全 文 ：Vol. 35 No. 2
Feb. 2015
第 35卷 第 2期
2015年 2月
中 南 林 业 科 技 大 学 学 报
Journal of Central South University of Forestry & Technology
Doi:10.14067/j.cnki.1673-923x.2015.02.003 http: //qks.csuft.edu.cn
收稿日期：2013-11-29
基金项目：广西自然基金项目（2011GXNSFA018095）
作者简介：谭健晖，教授级高工；E-mail：tanjianhui94@126.com
引文格式：谭健晖 ，黄寿先 . 大花序桉离体根培养过程中氧化酶活性分析 [J].中南林业科技大学学报，2015,35(2):12-15.
近 10多年来，桉树因其生长迅速、用途广泛、
经济效益好等在华南地区得到快速发展。在南方
大面积推广的桉树无性系主要以巨桉、尾叶桉及
其它们的杂交种为主。其用途多为纸桨和建筑材，
用途单一，易受市场价格波动的影响。大花序桉
Eucalyptus cloeziana，是桃金娘科 Myrtaceae桉属
Eucalyptus L Her的一个种。大花序桉仅天然分布
于澳大利亚的昆士兰州，故此又名昆士兰桉。分
布于 15°45′ ～ 26°41′N，144°44′ ～ 152°52′E。海
拔 25～ 950 m，年降雨量 520～ 2 400 mm。夏雨
型为主，3～ 4月为干旱季节 [1]。大花序桉木材呈
黄褐色，结构紧密、沉重坚固，是很好的室内装
饰和锯材，适合进行大径材培养 [1]。由于大花序
桉种源少，且开花结实少，更重要的是，大花序
桉与其他桉树一样，属异花虫媒树种，种内易杂
交，实生苗后代分化严重，难以保持优良的遗传
特性，严重制约了大花序桉的推广和利用。因此，
无性繁殖成为大花序桉良种繁育的重要手段。国内
对大花序桉的研究主要涉及大花序桉不同种源 /家
系对比试验 [2-3]、种源材性 [4]和组织培养研究 [5-7]。
大花序桉的组织培养虽有成功报道但研究仍处于
实验室阶段 [5-7]。本试验在大花序桉离体培养研究
的基础上，对其根形态建成的生理学机制进行了
系统研究，研究结果的应用可以有效地避免大花
序桉离体培养的盲目性和随意性，为大花序桉的
良种繁育和规模化推广应用提供技术支持。
大花序桉离体根培养过程中氧化酶活性分析
谭健晖 1，黄寿先 2
(1. 广西林业科学研究院，广西 南宁 530002；2. 广西大学 林学院，广西 南宁 530005 )
摘 要：通过添加外源生长素，研究大花序桉离体根培养过程中的氧化酶的动态变化。结果表明：添加外源
NAA和 IBA，与无激素培养基间达到极显著差异；POD、IAAO和 PPO影响离体根的形成，其中 POD和 IAAO
活性在培养过程中呈下降→升高→下降的变化趋势，PPO的变化趋势与相反，呈升高→下降→升高趋势；3种氧
化酶相互作用，从而维持、提高或降解内源激素含量，使细胞朝着有利于根的方向发展。
关键词：大花序桉；离体根培养；外源生长素；氧化酶活性
中图分类号：S792.39 文献标志码：A 文章编号：1673-923X(2015)02-0012-04
Determination and analysis of oxidase activity
in the course of in-vitro root cultures of Eucalyptus cloeziana
TAN Jian-hui1, HUANG Shou-xian2
(1. Academe of Guangxi Forestry Research, Nanning 530002, Guangxi, China;
2. College of Forestry, Guangxi University, Nanning 530005, Guangxi, China)
Abstract: The dynamic changes of Eucalyptus cloeziana oxidase activity in the process of in-vitro root cultures were investigated
through adding exogenous auxin. The results show that comparing the in-vitro culture roots added exogenous NAA and IBA with the
hormone-free culture roots, the differences between the former two and the latter reached very significant levels; POD, PPO and IAAO
all affected the root system formation, of the three, IAAO and POD activities in the culturing process presented the changing trends
first decreased then increased and finally decreased, PPO showed the opposite trend to be as first increased then decreased and finally
increased; The interactions of three different oxidases maintained, improved or degraded the endogenous hormone contents and let the
cells toward conductive to root development.
Key words: Eucalyptus cloeziana; in-vitro root culture; exogenous auxin; oxidase activity
13第 35卷 中 南 林 业 科 技 大 学 学 报
1 材料与方法
1.1 实验材料
外植体取自广西钦州市 3年生的大花序桉优
良单株，截取半木质化的、腋芽未萌动的萌芽枝条，
保鲜带回，用于无菌初代诱导。根形态建成生理
实验出自第 29代继代苗。
1.2 实验方法
离体根离体培养以 1/3改良MS（大量元素）
+NAA2.0 mg/L+IBA0.5 mg/L为培养基，设无激素
为对照。蔗糖 25 g/L，7.5 g/L琼脂条，调节 pH值
至 5.8，121 ℃，1.1 kg/cm2下灭菌 20 min。培养
温度为 24 ℃，光照时间 12 h/d，光照强度 1 500 lx
左右。暗培养 7 d，弱光照 3 d，每 10 d取样 1次，
取样时将蘸有培养基部分剪除，立即放入 -80 ℃冰
箱保存待测，至第 40天取样结束。
1.3 测定方法
1.3.1 PPO酶活的测定
称取大花序桉试管苗 2.0 g，加 10 mL预冷的
磷酸缓冲溶液，冰浴碾磨成匀浆，转入离心管，
在 4 ℃，10 000 r·min-1离心 20 min，上清液即为
酶液。取酶液 0.2 mL加入 3 mL磷酸缓冲溶液置
水浴中 10 min，再加入邻苯二酚溶液 0.5 mL。混
合后立即转入比色皿在波长 470 nm处进行 OD470
时间扫描。重复 3次，测定结果用 SPSS数据处理
系统进行方差分析和差异显著性检验。
1.3.2 IAAO酶活的测定
称试管苗 0.5 g，分次加入预冷的磷酸缓冲
液（pH值 6.0）5 mL，冰浴研磨，4 000 r/min离
心 20 min，取上清液，即为粗酶液。酶液测定
的反应液为 MnCl2 1 mL、2、4- 二氯酚 1 mL、
IAA(200 μg/mL) 2 mL、酶液 1 mL、磷酸缓冲液
(pH值 6.0)5 mL，对照中的酶液以磷酸缓冲液代
替。25 ℃水浴保温 30 min。30 min后另取 2支试
管，每支加入试剂 B（0.5 mol/LFeCl3+35%过氯酸
V∶ V=1∶ 50）4 mL，分别加入反应液和对照各
2 mL IAA的梯度浓度溶液各 2 mL。于 40 ℃下保
温 30 min，使反应液呈红色。530 nm处测OD值，
分别记为 OD实验、OD对照。计算公式为：
IAAO 氧 化 酶 活 性 (ug·g-1h-1FW)=
1
)(
WtV
VVCC T 实验对照 。 （1）
式（1）中：VT为酶液总体积；V为步骤 2所得反
应液体积；V1为反应所用酶液体积。
1.3.3 POD酶活的测定
称试管苗品 0.2 g，加入少量石英砂和 2 mL预
冷的磷酸缓冲溶液，冰浴碾磨成匀浆，转入离心管，
在 4 ℃，10 000 r·min-1离心 15 min，上清液即为酶
液。PPO酶活性的测定加反应液 3 mL（100 mL，
pH值 6.0的磷酸缓冲液中加入 0.5 mL愈创木酚、
1 mL30%H2O2），然后加入酶提取液 0.05 mL，迅
速混匀倒入比色皿，读取 OD470值，重复 3次。
计算公式为：
过氧化物氧化酶活性 (ΔOD470·g-1·min-1FW)
={[ΔOD470×酶液体积 (mL)]/[反应吸取酶液量
(mL)]}/[样品重 (g)×反应时间 (min)]。
以上 3种酶的测定均重复 3次，异常数据剔除。
1.4 数据处理和分析
分别对 POD活性、PPO活性和 IAAO活性进
行双因素方差分析 (SPSS13.0软件 )。
2 结果与分析
2.1 根离体培养过程中 POD活性变化
大花序桉根离体培养过程中 POD活性变化趋
势大体相同（图 1），两者的 POD活性均以第 0天
最高，不同培养时间的 POD活性差异达显著水平
（表 1）。培养初期处理的 POD活性不断下降，第
20天时降至 45.28 ΔOD470/g·FW·min，为整个培养
阶段的最低点，培养后期活性升高，之后开始下降。
对照中的 POD活性在培养初期直线下降至最低值
58.79 ΔOD470/g·FW·min，培养中后期活性呈不断上
升趋势，最终保持在 70 ΔOD470/·FW·min上下。
从 POD平均活性看，处理的酶活在不同培养时间
中变化较大。说明 POD在大花序桉根的离体培养
过程起调控作用，影响根原基的形成和发育。
表 1 氧化酶类方差分析†
Table 1 Vriance analysis on different oxidases with
different treatments and incubation time
指标
处理 不同培养时间的氧化酶类活性
处理 对照 0 d 10 d 20 d 30 d 40 d
POD 72.2a 68.5b 91.1aA 69.7bB 59.0dD 72.5bB 65.9cC
PPO 69.9aA 43.0bB 52.2bB 47.1cC 63.6aA 56.9bB 62.5aA
IAAO 192.2aA 176.2bB 450.7aA 177.9cC 167.0dD 182.2bB 164.6dD
† 小写不同字母表示在0.05水平差异显著，大写字母表示在0.01水平差
异显著。字母相同表示差异不显著。
谭健晖，等：大花序桉离体根培养过程中氧化酶活性分析14 第 2期
2.2 根离体培养过程中 PPO活性变化
在大花序桉根离体培养过程中对照和处理的
PPO活性变化趋势相反（图 2），不同培养时间的
PPO活性差异达显著水平（表 1）。处理中 PPO
活性呈升高 -升高 -下降 -升高的变化趋势，培养
初期 PPO活性不断升高，在第 20天时到达最高峰
值，之后下降，培养后期酶活继续上升。对照中
PPO活性在培养初期不断降低，第 20天时达到最
低值，培养后期酶活不断升高，第 30天达到最高
峰值，之后下降。均以第 0天最高。从曲线上来看，
培养初期处理的 POD活性不断下降，第 20天时
降至 45.28 △ OD470/g·FW·min，为整个培养阶段
的最低点，培养后期活性升高，之后开始下降。
从酶活值来看，处理中 PPO活性明显大于对照且
在不同培养阶段变化较大，说明 PPO在大花序桉
根的离体培养过程起重要的调控作用，影响根原
基的形成和发育。
均以第 0天最高，不同培养时间的 IAAO活性差
异达显著水平（表 1）。培养初期处理的 IAAO活
性不断下降，第 20天时降至 158.18 μg/g·FW·h，
培养后期活性升高，之后开始下降，第 40天降
至最低点。对照中的 IAAO活性在培养初期直线
下降至最低值 138.99 μg/g·FW·h，培养中后期活
性呈不断上升趋势，最终保持在 170 μg/g·FW·h
上下。从平均活性看，处理的酶活在不同培养时
间中变化较大，说明 IAAO在大花序桉根的离体
培养过程起重要的调控作用，影响根原基的形成
和发育。图 1 根形态建成过程中 POD活性变化
Fig. 1 POD activty changes in the root vitro culture
图 3 根形态建成过程中 IAAO活性变化
Fig. 3 IAAO activty changes in the root vitro culture
图 2 根形态建成过程中 PPO活性变化
Fig. 2 PPO activty changes in the root vitro culture
3 结论与讨论
无性繁殖一直是林木良种繁育的重点研究课
题，对难生根树种而言无性繁殖尤其重要。植物
不定根的发生是一个极其复杂的生理生化过程，
它的诱导、发生和形成与解剖学结构、内源生长
素或其他促根物质、内源抑制物等多种生理反应
相关。而充分认识这些相关因素并明确它们间的
关系对指导不定根的研究意义重大。前期的生根
机制的研究多集中在外源生长素的调控作用，而
生根过程中的内源或外源调节内源等生化反应、
内源激素及氧化酶间的相互关系的研究较少。过
氧化物酶 (POD)、吲哚乙酸氧化酶 (IAAO)和多酚
氧化酶 (PPO)是高等植物体内普遍存在的 3种酶，
与植物不定根的发生及发展密切相关，相关研究
多集中在桉树 [8-11]、四倍体刺槐 [12]、光叶楮 [13]等
树种的扦插生根以及逆境胁迫下的变化 [14]。有研
究指出，IAA的重要生理功能是促进不定根的形
成，IAA含量的变化直接影响不定根的形成和分
化，而 POD的作用产物可能是不定根发生和发展
所必须的辅助因子，促进不定根的形成，即 POD
能氧化 IAA，消除体内过多的内源 IAA，有利于
根原基的诱导 [15]；IAAO是降解 IAA的专一酶，
2.3 根离体培养过程中 IAAO活性变化
大花序桉根离体培养过程中对照和处理的 IAAO
活性变化趋势大体相同（图 3），两者的 IAAO活性
15第 35卷 中 南 林 业 科 技 大 学 学 报
IAAO活性升高，IAA被氧化分解，IAAO活性降
低，IAA处于一种较为稳定而平衡的状态，有利
于发挥 IAA的生理功能 [16]；PPO既能催化酚类物
质和 IAA形成一种生根辅助因子“IAA-酚酸复和
物”，又是呼吸酶的一种 [17]。本研究中应用 1/3
改良MS（大量元素）+NAA2.0 mg/L+IBA0.5mg/L
为培养基，研究外源生长素 NAA和 IBA在根的离
体培养过程中氧化酶的动态变化，实验中 POD、
PPO和 IAAO等氧化酶的活性与对照相比有较大
变化，对根的发育起重要调控作用，其中 POD和
IAAO在根的离体培养过程中的变化一致，它们在
离体培养初期（0～ 20 d）活性下降，有利于保持
体内 IAA的平衡或提高 IAA的含量，从而促进根
原基的形成，在培养中期（20～ 30 d），是根原
基的细胞分裂和增殖过程，此时需要低 IAA维持，
这一时期 POD和 IAAO的活性迅速升高，氧化分
解内源 IAA，以维持内源激素的平衡，利于根原
基的发育，培养后期（30～ 40 d），是根的生长期，
活性直线下降；PPO的变化趋势与 POD和 IAAO
相反，培养前期活性高，中期下降，后期升高，
PPO活性在培养初期持续升高，是否合成了“IAA-
酚酸复和物”，还是促进了呼吸作用，有待进一
步研究。
在大花序桉根的离体培养过程中，POD、
IAAO和 PPO 3种氧化酶影响离体根的形态建成，
其生理作用不是相互独立的，相互联系、相互影响。
在离体根的培养初期、中期和后期段 3个氧化酶
呈现不同的变化，从而直接导致内源激素的变化。
而这些规律在大花序桉整个根的培养阶段都相当
明显。这 3种与生根有关的氧化酶在大花序桉离
体根培养中共同调控内源 IAA的含量，与其它激
素协同作用于大花序桉的形态建成过程，使细胞
朝着有利于根的方向发展。
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[本文编校：文凤鸣 ]