全 文 ：沈阳农业大学学报 , 2003-06 , 34(3):225-227
Journal of Shenyang Agricultural University , 2003-06 , 34(3):225-227
收稿日期:2003-07-11
作者简介:洪艳华(1978-), 女 , 沈阳农业大学生物科学技术学院硕士研究生 , 从事植物发育与环境生理研究。
百合脱毒及病毒检测技术研究进展
洪艳华 1 , 殷广峰 2 , 张立军 1
(1沈阳农业大学 生物技术学院 , 辽宁 沈阳 110161 ;2黑龙江省大庆市农业技术推广中心 , 黑龙江 肇源 166500)
摘要:百合是重要的观赏花卉 , 百合的繁殖主要通过无性繁殖方式进行 , 由于病害的侵染 , 常常造成植株体内的病毒积累 , 导
致植株发生病毒病 , 最终严重降低百合植株的经济价值和观赏价值 。因此 , 防止百合感染病毒病的应对策略是采用脱毒培养技
术获得脱毒苗 , 并在各个生产环节进行严格的病毒检测 。作者系统地介绍了常用的脱毒技术———茎尖培养 、珠芽培养 、化学处
理和热处理 , 以及主要病毒检测方法———指示植物法 、电镜技术 、酶联免疫法和分子生物学技术 。
关键词:百合;脱毒;病毒检测
中图分类号:S6441.1;Q939.4 文献标识码:A 文章编号:1000-1700(2003)03-0225-03
Advances of Research on Eradication and Detection of Viruses in Lily
HONG Yan-hua1 , et al.(1 College o f Biological Science and Technology , Shenyang Agricultural University , Shenyang 110161 , China)
Abstract:Lily is an important ornamental flower.Since most of lilies are usually propagated vegetatively , which make viruses accumulate in
plants.Therefore , virus diseases often occur in lily , and greatly decrease the economic and ornamental value of lily.The production of virus-free
plants is an important approach to control virus diseases.The virus-free plants could be obtained through the tissues culture of eradicating
viruses.However , strict virus detection is needed at each stage of production process.This paper systematically presented the basic eradicating
viruses techniques-meristem culture in vitro , bulblet culture , chemotherapy and thermotherapy;and main detecting virus methods -indicator
plants , electron microscope ,enzyme linked immunosobent assay(ELISA), and techniques of molecular biology.
Key words:lily;virus-free;virus detection
1 百合主要病毒病
百合(Lilium spp.)为百合科百合属多年生宿根植物 , 是国际上重要的切花观赏花卉之一[ 1 , 2]。我国百合
除传统药用 、食用和提取香精外 , 其切花观赏价值正日益受到重视 , 栽培面积不断扩大 。在生产上百合主要
靠扦插繁殖和分球繁殖等方式繁殖 , 长期的无性繁殖使病毒在体内积累 , 引发病毒病 , 严重影响果实的产量
和品质以及花和叶等的观赏价值。随着百合栽培面积的不断扩大 , 病毒病的危害越来越严重 。
自 Stewart(1896)描述百合的坏死条纹以来 , 相继报道了百合的病毒病原 14种。其中发生普遍 , 危害严
重的病毒有 5种 , 即百合潜隐病毒(Lily symptomless virus , LSV)、 黄瓜花叶病毒(Cucumber mosaic virus ,
CMV)、 郁金香碎花病毒(Tulip breaking virus , TBV),异名百合斑驳病毒(Lily mottle virus , LMoV)和百合丛簇
病毒(Lily rosette virus , LRV);其他 9种病毒均在栽培地区少量发生 , 对百合构不成普遍危害 [ 4] , 如百合 X
病毒(Lily virus X , LVX)、 百合环斑病毒(Lily ring spot virus , LRSV)、 水仙花病毒(Narcissus mosaic virus ,
NMV)和烟草环斑病毒(Tobacco ring spot virus , TRSV)等。
2 百合脱毒技术
植物病毒主要是通过植物营养体无性繁殖传播的 [5]。无性繁殖方式的优点在于能保持其后代遗传基础的
一致 , 较少发生变异 。然而长期的无性繁殖将会使体内逐渐积累大量病毒致使植物发生病毒病 , 并导致种性
退化 。百合也不例外 , 病毒病经常对百合生产造成严重危害。由于百合的快速繁殖技术也属于无性繁殖 , 所
以阻断病毒从母株向后代的传播 , 获得脱毒苗也是百合毓的关键所在 。开展百合脱毒研究最早是 Phillips
(1962年), 他利用百合茎尖培养脱毒成功以后 , 先后又有许多外国学者利用茎尖脱毒成功 。目前国际上有
几个国家利用这种方法获得百合无病毒苗 , 并在生产上大规模应用 [6]。茎尖脱毒培养的两个关键技术环节是
茎尖的成活率和脱毒率。茎尖培养成活率低 。褐化是降低茎尖培养成活率的首要因素。褐化的发生与许多因
素有关 , 茎尖大小 、 取材季节 、培养方式 、 激素浓度 、基本培养基 、 培养基添加物都对茎尖褐化有影响 , 例
如茎尖越小 , 褐化越严重 , 成活率越低 。在茎尖培养时为抑制褐化的发生 , 需要优化上述各因子 。应用抗氧
○文献综述 LITERATURE SUMMARY
化剂 AC和 Vc也可有效抑制茎尖培养的褐化现象 [7 ,8]。阻断病毒传播获得脱毒苗的基本方法有:茎尖培养 、
珠芽培养 、 化学处理和热处理 。
2.1 茎尖培养和珠芽培养
茎尖培养是由于病毒在患病的植株上分布不均匀 , 在较老的器官和组织内病毒含量较高 , 在幼嫩的或未
成熟的组织和器官中病毒的含量较低 。茎尖是植株中最年轻 , 细胞分裂最活跃的部位 , 病毒一般通过维管束
转移 , 茎尖分生组织没有维管束 , 病毒只能通过胞间连丝传递 , 赶不上细胞分裂和生长的速度 , 所以它几乎
不含或很少含病毒 , 植物茎尖中无毒生长点培养成了去除植物中病毒使植物复壮的重要方法[ 5]。
珠芽培养时先剥掉外部鳞片 , 把带有叶原基的珠芽生长点经消毒 , 无菌水冲洗数次后 , 剥掉部分叶原
基 , 最后将带有 1～ 2个叶原基的生长点在解剖镜下切成 0.3 ～ 1.2mm不同长度小段进行培养 。赵祥云等 [6]实
验表明 , 利用 0.3 ～ 0.8mm珠芽生长点对淡黄花百合进行离体培养 ,通过脱分化产生愈伤组织 , 然后将愈伤
组织再分化成芽 , 最后培育出的幼苗可成功地脱去烟草环斑病毒 。
2.2 化学处理和热处理
抑制植物病毒的活性化学物质包括代谢拮抗物质 、植物生长调节物质等 。其中一些已用于植物脱毒研
究 。病毒唑是广谱性抗病毒药物 , 国外在 20世纪 70年代末和 80年代初 , 国外一些科学家将这种抗动物病
毒的药物应用于植物 [9] , 成功地脱去了马铃薯 X病毒 、黄瓜花叶病毒和苜蓿花叶病毒等。在百合生产上 , 采
用矿物油 、 植物油 、杀虫剂和外激素喷洒 , 可控制百合病毒病蔓延 [ 10]。也可采用矿物油和拟除虫菊酯杀虫
剂混合物进行喷洒控制百合蚜虫传播的百合潜隐病毒和百合斑驳病毒[ 11]。然而目前尚未见到化学药物应用
于百合脱毒研究的报道。
热处理依据是在高温下病毒出现钝化 , 其复制明显减弱或不再繁殖。将植物在高温下培养数周至数月 ,
这个期间生长的嫩稍不带病毒 [12 , 13]。植株的存活率和脱毒率受温度的高低和持续时间长短的影响 。大部分百
合病毒在 50～ 65℃之间活性稳定 [4] , 所以处理温度在 65～ 75℃之间 , 才能钝化病毒。然而温度过高 , 会降
低植株的成活率 。在实践中 , 利用较高温度处理时 , 缩短处理时间 , 温度较低时适当延长处理时间 。
3 百合病毒检测技术
采用各种方法获得的脱毒苗 , 必须经过严格的检测确定脱毒才能推广应用 。目前常用的检测方法有指示
植物法 、电镜技术 、 酶联免疫技术和分子生物学技术等 。
3.1 指示植物法和电子显微镜技术
百合病毒检测的基本手段是指示植物法。百合体内的一些病毒可以采用汁液接种法 , 接种到其他草本植
物(指示植物)上 , 然后根据指示植物的感病表现研究病毒的生物属性特征并进行种类鉴定 。心叶烟 、台湾百
合 、昆诺藜 、番茄 、 百日菊 、郁金香 、千日红等 [4 ,14]都可作为鉴别百合病毒的指示植物 。指示植物法虽然简
单 , 但检测速度很慢 , 表现症状的时间最短需要 10 ～ 20d , 长的需要 1 ～ 3月 , 而且灵敏度也较低 , 还受季节
限制 , 此外 , 维护指示植物园费用也高。有些百合病毒 , 只能由蚜虫传播 , 也不适用指示植物法。所以指示
植物法的应用局限性较大 。
K.Lee等 [ 15]利用电子显微镜观察到百合样品中的呈丝状 、 弯杆状和杆状的病毒粒子。Stone 采用免疫技
术与电镜技术结合的方法鉴别百合汁液中病毒粒子 。免疫电镜技术的出现促进了电镜技术在百合病毒检测上
的应用 。但由于电镜技术需用电子显微镜 , 而且样品的制备费用较高 。所以电子显微镜技术应用受到一定的
限制。
3.2 酶联免疫法和分子生物学技术
现在应用最广泛的植物病毒检测方法是酶联免疫吸附法(ELISA)。植物病毒是由蛋白质和核酸组成的核
蛋白 , 是一种很好的抗原 , 注射到动物后会产生抗体。由于不同病毒产生的抗血清具有特异的识别特性 , 因
此可以用已知病毒的抗血清鉴定病毒种类 。目前 , 酶联免疫吸附法(ELISA)和点免疫结合试验(DIBA)是检测
百合上病毒 CMV 、 LSV和 LMoV的常规方法 [16 ～ 18]。J.Kim 等 [ 19]通过病毒侵染后产生的症状 , 采用组织印迹
和 DBIA方法对百合栽培品种乔治 、 凝星等进行检测 , 结果表明 , 上述百合品种主要感染的病毒有百合潜隐
○文献综述 LITERATURE SUMMARY
·226· 沈 阳 农 业 大 学 学 报 第 34 卷
病毒 、 黄瓜花叶病毒和郁金香碎花病毒 。ELISA的灵敏度较高 , 可检测到纳克水平的病毒 。然而 , ELISA难
于检测更低浓度的病毒[ 20]。
分子生物学技术是通过检测病毒核酸来证实病毒的存在 , 其特点是灵敏度比 ELISA还高 , 特异性强 、检
测快速 , 并可用于大量样品的检测 , 并且适应范围广 , 应用对象可以是 RNA病毒 、 DNA病毒和类病毒 。目
前常用的分子生物学技术包括核酸分子杂交技术 、 双链 RNA电泳技术 、反转录 PCR(RT-PCR)技术 。RT-
PCR技术已用于检测许多植物病毒 , 在百合上 RT-PCR用于克隆 CMV , LSV and LMoV外壳蛋白基因 [ 21 ～
23] , 但用于检测百合病毒的报道很少 。最近 Yoshiji Niimi等[ 24](2003)设计简并引物 , 采用 RT-PCR方法成功
的检测了百合品种 Casa Blanca ,Avignon和White Aga 的病毒 CMV、 LSV和 LMoV。洪健等采用双链 RNA电泳
技术 、 核酸分子杂交技术和 RT-PCR等方法鉴定和检测东方百合上的病毒。用 RT-PCR技术检测百合病毒
无放射性危险 , 可以检测到飞克(fg10-15)数量级的植物病毒及大规模的样品 。所以分子生物学技术特别是
RT-PCR技术在百合病毒检测方面将会有更广阔的应用前景 。
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[责任编辑 于洪飞]
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