全 文 ：北方园艺 2007(6):223 ·生物技术 ·
第一作者简介:关丽霞(1978-), 女, 辽宁抚顺人 , 本科, 助理实验
师,多年来一直从事花卉 、树木的组织培养研究工作 , E-mail:
glx0126@163.com。
收稿日期:2007-01-29
青苹果竹芋的组培快繁技术
关丽霞 , 韩 德伟 , 王振龙 , 杨 　智
(辽宁农业职业技术学院,营口 115009)
中图分类号:S 603.6　文献标识码:B　文章编号:1001-0009(2007)06-0223-01
　　青苹果竹芋(Calathca rotundi f la CV.Fasciata)又称
圆叶竹芋 ,属于竹芋科肖竹芋属多年生常绿草本。青苹
果竹芋是近年来从国外引进的室内高档观叶植物品种 ,
曾在 2005年1月广州花博园举行的“中国首届盆栽花卉
交易会”上 ,以其叶片圆润 ,质感好 ,观赏价值高 ,适宜于
室内盆栽观赏等特点 ,一举获得“金花奖” ,令人十分
注目。
青苹果竹芋自然繁殖率低 ,常规人工繁殖用分株法
速度较慢且数量有限 ,因而显得更加珍贵。通过组织培
养为青苹果竹芋快速繁殖及大规模生产提供了一条有
效的途径。有关青苹果竹芋的组织培养国内未见报道 ,
现将青苹果竹芋的组培快繁技术介绍如下。
1　青苹果竹芋材料的选取与灭菌
6月初从鲅鱼圈素质教育基地连栋温室内选取当年
生 、生长旺盛 、无病虫害的盆栽青苹果竹芋。将盆栽青
苹果竹芋的根茎处基质扒开 ,露出根茎以上部分 ,放在
30℃环境条件下 ,控水 10d。利用锋利的剪刀剥去外部
2cm 以上的大叶片 ,在低浓度洗衣粉水中泡0.5h ,流水
冲洗 2h ,再在无菌条件下 ,用 70%酒精浸泡30s ,0.1%升
汞加2滴吐温-20浸泡 12min ,最后用无菌水冲洗 5次 ,
剥去顶芽外层叶片 ,剪切成0.5～ 1cm大小作外植体备用。
2　青苹果竹芋的培养基及培养条件
培养基:基本培养基为 MS ,添加蔗糖 30 g/L 、琼脂
7 g/L ,pH5.6 ～ 5.8。芽诱导培养基(1):6-BA 2mg/ L
(单位下同)+NAA0.5;增殖培养基(2):6-BA1.0+NAA
0.1;壮苗培养基(3):6-BA0.2+IBA 0.1;生根培养基
(4):1/2MS+IBA0.3+NAA 0.2。培养条件:光照度
1 500 ～ 2 000Lx ,光照 14h/d ,培养温度23℃～ 27℃。
青苹果竹芋的增殖苗 青苹果竹芋的根 青苹果竹芋的生根苗 青苹果竹芋移栽成活苗
3　青苹果竹芋的不定芽诱导、继代增殖、壮苗及生根
在超净工作台上 ,将消毒好的外植体接种于培养基
(1)中 ,2周后顶芽开始萌动。继续培养 ,顶芽基部膨大 ,
逐渐分化出 2 ～ 3个不定芽。待不定芽长至 1.5 ～ 2cm
高时 ,切取其成单芽接种在增殖培养基(2)上。转接后
小芽生长很快 ,15d左右形成芽丛。不定芽在继代培养
基上增殖迅速 , 30d即可继代一次。增殖系数达 3 ～ 5
倍。培养基(2)中虽然可获得大量的不定芽 ,但芽一般
较矮小 ,因此将不定芽分割成单芽后于壮苗培养基(3)
中进行壮苗。芽可伸长至 4～ 5cm ,成无根试管苗。将培
养基(3)中的无根试管苗转接到生根培养基(4)中培养 ,
10d后苗基部长出2 ～ 3条主根 ,20d左右主根上长出许
多须根 ,成为完整植株。
4　练苗及移栽
选择苗高 4～ 5cm、根白 、根长 1cm以上的试管生根
苗进行驯化移栽。试管苗移栽前先移在温室内放置3 ～
5d ,然后开瓶洗去根部培养基 ,移栽至灭菌处理过的草
炭 、蛭石和珍珠岩(2∶1∶1)的混合基质中。移栽前期 ,
将其置于拱棚内 ,将空气湿度保持在 80%～ 90%间 ,遮
光率为 50%～ 60%,环境温度控制在22℃～ 26℃间。待
小苗在基质中长出白色新根 ,新叶展开 ,即可移入花盘中。
通过上述组培快繁程序一年内可繁殖大量青苹果竹芋苗。
以上是青苹果竹芋几个关键时期的图片 ,以供参考。
223
·生物技术· 北方园艺 2007(6):224～ 226
第一作者简介:李凤梅(1973-),女,博士, 讲师 ,从事分子生物学研
究, E-mail:lifengmei-37@163.com。
收稿日期:2007-02-27
丙肝病毒 E2基因植物表达载体的构建及对烟草的转化
李 凤梅1 , 张 　弢2 , 任大 明3
(1.青岛科技大学化工学院 ,266042;2.莱阳农学院生命科学学院 ,青岛 266109;3.复旦大学遗传学研究所遗传工程国家重点实验室 ,上海 200433)
　　摘　要:丙型肝炎病毒(HCV)是导致全世界 1.8亿患者急慢性肝炎的主要原因 ,目前还没有
可利用的疫苗和有效的治疗措施。人的 HCV包膜蛋白是 HCV原型疫苗的吸引人的部分 ,目前
在遗传工程领域的发展允许利用植物作为工厂生产外源蛋白。在这一研究中 ,构建了丙型肝炎
病毒 E2基因的植物表达载体 ,通过农杆菌介导转化烟草。经 PCR和 Southern blot检测 ,目的基
因已整合到转基因植株的基因组中。为抗 HCV植物疫苗的研究奠定的基础。
关键词:E2基因;转基因;烟草
中图分类号:R 373.2;S 572　文献标识码:A　文章编号:1001-0009(2007)06-0224-03
　　丙型肝炎病毒(HCV)能引起人类急 、慢性肝炎 、肝
硬化及肝细胞癌 ,目前尚无有效的治疗方法和疫苗 [ 1, 2] 。
国内外学者研究了 HCV各基因的结构与功能 ,核心蛋
白(C)和包膜蛋白 E2与机体保护性免疫关系最为密切 ,
是研制 HCV疫苗的优先考虑的靶抗原[ 3] 。在 HCV基
因组中 ,包膜蛋白E2区基因变异最大。E2蛋白不仅在
HCV吸附宿主细胞过程中发挥重要作用 ,而且还参与
了信号转导过程。
随着生物技术的发展 ,已经研究出多种疫苗来预防
病毒病。其中转基因植物疫苗是近年来发展起来的一
种新型疫苗。1992年 Mason首先提出了转基因植物疫
苗的定义[ 4] ,即利用分子生物学技术把外源基因导入到
植物细胞中 ,在植物中能够大量表达外源基因的一种生
物技术。该研究构建了 HCVe2基因的植物表达载体 ,
农杆菌介导转化烟草 ,通过分子检测表明 E2基因已在
烟草中表达 ,为研制HCV植物疫苗奠定了基础。
1　材料与方法
1.1　植物材料
受体植物烟草(Nicotianatabacum L.)由上海复旦
大学沈大棱实验室提供。
1.2　菌株 、质粒及试剂
植物双元载体 pBI121 、pCAMBIA2300由上海交通
大学赵凌侠老师提供研究用 ,含有 E2 基因的质粒 T-
e1e2 与 根 癌农 杆 菌(Agrobacteriumtume fuciens)
EHA105菌株、大肠杆菌(E.col i)DH5α菌株由本课题
组提供 ,pGEM-T 载体购自 Promega 公司。
限制性内切酶购自博雅公司 , Taq 酶和 DNA 连接
酶购自 Promega公司 ,DNA 凝胶回收试剂盒购自华舜
生物工程公司 ,PCR引物由上海生物工程公司合成。
1.3　E2基因片段的获得及植物表达载体的构建
以 T-e1e2质粒为模板 ,采用 PCR方法扩增 E2基
因 ,克隆到pGEM-T 载体上 ,经酶切和 PCR鉴定重组质
粒 pGEM-T-e2 ,然后送到上海生物工程公司测序。
将载体 pBI121中含GUS 基因的植物表达盒插入
到植物双元表达载体 pCAMBIA2300的多克隆位点中 ,
即 EcoRⅠ、HindⅢ酶切位点之间得到中间载体 pCAM-
BIA2300-G 。用BamHⅠ、SacⅠ双酶切 pGEM-T-e2 ,获得的
E2基因片段与经过同样酶消化具有相同的粘性末端
pCAMBIA2300-G载体连接 ,得到 p35S-e2植物表达载体。
1.4　E2基因植物表达载体对烟草的转化及转基因烟草
的检测
对烟草(Nicotianatabacum L.)的转化采用叶盘
法[ 5] 。从烟草无菌苗上选取幼嫩叶片 ,切成 0.5cm×
0.5cm小片 ,在含有质粒 p35S-e2的农杆菌菌液中浸泡
5min左右 ,用无菌滤纸吸去多余菌液 ,置于 MS 基本培
养基上 ,附加 IAA 1mg/L 、Zt 1mg/L 、卡那霉素50mg/L、
羧卞青霉素500mg/L 的选择培养基上进行筛选培养 ,获
得抗性植株。
抗性植株进行 PCR 扩增检测(PCR反应程序为
94℃预变性 10min;94℃变性 30 s、58℃复性 45 s、72℃延
伸 45 S ,35个循环;72℃后延伸10min)、以地高辛标记的
E2基因片段为探针进行 Southern分析 ,检测外源基因
是否整合到烟草基因组中。
2　结果与分析
2.1　E2基因植物表达载体的构建及其分子鉴定
224
北方园艺 2007(6):224 ～ 226 ·生物技术 ·
HCV E2基因经过序列特异性引物的 PCR扩增 ,
PCR产物克隆至 pGEM-T 载体上 ,得到阳性重组质粒
pGEM-T-e2。提取阳性克隆的质粒经 BamHⅠ、SacⅠ双酶
切鉴定与目的基因的大小一致 ,图 1所示。经测序 ,插
入片段的序列与目的基因的序列一致。
用EcoRⅠ和 HindⅢ双酶切载体 pBI121和 pCAM-
BIA2300 ,胶回收前者的小片段和后者的大片段 ,用连接
酶连接两片段 ,获得重组质粒 pCAMBIA2300-G ,提取阳
性克隆的质粒并用 EcoRⅠ和 HindⅢ双酶切鉴定 ,重组质
粒含有 pBI121载体上的含 GUS 基因的表达盒 ,图 2
所示。
用 BamHⅠ、SacⅠ双酶切质粒 pGEM-T-e2和 pCAM-
BIA2300-G ,胶回收前者的 E2基因片段和后者的大片
段 ,用连接酶连接两片段 ,获得重组质粒 p35S-e2。提取
阳性克隆质粒 ,经BamHⅠ、SacⅠ双酶切鉴定重组质粒构建
正确 ,图3所示。
M:DL2000 Marker;1:PCR
扩增的E2基因片段
图 1　E2 基因的扩增结果
M , DL2000 Marker;1-2:EcoRⅠ、
HindⅢ双酶切CAMBIA2300-G
图2　表达载体 pCAMBIA2300-G的酶切鉴定
M:DL2000 Marker;1-4:BamHⅠ、
SacⅠ双酶切 p35S-e2质粒
图 3　重组质粒 p35S-e2 的酶切鉴定结果
2.2　转基因烟草的检测
提取转基因及野生型烟草基因组总 DNA 进行
PCR检测 ,结果表明 ,第 2 ～ 4泳道出现目的基因谱带
(如图 4)。这初步说明 E2基因已经整合到烟草基因组
DNA 中。转基因烟草基因组 DNA 与野生型 DNA
BamH I 酶切后的Southern杂交结果(如图 5)所示 ,第
2 ,3泳道均出现杂交信号。Southern 分子杂交结果表
明 ,E2基因已经整合到烟草基因组DNA 中。
M:DL 2000 Marker;
1:水为模板的负对照;
2:未转基因植株;
3:阳性对照;
4-7:转基因植株
图 4　转 p35S-e2 烟草再
生植株的 PCR鉴定
M:DL2000 Marker;
1:阳性对照;
2-3:Southern blot阳性株;
4:未转基因植株
图 5 转 E2基因烟草植株的
Southern blot杂交
3　讨论
烟草作为转基因的模式植物 ,具有成熟的遗传转化
再生系统和完整的真核细胞表达系统等特点。利用转
基因烟草生产基因工程疫苗等活性多肽有很多研究报
道。Curtiss等[ 6] 人在 1990年首次报道了在烟草中表达
链球菌(Streptococcus)抗原蛋白 SpaA ,1997年转基因植
物疫苗的第一次临床试验证明了转植物疫苗在抵抗传
染性疾病方面的巨大潜能。1992年 Amtzena [ 7]研究小
组于烟草中表达了乙型肝炎表面抗原(HBsAg),用叶片
提取液免疫小鼠时 ,表现出较强的免疫原性。2006年郭
小玲等[ 8]报道了禽流感病毒 H5N1的 HA基因转化烟
草 ,获得了表达 HA基因的表达植株 ,具有免疫原性 ,另
外还有利用其他植物的生产疫苗的报道 , 1998 年
Amtzen研究小组[ 9]将一种易引起婴幼儿腹泻的大肠杆
菌毒素基因的一段插人马铃薯基因组 ,食用这种马铃薯
的人产生了抗体。Mason等[ 10] 把编码 LT—B的基因转
化马铃薯 ,LT —B在马铃薯的叶片和块茎中得到表达。
McGarvey等[ 11] 在西红柿中表达狂犬病毒表面抗原。
Lamphear等[ 12]在玉米种子中表达出传染性胃肠炎病毒
刺突蛋白(TGEV-s)和 E.coli不耐热肠毒素 B亚单位
(LI-B)作为预防肠毒性大肠杆菌(ETEC)及 TGEV的疫
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·生物技术· 北方园艺 2007(6):224～ 226
苗。Khandelwal等[ 13] 报道用转 RPV H 蛋白基因花生
(Arachis hypogea L.)叶片饲喂牛可诱导产生 H一特异
性抗体。最近有报道将小反刍兽瘟病毒(Pestedes petits
ruminants virus ,PPRV)的抗原蛋白血凝素一神经氨酸
苷酶(HN)基因转入鸽豆(Cajanus cajan(L.)Millsp.)内
表达 ,并测得植物源HN蛋白具有较好的神经氨酸苷酶
活性[ 14] 。
研究通过农杆菌介导的方法将 E2基因转入烟草 ,
探索 E2基因在烟草中表达的可能性 ,最终目的是获得
丙型肝炎病毒的口服植物疫苗 ,通过食用转基因植物的
果实使人们获得对丙型肝炎病毒的免疫力。
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Construction of Plant Expression Vector Containing the E2 gene
of HCV and its Genetic Transformation of Tobacco
LI Feng-mei1 ,ZHANG Tao 2 , REN Da-ming3
(1.College of Chemical Engineering , Qingdao University of Science and Technology Qingdao 266042;2.Department of life science, Laiyang Ag-
ricultural College Laiyang 266109;3.State key laborato ry , Institute of Genetics Fudan University Shanghai 200433)
Abstract:Hepatitis C virus(HCV)is a major cause of acute and chronic hepatitis with over 180 million cases worldwide.
Unfortunately , neither a vaccine nor any ef fective therapy is available.Envelope protein E2 of human HCV is an attrac-
tive component of a prototype HCV vaccine.Recent developments in genetic engineering allow the employment of plants
as factories for foreign protein production In this research , the E2 gene of HCV was const ructed into plant expression
vector , and transformed into tobacco by Agrobacterium tumefaciens EHA105.It was demonst rated that the f ragment of
E2 gene had been integrated into the genome of tobacco by PCR and Southern blotting.We established a basis for study
of plant-based vaccines against HCV.
Keywords:E2 gene;Transgene ;Tobacco
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