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五唇兰非致病真菌的特性及对组培苗生长的影响



全 文 :北方园艺 2010(7):81~ 85 植物 ·园林花卉 ·
第一作者简介:陈金花(1982-),女 ,硕士, 现从事热带花卉保育学
研究。
通讯作者:宋希强(1972-), 男,博士生导师, 现从事生物多样性及
其形成机制研究。 E-mail:song.strong@163.com。
基金项目:国家自然科学基金资助项目(30860233);中央级公益性
科研院所基本科研业务费专项资金资助项目(ZS055);海南省研
究生创新基金资助项目(Hxwsy2008-07);海南大学科技基金资助
项目(Rnd 0612)。
收稿日期:2009-12-31
五唇兰非致病真菌的特性及对组培苗生长的影响
陈 金花1 ,2 , 朱国鹏1, 2 , 宋希 强2 ,3 , 胡 美姣4 , 李  凤2
(1.中国热带农业科学院热带作物品种资源研究所,海南 儋州 571737;2.海南大学热带园艺植物资源与遗传改良教育部重点实验室,海南儋州 571737;
3.中国科学院植物研究所系统与进化植物学国家重点实验室 ,北京 100093;4.中国热带农业科学院环境与植物保护研究所 ,海南儋州 571737)
  摘 要:以从野生五唇兰植株上分离筛选到的非致病真菌为研究对象 ,根据形态特征进行种
类鉴定 ,用羧甲基纤维素钠培养基和无机磷培养基进行培养 ,筛选出具有解纤维和解磷能力菌
株 ,再将菌株接种到五唇兰组培苗上。结果表明:在 14株五唇兰非致病真菌中 ,同时具有解纤维
和解磷能力的菌株共10个;除 R06和 R09菌株外 ,其余菌株对五唇兰组培苗生长均有促进作用 ,
其中 RH18 、R03和 R14菌株处理的五唇兰组培苗鲜重增长率极显著高于未接菌对照 , RH19、R02
和S02菌株处理的五唇兰组培苗鲜重增长率显著高于未接菌对照 ,R05和 R002菌株处理与未接
菌对照无显著差异。
关键词:五唇兰;解纤维能力;解磷能力;菌根真菌
中图分类号:S 682.31 文献标识码:A  文章编号:1001-0009(2010)07-0081-05
  当菌根菌与兰科植物成功建立共生关系后 ,就承担
起了传递营养元素的任务。Smith采用标记14C和32P证
实 ,真菌分解纤维素和菌丝中的标记物向兰科植物原球
茎运转[ 1] 。近几年 ,在解磷菌和解纤维素菌的筛选和利
用方面已有许多十分成功的实例 ,但多数集中在农作物
方面 ,如红树林和棉花等 ,而对兰科菌根菌的解纤维和
解磷能力的研究鲜有报道[ 2-4] 。
兰科菌根真菌产生多酚氧化酶氧化基质中的单宁 ,
将纤维素分解成葡萄糖 、醇和各种有机酸 ,或吸取植物
根系外的碳水化合物并输送到兰科植物体上 ,如立枯丝
核菌(Rhizoctonia solani)和瓜亡革菌(Thanatephorus cu-
cumeris)[ 5] 。
兰科菌根菌除了为寄主输入大量的碳水化合物外 ,
还增加寄主对磷和其它营养元素的吸收[ 6] 。由于土壤
中95%~ 98%的磷都不能直接吸收和利用 ,而且磷不易
流动 ,所以在植物根的周围常出现“贫磷区” ,而植物体
只有通过分泌磷酸酶或根系的扩展来吸收 P元素 ,但这
种方式的利用率很低。许多兰科植物的根是肥厚的肉
质根 ,只有很少的侧根和根毛 ,这样的根部特点更不利
于吸收不易流动的磷和铁等矿质元素 ,而菌根菌正好补
充了这一缺点 ,即帮助兰科植物更好地吸收矿质营养。
由于菌根的根外菌丝及菌索的生长 ,菌根菌除了能够分
解土壤中不能直接吸收利用的磷外 ,还大大地扩大了根
的吸收面积和吸收速率 ,深达“贫磷区”以外的土壤[ 6] 。
还有人认为解磷微生物对植物的影响机制除了增加吸
收磷量外还包括分泌了生长调节物质 ,促进根系生
长[ 7] 。此外 ,解磷微生物还可以产生植酸酶、核酸酶和
磷酸酶等加速植酸 、核酸 、磷脂等含磷有机化合物的分
解 ,促进磷素的释放 ,从而提高植物磷素营养[ 8] ;可分泌
有机酸降低 pH值并与铁 、铝、钙 、镁等离子结合 ,从而使
难溶性磷酸盐溶解[ 9] 。
现以五唇兰(Doritis pulcherrima Lindl.)非致病真
菌为对象 ,筛选出同时具有解纤维和解磷能力的菌株 ,
并研究其对五唇兰组培苗生长的影响 ,从而改进菌根真
菌筛选的常规方法 ,探讨一个快速 、高效的菌根真菌筛
选途径 ,为兰科植物菌根真菌的研究和应用提供参考。
1 材料与方法
1.1 试验材料
供试菌株为 R02、R03等共 14株五唇兰非致病真
菌;供试植株为 3条左右根 、4片左右叶的五唇兰组培
苗;培养基为无机磷固体培养基[ 3] 、羧甲基纤维素钠培
养基 [ 10] 和DE培养基[ 11] 。
1.2 试验方法
1.2.1 真菌初步鉴定 将分离出的菌落挑入PDA平板
中活化 ,通过低温、人为切断菌丝等方法诱导子实体 ,综
合有关兰科菌根真菌的报道 ,参照有关书籍和文献[ 12-13]
81
·园林花卉·植物 北方园艺 2010(7):81~ 85
进行分类鉴定。
1.2.2 解磷菌筛选 将供试菌株分别接种到无机磷固
体培养基上 ,每个菌重复 3次 ,28℃暗培养 4 ~ 5 d ,测量
固体培养基上解磷圈大小。根据解磷圈直径与菌落直
径比值大小和解磷圈清晰度判断该菌解磷能力的大小。
1.2.3 解纤维菌筛选 将供试菌株分别接种到羧甲基
纤维素钠培养基上 ,每个菌重复 3次 ,28℃暗培养 4 ~ 5
d ,然后用刚果红染色法染色后观察培养基上菌落周围
的透明水解圈。根据水解圈直径与菌落直径比值的大
小和水解圈的清晰度判断该菌解纤维能力的大小。
1.2.4 对五唇兰组培苗生长的影响 将筛选到具有解
纤维和解磷能力的真菌接种到 PDA培养基上 28℃暗培
养7 d后 ,用打孔器在菌落边缘取直径为 0.5 mm的菌
块备用。在无菌条件下 ,用无菌水冲洗粘附在五唇兰组
培苗根上的培养基 ,无菌吸水纸吸干水分后称取鲜重;
将称重后的苗编号并转接在 DE共生培养基中 ,每袋 8
株;然后取一个菌饼放在每 4株五唇兰苗的中间 ,与每
株苗的距离约 1 cm密封。将接菌苗放在22 ~ 28℃培养
室中进行共生培养 ,每天光照12~ 14 h ,光照强度2 000 lx ,
相对湿度 80%~ 90%。对照不接菌 ,每个处理接 3袋。
最后 ,观察记录苗的生长情况 ,90 d后统计成活率和苗
的鲜重。
2 结果与分析
2.1 菌株种类
经初步鉴定 ,14株五唇兰非致病真菌分属丝核菌属
Rhizoctonia sp.、小核核菌属 Sclerotium sp.、盘多毛孢属
Pestalotia sp.、毛壳孢属 Chaetomium sp.等 4目 6科 11
属(表1)。
  表 1 五唇兰非致病菌株的种类 、菌落及其形态特征


菌株
号 菌株种类 菌落形态 显微特征


菌株
号 菌株种类 菌落形态 显微特征
1 R02
丝核菌属
Rhizoctonia sp.
无旺盛的气生菌丝 ,菌核褐色或黑
色,有的菌落极薄 ,呈细菌状;菌丝
分枝处成直角或锐角 ,多有分隔;无
分生孢子;经诱导未产生子实体
9 R003
丛梗孢属
Monilia sp.
白色或灰色菌落;分生孢子梗分枝
分生 ,孢子成团时粉色 、灰色或黄褐
色 ,单胞,短柱形或圆形
2 R03 10 RH08
木霉属
Trichoderma
sp.
菌落白色毡状,后期在表面产生黄
绿色的分生孢子堆;分生孢子从菌
丝的侧枝上生出 ,直立分枝,小枝对
生 ,顶端不膨大 ,上生孢子团 ,分生
孢子球形 ,无色
3 R05
小菌核菌属
Sclerotium sp.
白色菌落;菌核褐色至黑色 ,球形,
组织紧密 ,内部细胞牵涉 ,软骨质至
肉质 ,未发现无性孢子
11 RH16
简梗孢霉属
Chromospori-
um sp.
无色菌丝 ,后期变为黑色;侧生分生
孢子;分生孢子暗色,卵圆形,单胞
4 R06
盘多毛孢属
Pestalotia sp.
白色菌落,绒状 ,有的边缘不规则,
分泌黑色色素或不分泌;黑色分生
孢子盘,圆盘形或垫形,近表生 ,分
生孢子暗色 ,几个细胞 ,末端细胞尖
而无色,纺锤形,有多根无色顶尖的
附属丝
12 RH18
丝核菌属
Rhizoctonia
sp.
无旺盛的气生菌丝,菌核褐色或黑
色 ,有的菌落极薄 ,呈细菌状;菌丝
分枝处成直角或锐角,多有分隔;无
分生孢子;经诱导未产生子实体
5 R09
拟小卵孢属
Ovulariopsis sp.
白色菌落;分生孢子梗直立 ,简单;
分生孢子单胞 ,无色,棍棒形 ,在顶
部单生
13 RH19
丝核菌属
Rhizoctonia
sp.
6 R12
色串孢属
Tolura sp.
黑色菌落,绒毛状 ,分泌黑色色素;
绒毛状;分生孢子梗短或缺乏;暗色
球状分生孢子,直链 ,单细胞2.5 μm
×3.0 μm~ 5.0μm
14 S02
茎点霉属
Phoma sp.
分生孢子器暗色 ,球形,无孔;分生
孢子无色 ,单胞 ,卵圆形
7 R14
毛壳孢属
Chaetomium sp.
灰白色菌落 ,有的边缘不规则,后期
变成灰色或土黄色 ,绒毛状 ,分泌黄
褐色色素;子囊果飙升,球形 ,灰色
或者土黄色 ,顶有孔 ,四周有卷曲不
分枝刚毛 ,长而不分枝;子囊孢子黑
色梭形,两端尖
8 R002
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北方园艺 2010(7):81~ 85 植物 ·园林花卉 ·
2.2 解纤维和解磷真菌
用无机磷培养基和羧甲基纤维素钠培养基培养后 ,
从14株五唇兰非致病真菌中筛选出具有解纤维和解磷
能力的菌株 10株 , R02 、R03、R05和 R06等。其中 ,S02
的解纤维和解磷能力都比较强 ,其余的菌株有的是解纤
维能力较强 ,有的是解磷能力较强 ,还有的解纤维和解
磷能力都不强(表2 ,图 1 ~ 2)。
  表 2 五唇兰非致病菌株的解磷 、解纤维能力
序号 菌株号 解纤维能力
解磷
能力 序号 菌株号
解纤
维能力
解磷
能力
1 R02 + + 8 R002 + ++
2 R03 + + 9 R003 ++ -
3 R05 + + 10 RH08 - +
4 R06 ++ + 11 RH16 - -
5 R09 ++ + 12 RH18 ++ +
6 R12 - + 13 RH19 ++ +
7 R14 + + 14 S02 ++ ++
  注:“++”表示该菌解纤维或解磷能力较强 , “ +”表示该菌具有解纤维或解磷
能力 ,“ -”表示未观察到解磷圈或水解圈。
图1 S 02 的解磷作用
图 2 S 02的解纤维作用
2.3 解纤维和解磷真菌对五唇兰组培苗生长的影响
所有解纤维和解磷真菌与五唇兰组培苗都能在 DE
培养基上较好共生 , 90 d 后五唇兰组培苗成活率达
100%,除 R06和 R09菌株外 ,其余菌株使五唇兰组培苗
的鲜重增长率均有不同程度地增高 , RH18、R03 、R14、
RH19 、R02、S02、R05和 R002分别比对照高出 56.72%、
44.60%、41.15%、34.15%、14.17%、12.94%、6.43%和
5.18%。经方差分析和多重比较 , RH18 、R03和 R14对
五唇兰组培苗鲜重增长率的影响极显著高于未接菌对
照 ,RH19、R02和 S02处理达显著 ,R05 、R002处理与未
接菌对照无显著差异 ,而 R06 和 R09显著差于对照
(表 3~ 4 , 图3)。
  表 3 解磷和解纤维真菌对五唇兰组
培苗鲜重增长率方差分析
变异来源 平方和 自由度 均方 F值 P值
处理间 152 429.2 10 15 242.92 5.166 0.0001
处理内 778 973.5 264 2 950.657
总变异 931 402.7 274
  表 4 解纤维和解磷真菌对五唇兰组
培苗鲜重增长率的多重比较
处理 平均鲜重增重率/ % 差异显著性
0.05 0.01
RH18 136.06 a A
R03 123.94 ab AB
R14 120.49 ab ABC
RH19 113.49 abc ABC
R02 93.51 bcd ABCD
S02 92.28 bcd ABCD
R05 85.77 cde BCD
R002 84.52 cde BCD
CK 79.34 cde BCD
R09 77.39 de CD
R06 52.10 e D
3 讨论与结论
3.1 解纤维菌和解磷菌
贫瘠土壤中解纤维菌主要是以真菌为主 ,在有氧中
温条件下 ,强烈分解纤维素的真菌有木霉属(Trichoder-
ma sp.)、青霉属(Penici llium sp.)、曲霉属(Aspergi llus
sp.)和镰刀菌属(Fusarium sp.)的一些种 ,其中尤以木
霉属(Trichoderma sp.)受到充分重视[ 14] 。在该试验中 ,
木霉属(Trichoderma sp.)的 RH08未表现出解纤维能
力 ,而丝核菌属(Rhizoctonia sp.)的 RH18和 RH19 、毛
壳菌属(Chaetomium sp.)的 R14 、茎点霉属(Phoma sp.)
的 S02等却表现出较好的解纤维能力 ,说明不同属间的
菌株和同属不同种间的菌株解纤维能力差异较大。据
报道 ,解磷真菌主要是青霉属(Penicillium sp.)、曲霉属
(Aspergil lus sp.)和根霉属(Rhizopus sp.),但是不同的
土壤 ,不同的作物根际 ,解磷菌种群分布存在一定的差
异[ 9] 。在该试验中丝核菌属(Rhizoctonia sp.)、毛壳菌属
(Chaetomium sp.)、茎点霉属(Phoma sp.)、小核核菌属
(Sclerotium sp.)等 12个菌株表现出了解磷能力 ,而在
这几个属解磷能力方面的报道还鲜见。应对兰科菌根
83
·园林花卉·植物 北方园艺 2010(7):81~ 85
图3 6株解磷和解纤维菌菌株对五唇兰组培苗的影响
真菌解纤维能力和解磷能力进行进一步研究 ,以深入揭
示菌根真菌与兰科植物之间的共生机制。
3.2 解纤维和解磷菌的利用
解纤维和解磷菌可制成生物肥应用到生产中。由
于有机肥易滋生各种微生物并危害兰花 ,所以在兰花栽
培上一般不施用基肥 ,常以无机肥和生物肥料代替 ,其
中生物肥料是一种低成本、高产出 、无污染的新型肥料。
纤维素分解菌不仅可将这些物质分解成较简单的物质 ,
亦可作为固氮菌的碳源 ,增加土壤中自生固氮菌和纤维
素分解菌的数量 ,提高土壤的肥力和熟化程度。解磷菌
具有解磷能力和促进植物生长的双重作用[ 7] 。在解纤
维、解磷和促进五唇兰组培苗生长方面 ,丝核菌属
(Rhizoctonia sp.)的 R02 、R03 、RH18和 RH19 ,毛壳菌属
(Chaetomium sp.)的 R14和茎点霉属(Phoma sp.)的
S02表现出较好的综合能力 ,具有潜在的开发价值 ,应将
其开发利用到兰科植物的实际栽培生产和保育中。
另外 ,通过羧甲基纤维素钠培养基和无机磷培养基
筛选到具有解纤维和解磷能力的真菌中 ,丝核菌属
(Rhizoctonia sp .)、毛壳菌属(Chaetomium sp.)和茎点霉
属(Phoma sp.)还是常见的兰科菌根真菌 ,所以 ,在兰科
植物菌根真菌分离时 ,可尝试有针对性地使用解磷菌培
养基和解纤维菌培养基进行分离 ,可大大缩小筛选范
围 ,减少工作量。
3.3 存在的问题
土壤中的解磷菌大多数是腐生菌 ,而土壤中的碳源
主要是植物残体 ,解磷菌无法直接利用 ,故解纤维菌的
存在同时还满足了解磷菌生长所需的碳源营养 ,提高无
机磷细菌溶解磷矿粉的能力[ 15] ,所以 ,有效菌的混合接
种比单一接种的效果要好[ 16] 。试验中仅进行单一接种 ,
在今后的试验中 ,可将解磷菌与解纤维菌进行有机搭配
和配比进行试验。
另外 ,仅从有无产生透明圈来判断微生物解磷或解
纤维能力还不够 ,需进一步进行磷酸酶或纤维素酶的测
定。该试验还未对五唇兰根际细菌(或放线菌)、土壤细
菌(或放线菌)和内生细菌(或放线菌)进行研究 ,应进行
补充试验 ,从多角度探索新的兰科菌根菌分离和筛选方
式。
参考文献
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84
北方园艺 2010(7):85~ 87 植物 ·园林花卉 ·
The Characteristic of D.Pulcherrima No-pathogens and Effection to Seedlings in vitro
CHEN Jin-hua1 ,2 ,ZHU Guo-peng1 , 2 , SONG Xi-qiang2 ,3 ,HU Mei-jiao4 , LI Feng1
(1.Tropical Crops Genetic Resources Institute , Chinese Academy of Tropical Ag ricultural Sciences , Danzhou ,Hainan 571737;2.Key Laborato-
ry of Tropical Horticultural Plant Resources and Genetic Improvement ,Ministry of Education ,Hainan University , Danzhou ,Hainan 571737;3.
State Key Laboratory of Systematic and Evolutionary Botany , Institute of Botany , Chinese Academy of Sciences , Beijing 100093;4.Environment
and Plant Protection Institute, Chinese Academy of Tropical Ag ricultural Sciences , Danzhou , Hainan 571737)
Abstract:Doritis pulcherrima s no-pathogens were studied and the species identifications were given by morphological
character.We screened out fiber-dissolving and phosphate-dissolving fungus by CMC-Na medium and Ca3(PO 4)2 medi-
um in no-pathogens isolated f rom D.pulcherrima Lindl.Phosphate-dissolving and fiber-dissolving fungus were inocula-
ted on seedling in vit ro.The results showed that 10 st rain no-pathogens in 14 had the abilities of fiber-dissolving and
phosphate-dissolving;the promoting effect of phosphate-dissolving and fiber-dissolving fungi higher than control , excep-
ted R06 and R09;f resh grow th rate of D.pulcherrima seedlings inoculated RH18 , R03 ,R14 were marked significant than
control;inoculated RH19 , R02 , S02 were significant than control.The difference between R05 ,R002 and control were
not significant.
Keywords:Doritis pulcherrima Lindl.;fiber-dissolving ability;phosphate-dissolving ability;myorrhizal fungus
第一作者简介:杨菁(1959-),男,教授,硕导,现主要从事农作物及
园艺作物遗传育种工作。
通讯作者:马晓岗(1959-),男 ,研究员,硕士生导师,现从事农作物
及园艺作物遗传育种研究工作。
基金项目:青海省重点科技攻关资助项目(2007-G-136)。
收稿日期:2009-12-25
不同施肥量对高寒地区百合移栽苗生长的影响
杨  菁 , 马 晓岗 , 张玉 清 , 田 海宁 , 穆德 志
(青海大学生物科学系 ,青海西宁 810016)
  摘 要:通过三因素四水平正交设计 ,研究氮 、磷 、钾不同配比对高寒地区百合移栽苗生长的
影响。结果表明:1 kg基质施用522 mg氮肥 、1 176 mg 磷肥 、296 mg钾肥 ,对高寒地区百合叶面
积、株高 、根长效果最好;以 A4B3C4(522 mg/kg氮肥+588 mg/kg 磷肥+444 mg/kg钾肥)的效果
次之 ,以不施任何肥料的效果最差 ,在入土移栽到花盆中以A4B4C3(522 mg/kg氮肥+1 176 mg/
kg磷肥+296 mg/kg 钾肥)时成活率最高 ,可达到85%。
关键词:高寒地区;百合;氮肥;磷肥;钾肥
中图分类号:S 682.2+9 文献标识码:A  文章编号:1001-0009(2010)07-0085-03
  百合(Li liumbrownie)为百合科百合属多年生草本
花卉 ,广泛分布于北半球 ,具有很高的观赏价值和实用
价值 ,是北半球温带和寒带地区主要的栽培花卉品种 ,
具有“球根花卉之王”的美誉[ 1] 。其适应范围广 、生长期
长 ,故栽培面积不断扩大 ,据估计 ,2004年全国的百合切
花生产面积达 2 000 hm2 ,年生产百合切花2亿多支[ 2] 。
东方百合是百合的一个种 ,花朵大 、花瓣厚 、花向上
开 ,花香馥郁且耐瘠薄、抗逆性强 ,在荷兰 、日本等发达
国家很流行 ,成为当今花卉主潮流之一。近年来 ,西方
先进的管理技术开始影响我国 ,于是 ,百合也进入我国
和青海等高寒地区市场 ,但受高寒气候影响花色单一、
花形小 ,花期较短 ,种植较少 ,不能满足市场的需求 ,故
对此方面进行配套施肥技术研究。
1 材料与方法
1.1 试验材料
供试百合品种为东方百合 ,购自青海农发有限公司。
供试肥料:氮肥(尿素含氮46%),磷肥(过磷酸钙折
合五氧化二磷17%),钾肥(硫酸钾折合氧化钾54%)。
1.2 试验方法
85