全 文 ：Effects of analgesia of oxymatrine on HVDCCs auxiliary subunits
Xu Ｒongxue1，Yang Li* 1，Deng Yangou2，Wu Shixing1，Wang Xinrui1，Liu Yonggang3
(1Department of Pharmacology，School of Basic Medical Science，Liaoning University of TCM，Shenyang 110847;2 Department of Gerontol-
ogy，the First Hospital of China Medical University，Shenyang 110001;3Department of Pharmacy，Guangdong Province Corps Hospital，
Chinese People＇s Army Force，Guangzhou 510507)
Objective:To investigate the effects of oxymatrine on the mＲNA expressions of high voltage-dependent calcium channel＇s auxiliary sub-
units in brain，spinal cord and dorsal root ganglia tissues from neuropathic mice，and to further explore the analgesic mechanism of
oxymatrine． Methods:Fifteen C57BL /6 mice were randomly divided into sham operation group，model group and oxymatrine group，and 5 in
each group． Neuropathic pain models were established by partial sciatic nerve ligation on both the left and right hind legs of C57BL /6 mice．
Ｒeal-time quantitative PCＲ technique were used to detect the mＲNA expressions of multiple auxiliary subunits for high voltage-dependent cal-
cium channel in brain，spinal cord and dorsal root ganglia tissues from these mice． Ｒesults:In brain tissue，the mＲNA expression levels of
auxiliary subunit α2δ1 and α2δ2 were significantly increased，while those of α2δ3 and α2δ4 were significantly decreased in the model group
mice (P ＜ 0． 05)． Compared to this，in oxymatrine group，the mＲNA levels of subunit α2δ1，α2δ2，α2δ3 and γ1 decreased significantly，
but that of α2δ4 was increased significantly (P ＜ 0． 05);In spinal cord tissue，the mＲNA expressions of α2δ1，α2δ2，α2δ3，γ1 and γ4
were significantly increased in the model group mice(P ＜ 0． 05)． These elevations of the mＲNA level of α2δ1，α2δ2 and α2δ3 in the model
group mice were attenuated by applying oxymatrine(150mg /kg) (P ＜ 0． 05) ;In DＲG tissue，the mＲNA level of α2δ1 was significantly in-
creased and those of α2δ2 and α2δ3 were significantly decreased in the model group mice (P ＜ 0． 05) ，but administration of oxymatrine
(150mg /kg)showed attenuation on the elevated mＲNA level of α2δ1 significantly (P ＜ 0． 05)． And subunit α2δ4 and γ3 were not ex-
pressed in DＲG tissue． In all these tissues，both partial sciatic nerve ligation and oxymatrine administration didn＇t show any effects on the
mＲNA expressions of other β and γ subunits． Conclusions:The analgesia of oxymatrine was highly correlated to the auxiliary subunit α2δ1
of HVDCCs．
Key words oxymatrine(氧化苦参碱);neuropathic pain;high voltage-dependent calcium channels;auxiliary subunits
苦龙胆脂甙对肝癌细胞增殖、凋亡和迁移的作用*
黄 春，李润琴＊＊
(重庆三峡医药高等专科学校基础医学部，重庆 404120)
摘 要 目的:探讨川东獐牙菜中活性成分苦龙胆脂甙(amarogentin)对肝癌细胞增殖、凋亡和迁移的影响。方法:分别用梯
度浓度的苦龙胆脂甙刺激正常肝细胞系(LO2)和肝癌细胞系(HepG2 和 SMMC-7721)后，利用细胞计数试剂盒检测三种细胞在 12，
24 和 48 h增殖情况;利用异硫氰酸荧光素标记的膜联蛋白 /碘化丙啶结合流式细胞仪检测三种细胞在 48 h 的凋亡率;利用 Tran-
swell法检测两种肝癌细胞的迁移情况;利用实时荧光定量聚合酶链反应和蛋白印记法分别检测肝癌细胞 p53、AKT、核因子 κB (nu-
clear factor κ b，NF-κB)、人端粒酶逆转录酶(human telomerase reverse transcriptase，hTEＲT)和 p38 的 mＲNA和蛋白表达水平。结果:
与正常肝细胞比较，苦龙胆脂甙能够明显地抑制肝癌细胞的增殖，并且其抑制作用存在时间和剂量依赖性。当浓度为 110 μg /ml刺
激肝癌细胞 48 h后，不仅能明显抑制肝癌细胞的迁移，而且 p53 的 mＲNA和蛋白表达明显提高，同时 AKT、NF-κB和 hTEＲT的 mＲ-
NA和蛋白表达明显被抑制。结论:苦龙胆脂甙能明显抑制肝癌细胞的恶性行为，为临床辅助治疗肝癌提供新的思路。
关键词 苦龙胆脂甙;肝细胞肝癌;增殖;凋亡;迁移
肝细胞肝癌(hepatocellular carcinoma，HCC)是全球最为恶
性的消化系统肿瘤之一，我国每年新发病例占全世界每年新发
病例一半左右 ［1］。虽然，肝移植和根治性肝切除能够极大的提
高肝癌患者的生存率，但是肝癌切除术后缺乏有效的辅助化疗
药物是影响患者治疗耐受的主要因素之一 ［2］。因此，寻找新的
有效的辅助治疗肝癌的药物是提高患者生存质量的有效手段
之一。
川东獐牙菜(Swertia davidii Franch)其活性成分被报道具有
抗肝炎、黄疸以及减轻缺血再灌注损伤的作用 ［3］。其中从川东
獐牙菜提取的活性成分-［(2S，3Ｒ，4S，5S，6Ｒ)-2-［［(3S，4Ｒ，
4aS)-4-乙烯基-8-羰基-4，4a，5，6-四氢-3H-吡喃酮［3，4-c］四氢
吡喃-3-基］氧基］-4，5-二羟基-6-(羟甲基)四氢吡喃-3-基］2，4-
35中药药理与临床 2016;32(3)
* 基金项目:重庆市自然科学基金(No． cstc2012jjA10125) ＊＊通讯作者
DOI:10.13412/j.cnki.zyyl.2016.03.014
二羟基-6-(3-羟苯基)苯酸盐，即苦龙胆脂甙(amarogentin)近年
来被报道具有预防大鼠体内肝癌形成的作用 ［4］。但是，在体
外，苦龙胆脂甙是否具有抑制肝癌细胞恶性行为的作用，以及
促进肝癌细胞凋亡信号通路目前仍不清楚。本文通过从川东
獐牙菜提取并纯化的苦龙胆脂甙，作用于肝癌细胞系和正常肝
细胞，比较两者的增殖率和凋亡率以及观察肝癌细胞的迁移情
况，并检测凋亡信号通路相关蛋白的表达情况，试图说明苦龙
胆脂甙对肝癌细胞生物行为的影响。
1 材料和方法
1． 1 试验药物 川东獐牙菜是由重庆三峡医药高等专科学校
中药研究所沈力、胡玉彬、蔡兴东品种以及鉴定。从川东獐牙菜
中提取和纯化苦龙胆脂甙参照文献［4］，步骤稍有改动，其中苦
龙胆脂甙的化学式为［(2S，3Ｒ，4S，5S，6Ｒ)-2-［［(3S，4Ｒ，4aS)-
4-乙烯基-8-羰基-4，4a，5，6-四氢-3H-吡喃酮［3，4-c］四氢吡喃-3-
基］氧基］-4，5-二羟基-6-(羟甲基)四氢吡喃-3-基］2，4-二羟基-
6-(3-羟苯基)苯酸盐，英文名为 amarogentin，分子式为 C29 H30
O13，分子质量 586． 54。提取步骤:川东獐牙菜干燥粉末(30． 0
g)溶解于 8 倍体积的 60%乙醇，然后用超声清洗仪震荡 3 次，
每次 30 min。每次超声震荡后均用精密过滤器过滤，剩下的滤
渣同样溶解于 8 倍体积的 60%乙醇，反复震荡溶解，直至粉末
完全溶解。所得到滤液依次用石油醚、乙酸乙酯和丁醇萃取，最
终从丁醇萃取溶液用旋转蒸发仪蒸发直至得到苦龙胆脂甙粗
提粉末。粗提粉末送至成都思普生物科技公司进行提纯。苦龙
胆脂甙的纯度利用高效液相分析仪进行检测(图 1)。检测结果
示:从獐牙菜提取的苦龙胆脂甙粗提粉末获得率为 18． 33% ±
0． 4%，最终纯化的苦龙胆脂甙用高压液相仪检测的纯度大于
99． 2%，经过改良，从川东獐牙菜提取苦龙胆脂甙的获取率明显
提高。
图 1 高效液相分析仪检测苦龙胆脂甙纯度的结果
1． 2 细胞 肝癌细胞系(HepG2 和 SMMC-7721)和正常肝细胞
系(LO2)由重庆市肝胆外科重点实验室惠赠。
1． 3 试剂 ＲIPA 1640 改良型培养基(SH30809． 01)、DMEM高
糖培养基(SH30243． 01B)、胎牛血清(SH30084． 03)和胰酶
(SH30042． 01)均为 HyClone公司产品。细胞计数试剂盒 8(cell
counting kit 8，CCK-8)(CK04-500)为同仁公司产品。异硫氰酸
荧光素标记的膜联蛋白(annexinⅤ-fluorescein isothiocyanate
(FITC))/碘化丙啶(propidium iodide，PI)细胞凋亡检测试剂盒
(KGA107)、ＲIPA 裂解液(KGP702-100)和 ECL 发光试剂盒
(KGP1122)购于凯基生物公司。小鼠抗核因子 κ b P65(nuclear
factor κ b P65，NF-κB P65)抗体(#6956，稀释比例 1:1000)、小鼠
抗 Akt抗体(#2920，稀释比例 1:2000)、小鼠抗 p53 抗体(#
2524，稀释比例 1:1000)和小鼠抗 p38 抗体(#9228，稀释比例 1:
1000)购自 Cell Signaling Technology公司，小鼠抗人端粒酶逆转
录酶(human telomerase reverse transcriptase，hTEＲT)抗体(sc-
393013，稀释比例 1:500)购自 Santa Cruz Biotechnology 公司，小
鼠抗 β-actin抗体(BM0627，稀释比例 1:250)和 HＲP 标记的山
羊抗小鼠 IgG(BA1051，稀释比例 1:2000)购自武汉博士德公
司。BCA测蛋白浓度试剂盒(P0012S)购于江苏碧云天公司;细
胞和组织 ＲNA提取试剂盒(CW0597)购于北京康为世纪公司;
实时聚合酶链式反应扩增试剂盒(ＲＲ820L)及逆转录试剂盒
(ＲＲ047a)购于 Takara公司。
1． 4 仪器 高效液相仪、凝胶显像仪和 PCＲ仪为 Bio-Ｒad公司
产品，酶标仪为 Eppendorf公司产品。
1． 5 方法 HepG2 和 SMMC-7721 细胞均用 DMEM 高糖培养
基和 10%胎牛血清培养，LO2 细胞用 ＲIPA 1640 改良型培养基
和 10%胎牛血清培养。三种细胞均培养于 37℃，含 5% CO2 以
及适合湿度的培养孵箱中。
1． 5． 1 CCK-8 检测细胞增殖 每 5000 个 HepG2、SMMC-7721
和 LO2 细胞加入到 96 孔板中，培养 12h后每孔加入梯度浓度的
纯化苦龙胆脂甙(15、30、60、90、120、150 μg /ml)。三种细胞继
续培养 12，24 和 48 h后每孔加入 10 μl 的 CCK-8 试剂和 90 μl
培养基，在 37℃暗室孵育 1． 5 h后用酶标仪进行检测，检测波长
为 450 nm。每组均设置 6 个复孔，每组均实验重复 3 次。
1． 5． 2 流式细胞仪检测细胞凋亡率 每 105 个 HepG2、SMMC-
7721 和 LO2 细胞加入到 6 孔板中，继续培养 12 h后加入苦龙胆
脂甙。三种细胞继续培养 48 h 后进行凋亡检测，即细胞消化、
离心后，用 binding buffer 重悬后依次加入 5 μl 的 annexinⅤ-
FITC抗体和 5 μl的 PI，4℃暗室孵育 30 min后进行流式细胞仪
检测。
1． 5． 3 Traswell小室检测肝癌细胞的迁移 每 105 个 HepG2 和
SMMC-7721 细胞加入到 6 孔板中，继续培养 12 h后加入苦龙胆
脂甙分别刺激 48 h。上述处理的每 105 个细胞重新种植到 Tr-
answell上层小室中，上层小室的培养基只含 2%胎牛血清，下层
小室培养基含 20%胎牛血清。继续培养 24h 后用结晶紫染色
后再显微镜下观察，每组观察 5 个视野。
1． 5． 4 ＲT-PCＲ检测 每 105 个 HepG2 和 SMMC-7721 细胞加
入到 6 孔板中，继续培养 12 h后加入苦龙胆脂甙。两种细胞刺
激 48 h后分别提取细胞总 ＲNA。提取 ＲNA步骤严格按照试剂
盒说明书操作，即每个孔加入 1 ml 裂解液裂解细胞，转移到无
酶 EP管中震荡、离心，再经过氯仿萃取，乙醇溶解、祛除蛋白和
DNA步骤后，最后用 ＲNase dH2O溶解 ＲNA并用分光光度计检
测 ＲNA浓度。
然后用 SYBＲ Green法进行 ＲNA逆转录和 Premix Ex Taq
Ⅱ法进行 SYBＲ PCＲ反应:(1)去除基因组 DNA:10 μl 体系(2
μl 5 × gDNA Eraser Buffer，1 μl gDNA Eraser，1 μg Total ＲNA 和
补充体积的 ＲNase dH2O)进行 42℃水浴 2 min;(2)逆转录:1 μl
的 PrimeScript ＲT Enzyme Mix I、1 μl 的 ＲT Primer Mix、4 μl的 5
× PrimeScript Buffer、4 μl的无 ＲNase dH2O和 10 μl去除基因组
gDNA后的总 ＲNA产物。37℃，15 min;85℃，5 s;4℃保存;(3)
PCＲ反应:25 μl 反应体系(12． 5 μl 2 × SYBＲ Premix Ex Taq
Ⅱ、1 μl PCＲ Forward Primer(10 μmol /L)、1 μl PCＲ Ｒeverse
Primer(10 μmol /L)、2 μl反转录溶液和 8． 5 μl ＲNase dH2O)进
45 中药药理与临床 2016;32(3)
行预变性:95℃，30 s，1 循环;然后扩增:95℃，5 s;60℃，60 s;总
共 40 循环。最后用 2-△△Ct = 2-{(Ct目的 － Ct内参)对照组 － (Ct目的
－ Ct内参)实验组进行半定量分析。引物序列由上海生工生物
公司合成，表格 1 为目的基因的引物序列及大小。
表 1 目的分子引物设计
分子 引物序列 大小(bp)
p53 正义链:5-TCAACAAGATGTTTTGCCAACTG-3 118
反义链:5-ATGTGCTGTGACTGCTTGTAGATG-3
hTEＲT 正义链:5-AAGGTGAAGGGGCAGGACGGC-3 240
反义链:5-GAGTGGATTCGCGGGCACAGA-3
Akt 正义链:5-CTTTCCAGACCCACGACC-3 155
反义链:5-CTCCGAGTGCAGGTAGTCC-3
NF-ΚB P65 正义链:5-CTGCCGGGATGGCTTCTAT-3 91
反义链:5-CCGCTTCTTCACACACTGGAT-3
p38 正义链:5-GCGCTACACCAACCTCTCGT-3 377
反义链:5-CACGGTGCAGAACGTTAGCTG-3
GADPH 正义链:5-TGCACCACCAACTGCTTAGC-3 87
反义链:5-GGCATGGACTGTGGTCATGAG-3
1． 5． 5 WB检测 每 105 个 HepG2 和 SMMC-7721 细胞加入到
6 孔板中，继续培养 12 h后加入苦龙胆脂甙。两种细胞刺激 48
h后分别提取细胞总蛋白。蛋白提取:每孔加入 100 μl ＲIPA裂
解液裂解细胞，经震荡、高速离心后获取细胞总蛋白上清;BCA
法测得蛋白含量，按每个样本 50 μg的蛋白质上样，按每孔等质
量等体积加入，进行 10% SDS-PAGE，100 V 恒压电泳 120 min;
250 mA，60 min 湿转至 PVDF 膜中，5% BSA 室温封闭 60 min;
加一抗体(稀释倍数均严格参照说明书)后 4℃孵育过夜;洗涤
后，加 HＲP标记的二抗(稀释倍数均严格参照说明书)，室温孵
育 90 min;TBST洗涤后，ECL试剂盒在凝胶成像系统发光检测;
利用 Image Lab软件扫描目的条带和相应的 β-actin 条带，并测
量灰度值。然后将目的条带的灰度值与 β-actin 的灰度值进行
比较，所得的比值为目的蛋白的相对蛋白表达量。
2 结果
2． 1 苦龙胆脂甙对肝癌细胞增殖的影响 LO2，HepG2 和
SMMC-7721 细胞的增殖抑制效果随着苦龙胆脂甙作用浓度升
高而明显，随着苦龙胆脂甙的作用时间的延长而明显(表 2)。
所以利用一元线性回归分析细胞存活率和苦龙胆脂甙作用浓
度的相关性，结果示细胞存活率和苦龙胆脂甙作用浓度两者具
有较强相关性(Ｒ2 ＞ 80%)。进一步计算苦龙胆脂甙对 LO2 细
胞的 LD50在 12，24 和 48 h分别是 207． 5 μg /ml，166． 5 μg /ml和
137． 8 μg /ml，对 HepG2 细胞的 IC50在 12，24 和 48 h 分别是
163． 1 μg /ml，133． 9 μg /ml和 94． 8 μg /ml;对 SMMC-7721 细胞
的 IC50在 12，24 和 48 h 分别是 219． 1 μg /ml，143． 6 μg /ml 和
105． 8 μg /ml。因此，苦龙胆脂甙对肝癌细胞的抑制效果有时间
和浓度依赖性，而且苦龙胆脂甙抑制肝癌细胞的增殖效果明显
比正常肝细胞的抑制效果明显。并且，在 48 h时，浓度为 105． 8
μg /ml(95%CI［85． 5，126． 4］μg /ml)的苦龙胆脂甙对 SMCC-
7721细胞的抑制率达到 50%，为了保证对肝癌细胞的良好的抑
制效果，同时对正常肝细胞抑制最小，我们下列实验均选择 110
μg /ml作为苦龙胆脂甙抑制肝癌的作用浓度，作用时间为 48 h。
表 2 苦龙胆脂甙对肝癌细胞和肝细胞增殖的抑制率(珋x ± s，n = 3，%)
浓度
(μg /ml)
LO2
12 h 24 h 48 h
HepG2
12 h 24 h 48 h
SMMC-7721
12 h 24 h 48 h
0 0 ± 0． 1 0 ± 0． 0 0 ± 0． 1 0 ± 0． 2 0 ± 0． 0 0 ± 0． 1 0 ± 0． 2 0 ± 0． 1 0 ± 0． 1
15 2． 4 ± 0． 4 6． 2 ± 0． 2 8． 6 ± 0． 2 9． 42 ± 0． 1 11． 3 ± 0． 2 16． 7 ± 0． 4 6． 7 ± 0． 7 8． 5 ± 0． 7 10． 6 ± 0． 0
30 9． 3 ± 0． 3 17． 1 ± 0． 2 18． 3 ± 0． 7 14． 7 ± 0． 1 23． 1 ± 0． 6 34． 1 ± 1． 7 8． 7 ± 0． 7 13． 0 ± 0． 3 26． 2 ± 0． 1
60 16． 3 ± 0． 1 24． 1 ± 0． 3 24． 7 ± 0． 5 26． 0 ± 0． 4 33． 5 ± 0． 1 43． 7 ± 0． 4 14． 3 ± 0． 1 20． 5 ± 0． 3 42． 0 ± 1． 0
90 18． 8 ± 0． 3 32． 4 ± 0． 2 34． 7 ± 0． 3 34． 3 ± 0． 2 40． 4 ± 0． 8 52． 3 ± 0． 7 19． 4 ± 0． 1 30． 0 ± 1． 4 52． 5 ± 0． 2
120 28． 2 ± 0． 6 38． 4 ± 0． 6 46． 8 ± 0． 3 39． 6 ± 0． 3 45． 4 ± 0． 7 57． 1 ± 0． 2 28． 9 ± 1． 0 43． 8 ± 0． 1 56． 1 ± 0． 4
150 37． 5 ± 0． 5 43． 7 ± 0． 3 53． 1 ± 0． 3 44． 9 ± 0． 6 52． 7 ± 0． 9 62． 8 ± 0． 2 36． 8 ± 0． 8 51． 6 ± 0． 3 56． 9 ± 0． 3
2． 3 苦龙胆脂甙对肝癌细胞凋亡的影响 浓度为 110 μg /ml
的苦龙胆脂甙分别作用于 LO2、HepG2 和 SMMC-7721 细胞 48 h
后，用流式细胞仪检测三者的凋亡率，结果示:LO2 的凋亡率为
29． 4% ± 0． 8%，HepG2 的凋亡率为 49． 0% ± 0． 4%，SMMC-7721
的凋亡率为 45． 5% ± 1． 5%，苦龙胆脂甙能促进肝癌细胞的凋
亡，且效果明显强于正常肝细胞(图 2)。
图 2 浓度为 110 μg /ml苦龙胆脂甙作用细胞 48 h后凋亡情况
a:苦龙胆脂甙对 LO2 细胞的凋亡;b:苦龙胆脂甙对 HepG2 细胞的凋亡，c:苦龙胆脂甙对 SMMC-7721 细胞的凋亡
2． 4 苦龙胆脂甙对肝癌细胞迁移能力的影响 苦龙胆脂甙 (110 μg /ml)作用于肝癌细胞(HepG2 和 SMMC-7721)48 h 后，
55中药药理与临床 2016;32(3)
在用 transwell小室检测肝癌细胞的迁移能力，结果示 HepG2(对
照组:115． 0 ± 4． 2;正常组:20． 4 ± 1． 1;n = 3，P ＜ 0． 05)和
SMMC-7721(对照组:211． 0 ± 2． 0;正常组:32． 0 ± 0． 7;n = 3，P ＜
0． 05)实验组肝癌细胞迁移的数量均明显少于正常组，说明苦
龙胆脂甙能够抑制肝癌细胞的恶性变行为，见图 3。
图 3 浓度为 110 μg /ml苦龙胆脂甙作用 48 h后对肝癌细胞系迁移能力的作用
2． 5 苦龙胆脂甙对肝癌细胞凋亡相关信号通路的影响 苦龙
胆脂甙(110 μg /ml)作用于 HepG2 细胞，检测凋亡相关信号通
路的关键分子的蛋白和基因表达，结果发现:实验组 p53 的 mＲ-
NA水平和蛋白水平明显较对照组升高，实验组 hTEＲT、Akt、
NF-κB P65 的 mＲNA水平和蛋白水平明显较对照组减少，而两
组 p38 的 mＲNA 水平和蛋白水平均无明显变化(图 4，表 3)。
在 SMMC-7721 细胞中同样观察到相似的结果(图 3，表 4)。因
此，说明苦龙胆脂甙可以通过 p53 等细胞凋亡相关信号通路促
进肝癌细胞的凋亡，与 p38 途径无关。
图 4 浓度为 110 μg /ml 苦龙胆脂甙作用肝癌细胞 48 h 后对细胞内凋
亡信号通路的影响
HepG2 和 SMMC-7721 细胞的 p53 的蛋白表达明显增高，hTEＲT、Akt 和
NF-κB P65 的蛋白表达明显下降，p38 无明显变化
表 3 苦龙胆脂甙对 HepG2 细胞内凋亡信号通路的影响(珋x ± s，n = 3)
目的
分子
mＲNA
PBS组
苦龙胆脂甙组
(110 μg /ml)
蛋白
PBS组
苦龙胆脂甙组
(110 μg /ml)
p53 1． 0 ± 0． 0 1． 4 ± 0． 0* 1． 0 ± 0． 1 1． 3 ± 0． 1*
hTEＲT 1． 0 ± 0． 0 0． 5 ± 0． 0* 1． 0 ± 0． 0 0． 4 ± 0． 1*
Akt 1． 0 ± 0． 0 0． 6 ± 0． 0* 1． 0 ± 0． 0 0． 8 ± 0． 1*
NF-κb P65 1． 0 ± 0． 0 0． 7 ± 0． 0* 1． 0 ± 0． 1 0． 7 ± 0． 2*
p38 1． 0 ± 0． 0 1． 0 ± 0． 0* 1． 0 ± 0． 0 1． 1 ± 0． 1*
苦龙胆脂甙组与 PBS组比较 * P ＜0． 05(下同)
表 4 苦龙胆脂甙对 SMMC-7721 细胞内凋亡信号通路的影响(珋x ±
s，n = 3)
目的
分子
mＲNA
PBS组
苦龙胆脂甙组
(110 μg /ml)
蛋白
PBS组
苦龙胆脂甙组
(110 μg /ml)
p53 1． 0 ± 0． 0 1． 6 ± 0． 1* 1． 0 ± 0． 0 1． 8 ± 0． 1*
hTEＲT 1． 0 ± 0． 0 0． 4 ± 0． 1* 1． 0 ± 0． 1 0． 5 ± 0． 1*
Akt 1． 0 ± 0． 0 0． 5 ± 0． 2* 1． 0 ± 0． 0 0． 6 ± 0． 1*
NF-κb P65 1． 0 ± 0． 0 0． 5 ± 0． 1* 1． 0 ± 0． 1 0． 6 ± 0． 2*
p38 1． 0 ± 0． 0 1． 1 ± 0． 0* 1． 0 ± 0． 0 0． 9 ± 0． 1*
3 讨论
在本次实验中，经过提取方法改良后的方法，我们从川东獐
牙菜获取较高纯度的苦龙胆脂甙，并且证明苦龙胆脂甙对肝癌
细胞增殖的抑制作用明显大于正常肝细胞。我们还证实了苦龙
胆脂甙通过提高 p53，以及降低 hTEＲT、Akt、NF-κB P65 的表达
促进肝癌细胞凋亡，而且抑制肝癌细胞的恶性行为。
苦龙胆脂甙是獐牙菜主要的活性成分，被报道具有抗炎、保
肝、镇痛和抗肿瘤等作用 ［5］。国内文献大多数报道苦龙胆脂甙
抑制肿瘤生长等现象，未对其机制进行探讨 ［6］。国外 Saha 等
人首次报道苦龙胆脂甙通过下调 Cox-II的表达抑制小鼠皮肤癌
的恶性行为以及激活 caspase-3 促进皮肤癌的凋亡 ［7，8］。而 Pal
等人首次报道苦龙胆脂甙能够通过上调 Bax-Bcl2 比例以及激
活 caspase-3 和聚腺苷二磷酸核糖聚合酶裂解体促进大鼠原位
肝癌的凋亡，而且苦龙胆脂甙的预防肝癌形成的作用显著明显
于治疗作用［4］。最近 Sur等人报道，苦龙胆脂甙能够减少肝癌
病灶内 CD44(+)肝癌肿瘤干细胞的数量，并且抑制 Wnt 通路
中关键分子连环蛋白和胞外分泌型拮抗因子分泌型卷曲相关
蛋白 1 /2 的表达 ［9］。他们还发现苦龙胆脂甙通过抑制神经胶
质瘤相关癌基因同族体 1，sonic hedgehog配体和上调 PTCH1 的
表达来调控肝癌肿瘤干细胞内 hedgehog 通路，促进肝癌肝细胞
的凋亡 ［9］。这些文献都报道苦龙胆脂甙通过促进凋亡来抑制
肝癌细胞的增殖和恶性变，但是它们均是在大鼠体内验证的结
果，并且没有验证苦龙胆脂甙是否对正常肝细胞的增殖也有抑
制作用。我们实验证实，苦龙胆脂甙在体外对正常肝细胞的抑
制作用明显小于肝癌细胞，凋亡率检测也得到了相似的结论。
这可能与苦龙胆脂甙具有保肝、抗炎作用有关，但是机制还需要
进一步的证明。
65 中药药理与临床 2016;32(3)
凋亡是细胞维持自我更新的保守机制之一，这样许多抗癌
药物抑制肿瘤细胞增殖的主要机制之一 ［10］。我们的实验验证
了苦龙胆脂甙可能是通过提高 p53 以及下调 hTEＲT、Akt和 NF-
κB P65 的表达来诱导肝癌细胞的凋亡。先前报道证实，在 p53
缺陷小鼠体内更易被诱导成癌，而 p53 的激活抑制肿瘤的生长，
同时观察到 hTEＲT、Akt和 NF-κB P65 的表达下降 ［11］。p53 与
hTEＲT、Akt和 NF-κB P65 是负性相关作用，我们的实验也同样
观察到这种现象。p38 也被报道具有调节肝癌细胞凋亡的作用
［12］，但是我们实验并未观察到 p38 的变化，说明苦龙胆脂甙并
未通过 p38 通路调节肝癌细胞的凋亡。但是，Pal等人的研究却
认为 p53 通路在预防肝癌形成的作用仍然比较模糊 ［4］。同时，
我们的实验缺乏体内实验的验证，以及需要进一步验证苦龙胆
脂甙通过 p53 及 hTEＲT、Akt 和 NF-κB P65 通路具体下游分子
的变化以及肝癌细胞恶性变的机制。
本实验在体外证实苦龙胆脂甙通过提高 p53 以及下调
hTEＲT、Akt和 NF-κB P65 的表达来诱导肝癌细胞的凋亡，同时
对肝细胞的较小的杀伤作用，并且苦龙胆脂甙能抑制肝癌的恶
性行为，这些实验结果为临床辅助治疗肝癌提供新的思路。
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The effect of amarogentin on the proliferation，apoptosis and invasion of human liver cancer cells
Huang Chun，Li Ｒunqin
(Division of Basic Medical Science of Chongqing Three Gorges Medical College，Wanzhou，Chonqing 404120)
Objective:To investigate the effect of amarogentin on the proliferation，apoptosis and invasion of human liver cancer cells in vitro．
Methods:LO2，HepG2 and SMMC-7721 cells were treated with amarogentin，and the changes in cell proliferation，apoptosis and migration
were tested using cell counting kit 8 (CCK-8)assay，flow cytometry and transwell assay，respectively． The messenger ＲNA (mＲNA)and
protein expressions of p53，AKT，nuclear factor κ b (NF-κB)，human telomerase reverse transcriptase (hTEＲT)and p38 in the cells were
analyzed by reverse transcription-polymerase chain reaction (ＲT-PCＲ)and western blotting (WB) ，respectively． Ｒesults:amarogentin more
effectively inhibited the proliferation of liver cancer cells (HepG2 and SMMC-7721)with a dose-dependent manner and induced obvious cell
apoptosis than normal liver cells (LO2)． Treatment with 110 μg /ml of amarogentin also significantly inhibited the invasion of cancer cells．
The results of ＲT-PCＲ and WB showed that amarogentin up-regulated the expression of p53 and decreased the expression of p53，AKT，NF-
κB and hTEＲT in both liver cancer cells． However，p38 showed no relationship with the treatment of amarogentin． Conclusion:amarogentin
can inhibit the proliferation and invasion of liver cancer cells，and promote the apoptosis in liver cancer cells．
Key words amarogentin(苦龙胆脂甙);hepatocellular carcinoma;proliferation;apoptosis;invasion
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