全 文 ：植物检疫 Z HIW U I JA NY I 19 9 1 , 5 (3 )
引进台湾草毒苗的检疫技术探讨
谢汉慈 倪礼传 魏 超 李增华 倪兴武
(厦门动植物检疫所 )
前言
198 8 年 7 月 , 厦门丰盛公司从台湾引
进 15 万株根部带土的草葛苗 。 为防止检疫
对象和危险性病虫害从台湾传人 , 了解台
湾草幕疫情 , 我所对该批种苗实施严格的
检疫 、 洗土和药剂处理 , 采用多种检验方
法 , 对苗木及携带的土壤病原微生物进行
了 13 次 , 67 个处理的分离 、 培养 , 对检
验方法进行比较试验 , 共鉴定出真菌 40 个
属种 , 细菌 1 种 , 线虫 8 个属种 , 蜡类 2
种 。 经过一年的隔离种植观察 , 发现白粉
病 、 果腐病发生较为严重 , 基本排除了种
苗带有检疫性和危险性病虫害的可能性 。
1 989 年 6 月底 , 我所与内检部门及有关专
家共同进行检疫鉴定后 , 同意放行 , 扩大
种植 。
1 材料与方法
种苗人境时按常规方法取样 , 将草毒
苗及其携带的土壤样品分为两份 , 一份供
入境时初检 , 另一份置冰箱内 5一 8℃保
存 , 供重复检验 。 在隔离种植期间 , 取不
同生育期植株异常 、 生 长 不 良的苗 、 病
叶 、 病果及根部携带的土壤样品 , 连同在
种 植前取假植地 和种植 地两处 的土壤样
品 , 带回室内检验 , 比较本地与台湾病原
微生物的种类 。
L l 保湿法
用常规保湿法和加营养液保湿法 。 把
根切成 1 0一 12m m 小段 (下同 ) , 洗去表
面土壤或将病果切成 10 x 20 x s m m 小块
(下同 ) , 置于凹玻片上 (营养保湿法再加
一 168一
l一 2 滴 P et ir 氏营养液于病组织表面 ) , 放
人无菌培养皿中 , 用无菌水棉球保湿 , 置
18 一 20℃生化培养箱 , 加 SW 日光灯照射
培养 3 天后 , 开始观察是否有疫霉抱子囊
形成 。 营养保湿培养侧重分离根部和果实
的低等真菌 , 常规保湿培养侧重分离叶斑
病菌 。
1
.
2 P e tr i 氏营养液诱集法
取 P et ir 氏营养液 30 m l 于灭菌培养皿
内 , 分别加人草毒根段 10 一 巧 块 、 土壤
109 及混有根 、 茎 、 叶的土壤 10 9 , 设 3 个
处理 。 然后分别加人以下 8 个组合的诱集
物 : 稻叶 、 稗草叶 、 稻叶+ 指甲、 芝麻+ 头
发 、 芝麻+ 赛璐粉 、 稻叶+ 死实蝇 、 死实蝇
+ 赛璐粉 、 死实蝇 + 小麦种子 。 每个组合 3
个重复 , 计 24 个组合 。 置于 18 一 20 ℃ ,
SW 日光灯每 12 小时光暗交替的生化培养
箱培养 , 3 天后 开 始观察 , 发现可 疑疫
霉 , 连同诱集物移至疫霉选择性培养基或
马铃薯蔗糖琼脂培养基 ( P SA ) 平板上继
续培养 , 3一 5 天后开始观察。 所有诱集物
都要煮沸消毒 , 稻叶和稗草叶剪成 10 m m
长 , 赛璐纷剪成 3一 5 x 10m m 。
13 直接诱集法
取无菌水 30 m l 于灭菌培养皿中 , 加
人供试材料和诱集物组合 , 培养方法同方
法 2 。 方法 2 和 3 侧重于分离低等真菌 。
1
.
4 土壤真菌群分离培养法
取 59 风干土加人 95 m l 无菌水充分振
荡 5 分钟 , 静置 。 取上清液 l m l , 稀释成
10 倍和 or o 倍液 , 取 2 个稀释度的土壤液
各 lm l , 分别涂于 M ar it n 氏培养基平板表
植物检渡 Z H I W UJ I AN Y I 19 9 1, 5 (3 )
面 , 每个处理设 3 个重复 , 置于 25 一 28 ℃
培养 3一 4 天 , 挑取尽可能多的单菌落转至
P D A 平板上 , 在 25 一 28 ℃光暗交替纯化
培养 or 一 巧 天后鉴定 , 其余菌落如产袍较
好 , 也可 以鉴定 , 第 7一 10 天后再进行第
二次鉴定 。
1
.
5 病毒检测诬
选取带花叶病症状的叶片 , 用番茄环
斑 病 毒 (T m R SV ) 、 番 茄 黑 环 病 毒
( T m B R V )
、 烟叶环斑病毒 ( T R SV )和南芥
菜花叶病毒 (A r M V) 抗血清诱捕法和直沾
法进行电镜观察 , 重复两次 。
L 6 线虫分离
用贝尔曼漏斗法和浅盘法分离草每的
根 、 芽和土壤中的线虫 。
2 结果
检验结果 (表略 ) 显示 : 草葛苗人境
检出真菌 14 种 , 线虫 4 种 . 而隔离种植从
植株部位分离到的真菌有 24 种 , 线虫 1
种 , 其中有 10 种真菌和进 口时相同 ; 隔离
种植前从土壤分离到 6 种线虫中有 3 种与
人境时相同 , 其种类比人境时分离的多 。
从进 口种苗携带的土壤分离到 12 种真
菌 , 从隔离种植地分离到 19 种真菌 , 其中
有 6 种与人境土壤相同。 高浓度土液所含
真菌种类多于低浓度土液 。 定植后施过杀
菌剂 , 土壤真菌比定植前减少 。
检验结果表明 : 台湾原产地的种苗及
其携带的土壤 , 其病原物种类与本地区基
本相同 , 并且未发现有检疫性和危险性病
原物 。
3 讨论
.3 1 应用多种方法比较检验结果 , 我们认
为 , 对大批量进 口种苗 , 应根据检疫审批
要求 , 采用多种具有针对性的方法进行检
验 , 以提高检疫的准确性 。 分离低等真菌
用 eP tr i 氏营养液和诱集分离法检出率高
于培养基分离法 。 用 P et ir 氏营养液保湿
法效果优子常规保湿法 。 单独用稗草叶作
诱集物诱集低等真菌的效果比本试验其他
组合的诱集物好 。 用稗叶诱集到的寄生疫
霉抱子囊为 5一 12 5 个 / 1 小块 , 而用其他
诱集物仅为 O一 4 个 / I 小块 。 分离土壤真
菌群宜用 M盯 it n 氏培养基 。 直接用高浓
度的土液 , 就可以分离到多种真菌 , 除少
数需要纯化培养外 , 大多数都可以直接鉴
定 。
.3 2 对于大批量的进 口种苗 , 为了仔细检
验 , 避免遗漏 , 宜取两份样品 , 第一份作
人境时初检 , 第二份暂时保存供重复检验
用 。
.3 3 这批种苗是在 7 月份 25 一 3 ℃高温
条件下 , 用 1℃的冷藏集装箱运输 。 为处
理带土率高达 57 . 3%的草荀苗 , 我们安排
在夜间温度较低时突击洗土处理 . 流土水
直接流人海中 , 次晨仍用低温冷藏车运往
假植地种植 , 以保证种苗成活率 。
.3 4 该批种苗数量大 , 带土率高实属罕
见 , 这种引种而又类似调种的方式 , 给人
境检疫及隔离种植期间的检验带来极大困
难 , 把如此 巨大数量的种苗放在大田隔离
种植是无法达到隔离要求的 , 因而潜伏着
很大的危险性 。 病毒检验虽然用 4 种病毒
抗血清免疫电镜观察和直沾法电镜观察未
发现这 4 种病毒粒体 , 但由于草毒可能传
带的病毒种类较复杂 , 并且 田间观察发现
有花叶症状 , 因此仍应加强对该批种苗的
跟踪调查 。 建议审批部门应控制引种数
里 。
.3 5 该批种苗人境时经 口岸所检疫后转由
内检部门作隔离种植观察 , 外检部门还多
次到隔离种植地进行复检 , 隔离期满再由
内外检共同进行检疫鉴定 , 证实不带检疫
①病毒检测工作得到农业部植物检疫实验所由雪娟、 胡伟贞的协助 , 谨此致谢。
一 169一
飞
植物检疫 Z H IW UJ N I A Y I 19 9 1, 5 ( 3 )
对 “ 葡萄保加利亚潜隐病毒 ”毒株
的检验技术研究
孟保中
(河北昌黎果树所 )
沈淑琳
(农业部植物检疫实验所 )
摘 要 、 为了研究葡萄病毒的检验技术 , 进行了匈引 “ 葡萄保加利亚潜隐病毒” 毒株的
寄主范围 、 提纯和 d s R N A 的研究 。 人工接种 2 8 种或品种的植物 , 可 以局部侵染 1 4 种
或品种的植物 , 其中番杏是新报道的寄主 。 病毒繁殖在昆诺阿攀上 , 用磷酸缓冲液抽提 ,
尸E G 6 0 0 0 沉淀 , 超离心得粗提纯液为免疫抗原 , 提纯得率为 4 5 m g / 1 0 0 0 9 病叶 , 经琼
脂糖凝胶电泳 , 检测昆诺阿墓病叶中有 2 条 d s R N A 的带谱 。
1 引 言
葡萄保加利亚潜隐病毒 (C B L V ) . 是
M a r t e l il 等 ( 19 76 , 197 7 ) 首先报道 , 并
研究了它的特性 。 由于侵染欧洲葡萄的品
种或杂交种 , 多数不表现症状 , 因而得
名 。 G B L V 分布范围不广 , 现仅在保加利
亚 、 美国纽约州 、 匈牙利 、 南斯拉夫和葡
萄牙有报道 。 为了研究 G B L V 的检测方
法 , 进行了与制定检测技术有关特性的研
究 , 以下报道研究的初步结果 。
品部病毒研究中心 。
.2 2 寄主范围测定
供试植物包括黎科 、 豆科 、 茄科等 28
种或品种 。 豆科于单叶期 , 其它 5一 8 叶期
接种 。
.2 3 提纯
病毒繁殖在昆诺阿黎上 , 用磷酸钾缓
冲液抽提 , 经 P E G 沉淀 , 差速离心 。
2.4
`
d s R N A检测
按 D o d d s 等 ( 19 84 ) 的方法 。
2 材料和方法
.2 1 毒株
19 8 7 年部植检所引自匈牙利农业与食
3 结 果
.3 1 寄主范围
接种侵染昆诺阿黎 、 览色黎 , 甜菜品
望 二望 二望 二望 二里 二里 二望 二丝 . 望 二望 二望 望
对象和应检病虫 , 才同意放行扩大种植 。 4 坍麦】奥尔森 · 兰格抵等真菌 .农业部科技司 , 动植
这样做有利于加强内外检配合 , 共同把好 物检疫总所 , 西北农学院 , 19 83
检疫关 。 5 晒德lK · H 唐姆茨 ,嗬兰Wl · 盖姆斯 . 农业土壤真
参考文献 菌 · 科学出版社 , 19 79
1 载芳斓 .中国真菌总汇 .科学出版社 , 1979 6 中国科学院微生物研究所 . 常见和常用真菌 . 科学出
2 魏景超真菌鉴定手册上海科学技术出版社 , 19 7 9 版社 , 19 7 3
3 中国科学院土壤研究所微生物室 . 土壤微生物研究法 . 7 毕志树 , 李进 . 植物线虫学 . 农业出版社 , 19 63
科学出版社 , 19 8 5
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