
炳扬等,2010)。早在 1973 年,扇脉杓兰就被列入
生态学杂志 Chinese Journal of Ecology 2013,32(6) :1445-1450
DOI:10.13292/j.1000-4890.2013.0264
《濒危野生动植物国际贸易公约》中。但近几十年
来,由于过度采挖和生境的丧失,导致其分布范围缩
小,居群数量急剧减少。在农业部和国家林业局制
定的《国家重点保护野生植物(第二批)》中已被列
为一级保护植物。因此,尽快加强对该物种科学有
效的保护已成为急需解决的问题。
遗传多样性是物种多样性和生态系统多样性的
基础,反映了一个物种适应环境的能力以及种群进
化的潜力(李俊清,1994)。对濒危植物进行遗传多
样性研究有助于了解其濒危的原因以及物种的进化
历史,进而可以对珍稀植物制定针对性的保护方针
和措施,是保护生物学研究的重点(李建辉等,
2007)。AFLP 是由 Vos 等(1995)建立起来的一种
分子标记技术,以信息量大,重复性高,多态性强等
优点著称(王绍先等,2008) ,目前,已被广泛运用于
植物的遗传多样性研究中(Li et al.,2008;张云红
等,2010;Youssef et al. ,2011;单晓辉等,2012)。
近年来,国内外对扇脉杓兰的研究主要集中在
菌根演化(Shefferson et al.,2007)、传粉机制(Sun
et al.,2009)、等位酶分析(Chung et al.,2009)以
及果实与胚胎发育(刘芬等,2012)等方面,而利用
分子标记技术对其进行保护遗传学的研究尚未见报
道,迄今对扇脉杓兰的遗传多样性与遗传结构知之
甚少。本研究运用 AFLP 技术对分布于浙江省的扇
脉杓兰自然居群的遗传多样性水平、遗传分化水平
以及濒危机制等方面进行分析,旨在为该物种的保
护提供一定的科学依据。
1 材料与方法
1. 1 居群取样
根据文献调研和实地考察,2011 年 4—6月,在
浙江省内确定了老殿、宝剑石、红蛇洞、清凉峰、大明
山和里横塘 6 个扇脉杓兰天然居群为研究对象(表
1) ,基本涵盖了该种在浙江的自然分布区(李全建
等,2012)。每个群体随机抽取 30 个生长正常,无
严重缺陷,无明显病虫害的单株幼嫩叶片为试验材
料,株距不小于 5 m。将所采集的样品放入装有硅
胶的封口袋密封干燥保存,带回实验室置于-80 ℃
冰箱保存,用于 DNA的提取。
1. 2 DNA提取与 AFLP 实验
1. 2. 1 DNA 提取 DNA 提取参照 Doyle(1987)的
改良 CTAB 法稍加修改。紫外分光光度法检测总
DNA浓度和纯度,用1. 0%的琼脂糖凝胶电泳检测
表 1 扇脉杓兰居群的采样信息
Table 1 Sample information of Cypripedium japonicum
populations
采集地 样本数 经度
(E)
纬度
(N)
海拔
(m)
坡度
(°)
干扰
程度
老殿 LD 30 119°26 30°20 1102 10-20 轻微
宝剑石 BJS 30 119°25 30°21 1120 30-45 严重
红蛇洞 HSD 30 119°25 30°20 1053 45-60 严重
清凉峰 QLF 30 118°52 30°07 1407 20-30 轻微
大明山 DMS 30 118°59 30°03 1225 25-35 轻微
里横塘 LHT 30 119°26 30°20 1183 30-45 轻微
DNA的完整性。
1. 2. 2 AFLP 实验 AFLP 实验参照 Vos 等(1995)
报道的方法加以改良。
(1)酶切:模板 DNA 1 μg,10 ×Reaction buffer
2. 0 μL,EcoRⅠ(10 U·μL-1)/MseⅠ(10 U·μL-1)
各 0. 5 μL 或 Mse Ⅰ (10 U · μL-1)/Pst I (10
U·μL-1)各 0. 5 μL,BSA 0. 2 μL,加 ddH2O 至 20
μL。先 37 ℃消化 3 h,然后 65 ℃ 灭活 20 min,
1. 5%琼脂糖凝胶电泳检测。
(2)连接:酶切产物 10 μL,T4 DNA连接酶反缓
冲 2. 0 μL,Mse Ⅰ /EcoR Ⅰ 接头各 1. 0 μL 或
者 MseⅠ /Pst I接头各 1. 0 μL,T4 DNA连接酶(400
U·μL-1)1. 0 μL,ddH2O 5 μL。16 ℃连接反应 90
min,连接反应结束后,65 ℃灭活 20 min。
(3)预扩增:Ex Taq(5 U·μL-1)0. 25 μL,10×
Ex Taq buffer 5. 0 μL,dNTP Mixture(2. 5 mmol·
L-1)4. 0 μL,MgCl2(25 mmol·L
-1)4 μL,模板 DNA
2. 5 ng,引物(10 μmol·L-1)各 2. 0 μL,加 ddH2O至
50 μL。扩增程序为 95 ℃ 预变性 5 min;然后进行
30 个循环:95 ℃变性 30 s,56 ℃复性 30 s,72 ℃延
伸 60 s;循环后 72 ℃延伸 10 min;10 ℃保存。预扩
增产物按 1 ∶ 20 稀释,作为选择性扩增模板。
(4)选择性扩增:Ex Taq(5 U·μL-1)0. 2 μL,
10×Ex Taq buffer 5. 0 μL,dNTP Mixture(2. 5 mmol·
L-1)3. 0 μL,MgCl2(25 mmol·L
-1)4 μL,模板 DNA
4. 0 μL,引物(10 μmol·L-1)各 2. 0 μL,加 ddH2O
至 50 μL。扩增程序:94 ℃ 5 min;94 ℃变性 30 s,
65 ℃复性 30 s,72 ℃延 70 s;65 ~ 56 ℃(每个循环
降 0. 7 ℃)退火 30 s,72 ℃延伸 70 s,共 13 个循环;
94 ℃变性 30 s,56 ℃退火 30 s,72 ℃延伸 70 s,共
24 个循环;72 ℃延伸 10 min,12 ℃保存。根据选择
扩增结果,筛选出 7 对多态性高、稳定好的引
物组合。
6441 生态学杂志 第 32 卷 第 6 期
(5)扩增产物检测:AFLP 产物加入适量的 load-
ing buffer混匀,经 95 ℃变性 5 min后,用 6%的变性
聚丙烯酰胺凝胶,75 W恒定功率电泳 2. 5 h,最后银
染显色,拍照。
1. 3 数据分析
AFLP 显带的记录方法为:统计 100 ~ 1500 bp
范围内清晰可辨的电泳条带,有带记为“1”,无带记
为“0”,构建居群二态数据矩阵。利用 POPGENE
version 1. 31(Yeh et al.,1997)软件计算多态位点
百分率(PLL)、Shannon 多样性信息指数(Ho)、Nei
基因多样性指数(He)、平均每个位点的观测等位基
因数(Na)、平均每个位点的有效等位基因数(Ne)、
居群总基因多样度(Ht)、居群内基因多样度(Hs)、
Nei 遗传距离(D)和遗传一致度(I)。根据 Nei
(1973)的基因多度法计算居群间遗传分化系数 Gst
= (Ht - Hs)/Ht。根 据 McDermott 和 McDonald
(1993)的方法计算基因流 Nm =0. 5(1-Gst)/Gst。采
用 NTSYS-pc 2. 1(Rohlf,2000)对居群进行 UPGMA
分析生成聚类图,并用 Mantel 检验分析 6 个种群间
遗传距离与地理距离的相关性。
2 结果与分析
2. 1 AFLP 扩增的多态性
从 144 对 EcoR I /Mse I 和 48 对 Pst I /Mse I
AFLP 引物中,筛选出的 7 对扩增产物多态性较高、
谱带清晰的引物。对 6 个群体 180 份材料进行了扩
增片段长度多态性分析。共扩增出 377 条清晰的条
带,平均每对引物扩增 53. 86 条,多态性条带共有
79 条,多态性比例为 20. 95%(表 2)。
2. 2 居群的遗传多样性与遗传分化
多态位点百分率(PLL)是应用较为广泛的多样
表 2 不同引物对的多态性
Table 2 Polymorphism of different primer combination
引物组合 选择性碱
基的序列
总扩增条
带数
多态性条
带数
多态性
条带百分
比(%)
M-7/E-12 ACG /GCA 53 11 20. 76
M-6 /E-17 GCT /GTA 48 9 18. 75
M-6 /E-20 GCT /ACT 52 5 9. 62
M-12 /E-21 GCA /TAC 55 4 7. 27
M-6 /P-78 GCT /GTT 71 30 42. 25
M-12 /P-78 GCA /GTT 48 12 25. 00
M-12 /P-58 GCA /CGT 50 8 16. 00
平均 53. 86 11. 29 20. 95
共计 377 79
性指标,浙江扇脉杓兰的 6 个天然居群的多态位点
百分率(PLL)的变化范围在 4. 35% ~ 13. 04%(表
3) ,由大到小的顺序依次为大明山、老殿、里横塘、
红蛇洞、清凉峰、宝剑石。在物种水平上,多态性百
分率、观测等位基因数、等位基因的有效数目、Nei
基因多样性和 Shannon 信息多样性指数分别为
22. 53%、1. 2253、1. 0841、0. 0512 和 0. 0806(表 3)。
Nei基因多样性常被用来衡量居群遗传分化的
指标之一,研究结果显示,在群体水平上,Nei 基因
多样性最高的群体是大明山(He = 0. 0359)和里横塘
(He = 0. 0359) ,最低的群体是宝剑石 (He =
0. 0136) ,平均多样性指数为 0. 0269(表 3)。扇脉
杓兰总基因多样性为 0. 0512,其中居群内基因多样
性为 0. 0247,总遗传分化系数为 0. 5178,表明扇脉
杓兰居群总遗传多样性水平偏低,遗传变异主要存
在于群体间,居群间的遗传分化大于居群内的遗传
分化(表 4)。基因流为 0. 4655,表明居群间存在有
限的基因交流。
2. 3 居群间遗传距离和聚类分析
扇脉杓兰居群间的 Nei遗传一致度和遗传距离
分析结果表明(表 5) ,其遗传距离的变化范围在
0. 0107 ~0. 0507,而遗传一致度变化范围为 0. 9506 ~
0. 9894,表现出了较高的遗传相似性,但还是存在一
定的变异幅度。其中清凉峰与里横塘居群间的遗传
距离最小,且两居群的遗传一致度也最高,说明这
表 3 扇脉杓兰居群的遗传多样性
Table 3 Genetic variation of the natural populations of
Cypripedium japonicum
群体 多态位点
百分率(%)
观测等位
基因数
有效等位
基因数
Nei基因
多样性
Shannon
信息指数
宝剑石 4. 35 1. 0435 1. 0235 0. 0136 0. 0207
红蛇洞 7. 51 1. 0751 1. 0338 0. 0207 0. 0323
老殿 12. 25 1. 1225 1. 0574 0. 0347 0. 0538
大明山 13. 04 1. 1304 1. 0594 0. 0359 0. 0559
里横塘 9. 49 1. 1304 1. 0594 0. 0359 0. 0559
清凉峰 6. 72 1. 0672 1. 0357 0. 0208 0. 0317
居群水平 8. 89 1. 0949 1. 0449 0. 0269 0. 0417
物种水平 22. 53 1. 2253 1. 0841 0. 0512 0. 0806
表 4 扇脉杓兰遗传多样性分析
Table 4 Neis analysis of gene diversity in Cypripedium ja-
ponicum populations
项目 总基因
多样性
居群内基因
多样性
基因分化
系数
基因流
平均值 0. 0512 0. 0247 0. 5178 0. 4655
标准差 0. 0161 0. 0042
7441钱 鑫等:濒危植物扇脉杓兰野生居群遗传多样性的 AFLP 分析
表 5 居群间的 Nei遗传一致度和遗传距离
Table 5 Neis genetic identity and genetic distance between populations
居群 宝剑石 红蛇洞 老殿 大明山 里横塘 清凉峰
宝剑石 0. 9749 0. 9638 0. 9563 0. 9553 0. 9506
红蛇洞 0. 0255 0. 9822 0. 9597 0. 9778 0. 9662
老 殿 0. 0368 0. 0180 0. 9696 0. 9767 0. 9762
大明山 0. 0447 0. 0412 0. 0309 0. 9661 0. 9622
里横塘 0. 0457 0. 0225 0. 0236 0. 0345 0. 9894
清凉峰 0. 0507 0. 0344 0. 0241 0. 0385 0. 0107
图 1 扇脉杓兰居群间基于 Nei遗传距离的 UPGMA聚类
Fig. 1 Dendrogram of UPGMA cluster analysis among
Cypripedium japonicum populations based on Nei s genetic
distance
两个居群间相似程度较高。而清凉峰和宝剑石居群
间的遗传距离最大,遗传一致度最低,说明这两居群
间的遗传分化相对较大。
如图 1 所示,里横塘和清凉峰 2 个居群以及红
蛇洞和老殿 2 个居群各先聚合一起,在遗传距离
0. 04 处可以将 6 个居群划分为 3 组:第 1 组包括宝
剑石居群;第 2 组包括红蛇洞、老殿、里横塘和清凉
峰 4 个居群;第 3 组为大明山居群。Mantel 检验居
群间的遗传距离和地理距离的相关性系数 r = 0. 160
(P=0. 242) ,说明扇脉杓兰 6 个居群的遗传距离和
地理距离的相关性未达到显著水平。
3 讨 论
3. 1 扇脉杓兰居群遗传多样性
遗传多样性是居群在长期发展和进化过程中形
成的适应环境变化所必需的一种自然属性。本研究
结果显示扇脉杓兰的遗传多样性水平较低(He =
0. 0512,Ho = 0. 0806) ,与表型多样性的分析结果并
不一致(李全建等,2012) ,这是因为表型性状并非
完全由基因决定的,而是基因型与生境共同作用的
结果,特别是一些数量性状受环境的影响很大。扇
脉杓兰的居群遗传多样性与已报道的采用相同技术
的其他野生兰科植物相比,低于 Himantoglossum
hircinum(Pfeifer & Jetschke,2006)、Neotinea macula-
ta(Duffy et al.,2009)、铁皮石斛(Dendrobium offici-
nale) (Li et al.,2008)、长叶美洲兜兰(Phragmipedi-
um longifolium) (Muoz et al.,2010)等。Chung 等
(2009)利用等位酶技术对韩国扇脉杓兰的居群遗
传多样性进行检测,结果并未得到有效数据(He = 0,
Ho = 0) ,这一方面是由于等位酶标记本身技术的局
限性(夏铭,1999) ,另一方面也侧面反映了扇脉杓
兰的遗传多样性的低下。
影响植物遗传多样性的主要因素包括该物种的
生态学特征、生殖方式、自然选择以及生活史特性
等,生境恶化和人为干扰等因素也对会其产生重要
的影响。我们推测扇脉杓兰的遗传多样性较低的原
因主要有以下几个方面:
首先,扇脉杓兰只生存于具散射光线、通风、湿
润而排水良好的环境中,是一种狭域分布的稀有的
多年生草本植物(陈心启等,2003)。生境单一会使
得环境对扇脉杓兰的遗传多样性的积累作用减弱。
Tremetsberger(2003)对十多个植物种属进行对比研
究,结果表明,不管是多态位点比率还是每个位点的
平均等位基因数目,濒危或特有种的遗传多样性水
平均比其近缘广布种低。
其次,在自然条件下,扇脉杓兰的繁殖方式有有
性生殖和无性生殖两种。但研究发现,扇脉杓兰的
自然结实率较低,而且种子微小,种皮内只含有未分
化完全的胚,缺乏胚乳等营养物质,在自然状态下的
种子萌发对特异真菌的依赖性很高,种子很容易散
至不宜萌发的地方,影响幼苗的补充(Sun et al.,
2009;刘芬等,2012)。因此,自然状态下扇脉杓兰
的有性繁殖效率较低。扇脉杓兰的无性繁殖主要靠
根状茎的生长扩张,芽体长于根状茎节上,其天然居
群常呈斑块状分布正是由于无性克隆的结
8441 生态学杂志 第 32 卷 第 6 期
果。Ayres和 Ryan(1999)认为,克隆繁殖会造成居
群基因型变异的下降。大明山和里横塘居群的 Nei
基因多样性相对较高,这可能与这两个居群的斑块
分布比较分散,克隆繁殖的比率较低有关。
再者,由于其根状茎具有一定的药用价值,野外
考察时经常发现扇脉杓兰被采挖的痕迹,特别是宝
剑石和红蛇洞两地的数量在急剧减少,这可能是造
成这两地 Nei基因多样性相对较低的原因之一。扇
脉杓兰的这几个分布地大都靠近旅游区,人为因素
的干扰造成了居群隔离以及生境的破碎化。Lin-
denmayer和 Lacy(1995)研究发现,当种群被分割
后,等位基因多样性以及种群的杂合度均迅速降低,
本实验结果显示的扇脉杓兰在居群和物种水平上的
有效等位基因数分别为 1. 0449 与 1. 0841,反映了
低水平的杂合度,片断化造成的种群统计随机性的
增加会降低有效种群大小,从而导致更多的遗传多
样性丧失。
3. 2 扇脉杓兰居群遗传结构
居群遗传结构是指基因或基因型在空间和时间
上的分布模式,研究居群的遗传结构是探讨生物适
应力、物种形成以及进化机制的基础(Ge et al.,
2005)。Forrest等(2004)通过对大量文献的归纳,
得出兰科植物遗传分化系数(Gst)的变化范围为
0. 012 ~ 0. 924,平均值为 0. 187。扇脉杓兰的遗传
分化系数(Gst = 0. 5178)大于兰科植物的平均 Gst
值,表明扇脉杓兰有 51. 78%的遗传变异来自居群
间,居群间的遗传分化要大于居群内。高基因流可
以增加居群间基因交换的机率并阻碍居群间的遗传
分化,而扇脉杓兰的基因流为 0. 4655,Wright(1949)
指出,居群间基因流大于 1 时,可发挥均质作用,基
因流小于 1 时,则会突显遗传漂变作用进而加剧居
群间的遗传分化。而天然植物种群基因流的大小主
要取决于花粉流或种子流等(Ennos,1994)。扇脉
杓兰的传粉属于无回报的欺骗性传粉,受粉率偏低,
而且传粉昆虫的活动范围并不大(Sun et al.,
2009)。扇脉杓兰果实中所含的种子虽然多且可随
风流和水流传播,但种子不易萌发的特性以及生境
的片段化使得有效散播的距离极其有限。Mantel检
验群体间的遗传距离和地理距离不存在显著相关性
(r=0. 160,P=0. 242) ,这除了与取样的局限性、人
为干扰因素有关,同时也间接反映了居群间的遗传
变异难以通过有效基因交流来抵消。所以基因流较
低是扇脉杓兰居群间分化的主要原因,另外,由于生
境片段化使其持续处于小居群状态,居群内等位基
因的随机固定也可能会增加居群间的遗传分化。而
UPGMA聚类分析及遗传距离分析结果显示,居群
间的遗传距离较小(0. 0107 ~ 0. 0507) ,这可能从另
一个侧面反映了扇脉杓兰遗传基础较低,本研究得
出的较低的居群总基因多样性(Ht = 0. 0512)也印证
了此点。居群间遗传分化是多态性位点分化水平的
体现,而其遗传距离则是各位点上居群遗传关系的
反映,所以推测是扇脉杓兰整个物种较低的遗传基
础加上居群间有限的基因交流导致了其居群间的遗
传距离小,但同时又有较大的遗传分化的情况出现。
3. 3 扇脉杓兰的保护策略
物种濒危是其内在因素和外界原因综合作用下
的结果。根据本研究结果结合野外考察以及扇脉杓
兰的自身的生物学特性,分析扇脉杓兰濒危的原因
主要有:低水平的遗传基础、有限的基因流、遗传漂
变、对生境的特殊要求、自身的繁殖特性以及人类干
扰造成的一系列连锁反应等等。当然,各个因素之
间是紧密联系、相互影响的。对此,提出以下一些保
护策略:
(1)扇脉杓兰的遗传多样性较低,居群间存在
明显的遗传分化,因此任一个居群遗传多样性的丢
失都可能导致遗传变异的降低,所以应对扇脉杓兰
所有居群的全部个体实施及时的就地保护,尤其是
遗传多样性较高的大明山和里横塘 2 个群体。
(2)对于采挖现象严重的宝剑石和红蛇洞,除
了建立保护点、停止人为破坏外,还应该考虑迁地保
护策略,以促进基因交流,提升居群内遗传多样性。
迁地保护取样时,制定合理的取样策略非常关键,应
详细考虑扇脉杓兰天然居群遗传结构的具体情况,
防止发生远交衰退。另外,由于存在克隆繁殖,所采
集的样品间应保持一定的距离。
(3)扇脉杓兰的传粉率低、有性繁殖能力较弱,
但开花期较为集中,在保护其生境的基础上,可采用
人工授粉等策略,增加结实率,从而提高繁殖效率,
使其居群规模得到尽快恢复,防止居群过小导致遗
传漂变的加剧。
(4)开展组织培养研究工作,建立扇脉杓兰的
快速繁殖体系,然后再结合再引入技术(陈宝玲等,
2010)对扇脉杓兰的居群进行复壮,扩展居群的遗
传库。
(5)深入分析扇脉杓兰种子的生物学特性,如
种子的自然散布模式,种子的生命力,在土壤中的具
9441钱 鑫等:濒危植物扇脉杓兰野生居群遗传多样性的 AFLP 分析
体萌发机制以及与其共生真菌的鉴定与筛选。还可
以利用种子数量多的特点,积极开展扇脉杓兰非共
生无菌萌发研究工作。
(6)扇脉杓兰对生境的要求较高,人类干扰因
素有时会对其造成灾难性的影响。应该尽快完善相
应的法律法规和监督机制,坚决杜绝滥采滥挖和非
法经营,旅游活动必须限制在核心区之外,以保护扇
脉杓兰的原生境。
致 谢 本实验在采样过程中得到天目山国家自然保护区
的牛晓玲老师以及清凉峰自然保护区的张宏伟先生的帮助,
在此表示衷心的感谢。
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作者简介 钱 鑫,男,1986 年生,硕士研究生,研究方向为
兰科植物的保护生物学与生殖生物学。E-mail:qianxin090
@ 163. com
责任编辑 魏中青
0541 生态学杂志 第 32 卷 第 6 期