全 文 ：部分箬竹属植物的叶绿体 DNA分析
牟少华 1 ,郄光发 2 ,彭镇华 2＊ ,郭起荣 1　
(1.国际竹藤网络中心 ,国家林业局竹藤科学与技术重点开放实验室 ,北京 100102;2.中国林业科学研究院林业研究所 ,北京 100102)
摘要　[目的 ]研究箬竹属植物和赤族属植物的亲缘关系。 [方法]以箬竹属 13个竹种及其近缘的赤竹属 3个竹种为材料 ,采用PCR方
法扩增叶绿体trnL-trnF间隔区基因片段 ,并对其进行序列分析 ,构建系统树。 [结果]利用已发表的trnL-trnF序列通用引物扩增出长度
为 1 008～ 1 103bp的trnL-trnF片段 ,比较长度为 940bp。cpDNA序列聚类将箬竹属与赤竹属竹种混合聚在一起 ,同源性为 99%以上 ,可
分为 5组。其中 ,髯毛箬竹、广东箬竹、小叶箬竹、华箬竹 、毛鞘箬竹 、矮箬竹、胜利箬竹、箬竹、箬叶竹 、粽巴箬竹 、翠竹和菲白竹 12个竹种
聚为一组;泡箬竹、天目箬竹、阔叶箬竹和美丽箬竹 4个竹种各自成一组。 [结论]竹种间的同源性极高 ,表现为较慢的进化速率 ,提供的
信息位点很少 ,不能很好地解决箬竹属种间的系统学问题。
关键词　箬竹属;叶绿体DNA;序列分析;多样性
中图分类号　S601　　文献标识码　A　　文章编号　0517-6611(2010)23-12374-03
GeneticDiversityofIndocalamusDeterminedbyChloroplastDNASequence
MUShao-huaetal　(SFAKeyLaboratoryofBambooandRatanScienceandTechnology, InternationalCenterforBambooandRattanBei-
jing100102)
Abstract　[ Objective] TheaimwastoresearchaffinitybetweenIndocalamusandSasa.[ Method] Using13samplesofIndocalamusand3sam-
plesofSasaasmaterials, theintergenicregionsoftrnL-trnFgeneinchloroplastwereamplifiedbyPCR, andsequenceanalysisandphyloge-
netictreesconstructionwerecarriedout.[ Result] Usigngtheuniversalprimer, theintergenicregionsoftrnL-trnFwereamplified, thelengths
ofthesegmentsvariedfrom1 008bpto1 103bp, ofwhich940bpwascompared.ThedendrogramoftrnL-trnFsequencesshowedthatIndoca-
lamusandSasawereclusteredtogetherandtheywerehomologousby99%.Althesamplesweredividedintofivegroups, thefirstgroupin-
cluded12sapmplessuchasIndocalamuspedalis, I.pumilus, I.victorialis, I.longiauritus, I.tesselatus, Sasasinica, Sasapygmaea, I.bar-
batus, I.guangdongensis, I.herklotsi, I.HirtivaginatusandS.fortunei.I.decorus, I.lacunosus, I.LatifoliusandI.Migoiwererespec-
tivelydividedintofourgroups.[ Conclusion] Thehighhomologyofallsamplesshowedthelowevolutionspeedandlitleinformationsiteswhich
suggestedthatthephylogenyofIndocalamuscouldnotbewelresolvedbytheintergenicregionoftrnL-trnF.
Keywords　Indocalamus;ChloroplastDNA;Sequenceanalysis;Diversity
基金项目　“十一五 ”科技支撑项目(2006BAD19B0202);国际竹藤网络
中心基本科研业务专项(1632009007);国际竹藤网络中心
基金项目(06/07-C22)。
作者简介　牟少华(1976-),女,山东栖霞人 ,博士 ,助理研究员 ,从事
种质资源和分子生物学方面的研究。 ＊通讯作者。
收稿日期　 2010-05-05
　　箬竹属(IndocalamusNakai)是多年生禾本科竹亚科植
物 ,其叶大 、有特殊清香味 ,植株矮小 、姿态优美 ,是理想的庭
院观赏和园林绿化竹种。同时 ,箬竹叶 、竹笋还具有药用价
值。与其他竹类植物一样 ,箬竹属植物开花周期较长 ,形态
分类主要是依靠营养体的特征 ,而营养体的特征往往会因为
竹子生长环境的影响 ,产生很大的变异幅度 [ 1] ,这给该属植
物的分类和研究利用带来困难。
叶绿体 DNA(chloroplastDNA, cpDNA)属母性遗传 ,相
对于核基因组具有分子量小 、多拷贝和结构简单等特
点 [ 2-4] 。它的保守性和单性遗传的特征使 cpDNA的同源性
分析成为研究植物亲缘关系的一种重要手段。 cpDNA基因
组中的 trn内含子序列是分子系统学研究中使用较为广泛的
分子指标之一 ,序列变异的程度既不保守(与线粒体基因序
列相比),也不太大(与核基因组相比)。trnL(UAA)-trnF
(GAA)基因间非编码区是系统发育研究中最常用的 cpDNA
非编码区 [ 5-8] 。trnL-trnF基因序列区片段长度在不同类群中
会有变化 ,并且由于其不受功能的限制 ,进化速率大于功能
编码区 ,具有较多的插入缺失和高比例的置换突变 ,适用于
解决相关种间甚至种下居群间的进化问题 [ 9] 。
为进一步验证该叶绿体片段是否能为解决箬竹属种间
的系统学问题提供依据 ,笔者选取了叶绿体 trnL-trnF间隔区
基因片段 ,对 13种箬竹属植物和赤族属 3个竹种的叶绿体
基因组进行遗传操作和序列分析 ,以期初步揭示它们的亲缘
关系 ,为该属植物的种质资源保存以及可持续利用提供
参考。
1　材料与方法
1.1　材料　对收集的 13种箬竹及其近缘的赤竹属 3个竹
种(表 1)经过专家鉴定后 ,每个种群随机选取 20株 ,每株选
取 1片幼嫩的完全展开叶 ,取等量的组成混合样作为 1个样
品 ,用于总 DNA的提取。
表 1　竹种来源和编号
Table1　Thesourcesandcodesofbamboospecies
编号
Code
种名
Speciesname
学名
Scientificname
材料来源
Sourcesofmaterials
1 美丽箬竹 Indocalamusdecorus 浙江林科院竹种园　
2 泡箬竹 I.lacunosus 浙江林科院竹种园　
3 阔叶箬竹 I.latifolius 浙江林科院竹种园　
4 天目箬竹 I.migoi 浙江林科院竹种园　
5 矮箬竹 I.pedalis 浙江林科院竹种园　
6 小叶箬竹 I.pumilus 浙江林科院竹种园　
7 胜利箬竹 I.victorialis 浙江林科院竹种园　
8 箬叶竹 I.longiauritus 四川长宁世纪竹园　
9 箬竹 I.tesselatus 四川长宁世纪竹园　
10 华箬竹 Sasasinica 四川长宁世纪竹园　
11 翠竹 Sasapygmaea 南京林业大学竹种园
12 髯毛箬竹 I.barbatus 黄山太平基地资源圃
13 广东箬竹 I.guangdongensis 黄山太平基地资源圃
14 粽巴箬竹 I.herklotsi 黄山太平基地资源圃
15 毛鞘箬竹 I.hirtivaginatus 黄山太平基地资源圃
16 菲白竹 Sasafortunei 黄山太平基地资源圃
责任编辑　马树梅　责任校对　卢瑶安徽农业科学 , JournalofAnhuiAgri.Sci.2010, 38(23):12374-12376
DOI :10.13989/j.cnki.0517-6611.2010.23.235
　　引物 “c”和 “f”由上海博亚生物技术有限公司(BIOA-
SIA)北京分公司合成 ,将引物稀释到 20 pmol/μl;Taq酶购自
TaKaRa生物公司 。PCR扩增和产物纯化试验在国际竹藤网
络中心国家林业局竹藤科学与技术重点开放实验室完成;测
序工作由北京生工生物技术公司完成。
1.2　方法
1.2.1　DNA提取。总 DNA提取采用 CTAB方法 [ 10] 。 DNA
的浓度及质量采用琼脂糖凝胶电泳鉴定 ,最后将符合后续试
验要求的 DNA样品稀释到 50 ～100 ng/μl备用。
1.2.2　DNA片段的扩增。在离心管中加入上述 DNA样品
1.00 μl,引物 “c”和 “f”各 1.00 μl,超纯水 37.75 μl, dNTP
Mixture(2.5 mmol/L)4.00 μl, 10 ×PCRBufer(Mg2+Plus)
5.00 μl, TaqDNApolymerase(5 U/μl)0.25 μl。扩增按照卢
孟柱等 [ 3]的扩增程序在 PCR仪(BiometraTgradient)上进行 ,
扩增产物于 1.0%的琼脂糖凝胶上鉴定大小和估测浓度 。用
Marker来估计其片段的大小和浓度。在 VilBerlourmat紫外
仪上观察 ,照相。
1.2.3　扩增产物纯化。DNA纯化采用 Promega公司的纯化
试剂盒 WinzardPCRPrepsDNAPurificationSystem的 prototal
方法 , -20℃保存。
1.2.4　序列测定。纯化好的 PCR产物送交北京生工生物技
术公司序列测定 ,自动测序仪型号为 ABI3730XL。
1.2.5　序列分析与系统树构建。序列排列采用 ClustalX软
件完成 [ 11] ,排序后适当手工校正 ,删除引物和边缘的部分序
列 ,将双向测定的序列按照正链的方向拼接成完整的序列 ,
整理以待分析 。排好的序列用 DNAMAN软件(Version4.0,
LynnonBiosoft 1994-1998)进行系统发育和同源性分析 。利
用 bootstrap(1 000次重复)[ 12]检验各分支的置信度。
2　结果与分析
2.1　trnL-trnF基因片段的扩增　根据已发表的 trnL-trnF
序列的通用特异引物 ,采用 PCR方法 ,分别从 16个竹样品中
扩增出相应的 trnL-trnF片段 ,长度接近 1 000bp。
2.2　trnL-trnF基因片段的序列变异　序列测定获得 16个
样品 trnL-trnF片段的序列。序列长度为 1 008～ 1 103 bp,比
较长度为 940 bp,相似性为 99.52%。样品间的序列变异主
要表现为碱基缺失 、A与 G或者 A与 C碱基转换等方式 。
2.3　箬竹属植物的系统位置分析　依据上述样品的 cpDNA
序列计算了 16个样品间的遗传距离 ,运用 DNAMAN(Version
4.0)软件进行系统位置分析 ,构建同源关系树(图 1)。
　　从图 1可以看出 ,箬竹属与赤竹属竹种混合聚在一起 ,
同源性为 99%以上 ,可以分为 5组。第 1组包括 12个竹种 ,
分别为髯毛箬竹 、广东箬竹 、小叶箬竹 、华箬竹 、毛鞘箬竹 、矮
箬竹 、胜利箬竹 、箬竹 、箬叶竹 、粽巴箬竹 、翠竹和菲白竹 ,同
源性极高。其他 4组各自包含 1个竹种 ,分别为:泡箬竹 、天
目箬竹 、阔叶箬竹和美丽箬竹。
3　讨论
3.1　箬竹属植物的亲缘关系　竹类植物多数种类开花周期
长 ,花 、果等材料不易获得 ,形态分类主要依靠营养特征 ,竹
类植物成为被子植物中分类混乱的类群之一。而作为温带
木本竹子的箬竹属 ,由于当时并未指定属的模式种 ,造成该
图 1　依据 trnL-trnF核苷酸序列构建的同源关系树
Fig.1　Thehomology-treereconstructedforIndocalamusbased
onthesequenceoftrnL-trnFintergenicregion
属许多种的隶属关系仍混乱不清 ,属内的种数也不一致。已
有的单基于形态学建立的属下分类系统大都是不自然的 ,其
本身的科学性尚需要进一步验证 [ 13] 。
箬竹属植物与赤竹属的菲白竹 、翠竹和华箬竹 3个竹种
营养体形态十分相似 ,通常认为赤竹属是高海拔竹种 ,箬竹
属是低海拔竹种 ,但是 2属的雄蕊数目 、维管束形态不同 [ 14] 。
从构建的同源关系树可以看出 ,箬竹属植物与赤竹属的种类
网结在一起 ,内部分支与传统分类的属的划分不相吻合。聚
类结果显示应将 2属归并 ,不支持现有的形态分类结果。
竹种的同源性极高 ,尤其是第 2组的 12个竹种 ,同源性
均约为 100%,各种间的关系不太明确 ,不便做太多分类处理
上的讨论。若要做进一步的讨论 ,还需要依据形态学和更具
说服力的分子生物学证据。
3.2　叶绿体 DNA基因间序列用于系统位置关系分析　叶
绿体基因组 DNA(cpDNA)trnL-trnF基因间非编码区是系统
发育研究中最常用的 cpDNA非编码区 ,它具有分子量小 、多
拷贝和结构简单等特点 ,这些均有利于对叶绿体基因组进行
遗传操作和分析。由于叶绿体 trnL-trnF基因间隔区为非编
码序列 ,所承受的自然选择压力较小 ,发生的变异被保留的
机会很大。这样的变异程度在进行系统位置分析中能够给
出较好的分辨能力 ,适合于阐明属内水平的关系 ,并为系统
位置分析的准确性提供保证 [ 15] 。卢孟柱等 [ 3]通过间隔区
DNA的分析揭示胡杨的不同地理变种的亲缘关系 ,为建立完
整的胡杨系统发育理论奠定基础;唐谦等 [ 16]通过叶绿体
DNA(cpDNA)的多态性的比较 ,分析了落叶松树种的叶绿体
DNA分化及变异程度 ,并分析其属种间的系统演化关系 ,从
新的角度揭示落叶松属种的系统演化关系。叶绿体 trnL-
trnF间隔区的 DNA在植物中具有稳定性 ,不随季节的改变
而发生变化 ,但它仅是其遗传物质 DNA的一部分 ,因此并不
能解释所有的系统发育问题 [ 17] 。另外 ,针对不同的植物类
群 , trnL-trnF基因片段积累的变异量并不相同。
在竹亚科的分子系统学研究中 ,很难得到明确的分支结
果 [ 18-20] ,从而对系统重建和分类处理造成困难。追究起来 ,
认为最可能的原因就是竹子生命周期长 ,一般都在 5 ～ 30年
以上 ,基因重组的机会较少 ,因此其分子进化速率较其他植
物慢。该研究中也存在这样的问题 ,叶绿体 trnL-trnF基因间
隔区被认为是在被子植物中研究属内关系较好的分子标记 ,
因此笔者曾尝试用该基因来解决本类群的系统位置问题 ,但
是序列比对后发现 ,碱基差异极少 ,表现出较慢的进化速率 ,
1237538卷 23期　　　　　　　　　　　　　　　　　牟少华等　部分箬竹属植物的叶绿体 DNA分析
提供的信息位点较少 ,在构建分子系统树时可靠性降低 。该
种 DNA分析方法提供的分析结果不支持箬竹属和赤竹属 2
属单独存在 ,这与现行的分类结果以及 AFLP分子标记的结
果差别均很大 [ 21] ,从而很难做出肯定的结论。该叶绿体片
段由于进化速率太慢(不同物种间的变异小于 1%),不能提
供必要的系统发育信息 ,尚不能很好地解决箬竹属种间的系
统学问题。
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