全 文 ：江西农业学报 2009, 21(3):14 ～ 16ActaAgriculturaeJiangxi
利用 GUS瞬时表达探讨香石竹品种 “云红二号 ”基因枪转化参数
张宝琼 1, 2 ,范眸天 2 ,屈云慧 1 ,李 涵 1＊
收稿日期:2008-12-15
基金项目:云南省攻关及高新技术发展计划项目(2006NG34);云南省科技计划项目(2007C118M)。
作者简介:张宝琼(1983-),女 ,云南宣威人,硕士研究生 ,研究方向为园艺植物生物技术。＊通讯作者:李涵。
(1.云南省农业科学院 花卉研究所,云南昆明 650205;2.云南农业大学 ,云南昆明 650201)
摘 要:利用基因枪法和带有GUS基因的双元表达载体pBI121转化香石竹品种 “云红二号”的外植体。通过检测GUS基
因在香石竹叶片和茎段上的瞬时表达情况 , 分析受体材料、轰击距离及氦气压力对 GUS瞬时表达的影响。结果表明 , 以茎段
为受体材料, 在射程为 6cm、氦气压力为 1100 psi下 ,可检测到 GUS基因较好的表达活性 ,瞬时表达率最高可达 8.33%。
关键词:香石竹;基因枪;瞬时表达;GUS基因;转化参数
中图分类号:S681.5 文献标识码:A 文章编号:1001-8581(2009)03-0014-03
TransformationParametersofCarnation“Yunhong2” byParticleBombardment
invirtueofTransientExpressionofGUSGene
ZHANGBao-qiong1, 2 , FANMou-tian2 , QUYun-hui1 , LIHan1＊
(1.FlowerResearchInstitute, YunnanAcademyofAgriculturalSciences, Kunming650205, China;
2.YunnanAgriculturalUniversity, Kunming650201, China)
Abstract:Inordertoapplyparticlebombardmenttothegeneticbreedingofcarnation, thebinaryvectorpBI121 whichcontained
GUSgenewastransformedintotheexplantsofcarnationbyparticlebombardment.ThetransientexpressionsofGUSgeneintheleaf
andstemwereexamined, andtheeffectsofshootdistance, heliumpressureonthetransientexpressionofGUSgenewereanalyzed.
Theresultsshowedthatusingthestemastheacceptormaterial, undertheconditionsof6 cmshootdistance, 1100 psiheliumpres-
sure, themostactivetransientexpressionofGUSgenecouldbedetected, thehighesttransientexpressionrateofGUSgenewas
8.33%.
Keywords:Carnation;Microprojectilebombardment;Transientexpression;GUSgene;Transformationparameter
香石竹 (Dianthuscaryophylus),属于石竹科 ,石竹
属 。花色娇艳 、色彩丰富、花枝挺拔 ,产量高 ,是世界四大
切花之一。我国香石竹的大规模切花生产是从 20世纪
80年代中期以后开始的。目前我国香石竹育种工作主
要采用杂交育种和诱变育种 。由于香石竹为重瓣花 ,是
雄蕊变瓣而成 ,花粉不易采集 ,而多数品种的雌蕊都不正
常 ,给杂交育种工作带来极大不便 ,远远不能满足新品种
培育的需求。
随着生物技术的发展 ,利用基因工程进行品种改良
已成为农业定向育种的主要手段之一 ,近些年来 ,该项技
术也逐步应用于观赏植物的定向育种研究 ,现已获得了
抗冻能力的郁金香 [ 1] 、提早开花的菊花 [ 2]等。近 10年来
香石竹的基因工程育种也取得了一定的进展 ,澳大利亚
已经将氨基环丙烷羚酸(ACC)氧化酶合成基因的反义
基因导入香石竹 ,使其花期延长了两倍;何秋伶等用叶片
在 3个品种中获得了抗病(GAFP-NPI基因)植株。建
立高效遗传转化体系是实现转基因成功的关键步骤 ,目
前较为成熟和常用的主要是农杆菌介导法 [ 3 ～ 7] 。在以前
的报道中 ,香石竹主要以叶片为受体材料通过农杆菌介
导法成功转进一些目的基因 ,如:延长瓶插寿命 ,改变花
色、香、形 ,抗虫、抗病基因等。但以茎段、花瓣 、花粉为受
体材料的报道较少。叶片再生能力较弱 ,未侵染时再生
率在 38.6% ～ 61.8%,侵染后不足 5%。
基因枪法是一种新的植物基因转化方法 ,与农杆菌
介导法相比它不受宿主 、靶受体类型及组织类型限制 ,可
进行多基因及大片段的转化 ,可控度高 ,目前已应用于玉
米[ 8] 、水稻 [ 9] 、小麦 [ 10]等多种植物的基因转化。 1995年 ,
Zuker首次利用茎节为外植体材料 ,开展了基因枪轰击
法遗传转化研究 [ 11] ,但在品种间存在较大的差异 。
为了实施并突破自育香石竹品种 “云红二号 ”基因
定向改良育种研究 ,故选用该材料 ,利用基因枪轰击法探
索了香石竹 “云红二号”的高效遗传转化技术 ,并建立起
其基因枪高效遗传转化技术体系 。
1 材料与方法
1.1 材料 供试材料为 “云红二号 ”,是云南省农业科
学院花卉研究所自育品种。带有 GUS基因的表达载体
PBI121由云南省农业科学院生物技术研究所提供。
培养基以 MS为基本培养基 ,茎段和叶片再生培养
基见表 1, pH值为 5.8,培养温度为 24 ℃ ±1 ℃,光照强
度 2000 lx,培养 10 h。
表 1 培养基一览表
培养基类型 编号 BA
(mg/L)
NAA
(mg/L)
甘露醇
(mol/L)
分化培养基 D 0.1 0.05
预培养培养基 P 0.1(茎段) 0.05
1.0(叶片) 0.3
高渗培养基 H 0.1(茎段) 0.05 0.4
1.0(叶片) 0.3 0.4
1.2 主要仪器和试剂 PDS1000/ He基因枪及基因枪
耗材(美国 Bio-Rad公司)、普通质粒小提试剂盒(天根
生物技术有限公司)、其他试剂为国产分析纯(上海申能
博彩生物科技有限公司)。
1.3 方法
1.3.1 材料的准备和转化处理 选取生长状态良好的
3 ～ 4周龄的香石竹组培苗 ,切取顶部下端 2 ～ 3对的带
叶茎段作为基因枪转化的受体材料 ,顺势插入含有无菌
P培养基的培养皿上进行预培养 ,每皿于中心向外 5 cm
范围内可放置 100 ～ 200个材料;另取顶芽下 2 ～ 3对顺
茎撕下的叶片作为转化的受体材料 ,叶片切去尖端 ,叶面
朝上平放于含有无菌 P培养基的培养皿上 ,每皿于中心
向外 5 cm范围内约能放置 50片 。次日转到 H培养基
(培养皿中)上进行渗透培养(即作为轰击的靶组织),高
渗处理 4 ～ 6 h后便可以进行基因枪轰击。
1.3.2 质粒的提取 参照普通质粒小提试剂盒说明书 ,
再通过紫外 /可见分光光度计和琼脂糖凝胶电泳检测质
粒纯度和浓度 。
1.3.3 微弹的制备
1.3.3.1 钨粉悬浮 称取钨粉 100 mg,加入无水乙醇 1
mL, 12000 r/min离心 5 min后用 1 mLddH2O清洗 ,重复
3次;5000 r/min离心 ,弃去 ddH2O,加入已灭菌的 50%
甘油 500 μL悬浮 ,分装成 50 μL/管 ,贮于 -20 ℃。
1.3.3.2 质粒包埋 取 50 μL钨粉悬浮液于离心管中 ,
加入 5μgDNA(1μg/μL),轻弹混匀 ;分别加入 50μL
2.5 mol/LCaCl2和 20 μL0.1 mol/L亚精胺轻弹混匀 ,
室温下 20 min后 , 5000 r/min离心 3 min;加入 70%乙醇
200 μL轻弹混匀 , 3000 ～ 5000r/min离心后弃上清 ,重复
1次;加入无水乙醇 200 μL混匀 , 5000 r/min离心;加入
无水乙醇 50 ～ 70μL轻弹混匀即可使用。
1.3.3.3 基因枪对材料的轰击 轰击参数的可裂解膜
压力分别设为 900、1100、1350psi,轰击距离分别设为 6、9
、12cm共 9个组合 ,比较 9个组合对基因枪转化效果的
影响 。
1.3.3.4 GUS表达组织化学检验 取轰击后共培养了 3d
的靶组织进行 GUS组织化学染色 ,操作参照 Jeferson的方
法[ 12] ,观察含有蓝斑的植株数 ,计算转化频率 ,即瞬时表达
率 =GUS表达的植株数 /轰击过的植株总数 ×100%。
2 结果与分析
2.1 外植体对瞬时表达的影响 选取叶片以及茎节段
为基因枪轰击材料 ,经染色后 ,叶片瞬时表达率均为
0%;茎段为 8.33%(见表 2)。
2.2 轰击参数对转化频率的影响 轰击压力 900psi、轰
击距离 6 cm与 1350 psi、6 cm都能转化出植株 ,可转化
率为 2.5%,偏低;但在 1100 psi的压力下转化后所获得
的转化效率较高 ,轰击距离 6 cm下转化效率为 4.17%, 9
cm下转化效率为 8.33%(见表 2)。
表 2 轰击压力和距离对茎段瞬时表达的影响
轰击压力
(psi)
轰击距离
(cm)
接种数
(棵)
表达数 瞬时表达率
(%)
900 6 120 3 25
9 120 0 0
12 120 0 0
1100 6 120 9 8.33
9 120 5 4.17
12 120 0 0
1350 6 120 3 2.5
9 120 0 0
12 120 0 0
2.3 GUS染色后的镜检观察 采用组织化学染色方法
检测了基因枪轰击后的效果。结果表明 ,在 OD600 =0.5
的浓度下 ,有 GUS基因表达的外植体被染成蓝色(见图
1),外植体上还有明显的黑色钨粉痕迹;无 GUS基因表
达的外植体不显蓝色 ,呈现黄白色。
左为解剖镜下观察的外观图 ,右为电子显微镜下观察的细胞图。
图 1 GUS基因在香石竹茎段中的瞬间表达结果
15 3期 张宝琼等:利用 GUS瞬时表达探讨香石竹品种 “云红二号”基因枪转化参数
3 讨论
3.1 外植体的选择 成功的基因转化首先依赖于良好
的植物受体系统的建立 ,高效稳定的再生能力是植物基
因转化受体系统应具备的条件之一。目前作为基因转化
的外植体材料已经研究得非常广泛 ,尤其是通过愈伤组
织途径 , 往往扩繁量大 , 用于基因转化可获得较多的转
化植株。但对于香石竹而言 ,余义勋等 [ 13] (2006)认为香
石竹通过愈伤组织再生不定芽是比较困难的。本实验也
曾先用叶片和茎段诱导愈伤再分化不定芽 ,诱导率仅为
30%,偏低。此次实验直接用叶片和茎段作为外植体也
存在一些问题 ,通过对两种外植体进行比较 ,茎段作为外
植体比叶片好 ,分析原因可能是由于叶片所占面积较大 ,
受力面积较小 ,微弹不易打在伤口处 ,且叶片还需经过分
化不定芽才能完成整个转化过程 ,其转化率就会进一步
降低。利用茎段为受体材料时 ,单位面积可放置的材料
数量较多 ,且相对较嫩的伤口会复原成为嫩芽或者打在
叶腋间的几率也很大 ,故茎段是基因枪转化的较佳受体
材料。用茎段做转化受体材料时瞬时表达率还是相对较
低 ,仅为 8.33%。其原因有可能是试验所使用的材料继
代时间较长 ,植株体内积累了较多的激素和抗体物质 ,下
一步将对此继续开展研究 。
3.2 基因枪转化试剂的使用 在微弹制备时 ,钨粉用量
和 DNA用量对 GUS基因瞬时表达的蓝点数有着明显的
影响。在实验中发现 ,对香石竹进行轰击 ,钨粉悬浮液使
用 5 μL/枪时 ,对外植体所造成的伤口较小 ,蓝斑很不明
显 ,使用 10 μL/枪 钨粉悬浮液时 ,蓝斑明显 ,大于 10
μL/枪时 ,对外植体所造成机械损伤较大 ,蓝斑很不明
显 ,据推测也许是钨粉聚集太多 ,钨粉的黑色掩盖了蓝斑
的显色 ,所以还需进一步进行研究 。
3.3 轰击参数的组合 在基因枪轰击时因所采用的材
料品种不同 ,轰击条件也就有所差异。其中基因枪轰击
的距离和压力共同决定微弹运行的速度和进入靶组织的
深度 , 而轰击距离和压力的选择则根据靶材料的软硬程
度 、易转化和可再生性决定 ,在我们所检测的 3个压力
中 , 900 psi的压力轰击后植物受到的损伤较小 , 1350 psi
的压力下轰击后植物材料受到的损伤较大 , 相应地导致
了转化效率的下降 ,而在 1100 psi的压力下转化后所获
得的转化效率较高 ,故 1100 psi为最佳轰击压力。
3.4 自育香石竹品种 “云红二号 ”基因枪高效遗传转化
参数 本实验在利用基因枪法的转化中 ,针对香石竹品
种“云红二号” ,选择带叶茎段作为受体材料 ,在射程为 6
cm、氦气压力为 1100 psi下 ,可检测到 GUS基因的最佳
表达活性 ,瞬时表达率可高达 8.33%。初步使用基因枪
技术建立了 “云红二号”基因枪遗传转化参数体系。
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16 江 西 农 业 学 报 21卷