全 文 ：分子植物育种，2012年，第 10卷，第 1期，第 12-23页
Molecular Plant Breeding, 2012, Vol.10, No.1, 12-23
研究论文
Research Article
百合花粉管粘附与定向生长相关基因 SCA的克隆及基因多样性分析
邬月娟 崔金腾 张克中 * 贾月慧
北京农学院园林学院,北京, 102206
*通讯作者, zkzzxd@vip.sina.com
摘 要 以亚洲百合‘Tresor’、麝香百合‘White heaven’和东方百合‘Caruso’为试材，首次在百合基因组中扩
增到 SCA基因全长序列，在亚洲百合和东方百合中分别获得 4个 SCA基因拷贝，在麝香百合中获得 3个 SCA
基因拷贝，各拷贝之间具有 72.97%~99.68%相似性。从百合基因组中克隆到的 SCA基因均含有两个外显子
和一个内含子，推导编码 113~115个氨基酸残基的前体蛋白(其中成熟蛋白均含 91个氨基酸残基)。SCA蛋
白具有典型的 LTP蛋白 N端信号肽，保守的 8个半胱氨酸残基和 2个五肽模序，并且氨基酸序列之间的相
似性高于基因序列相似性，为 87.91%~98.90%。亚洲百合、麝香百合、东方百合 SCA氨基酸序列比对发现在
某些氨基酸位点存在着明显种系间差异。在系统进化树中，三个杂种系的 11个 SCA基因的氨基酸序列与单
子叶植物 LTP亲缘关系较近，与双子叶植物较远，这与植物分类学中亲缘关系的远近相一致。
关键词 百合,花粉管粘附,定向生长, SCA,基因多样性
Cloning of SCA Gene Related to Pollen Tube Adhesion and Oriented
Growth and Analysis of Gene Diversity in Lilium spp.
Wu Yuejuan Cui Jinteng Zhang Kezhong * Jia Yuehui
College of Landscape, Beijing Agricultural College, Beijing, 102206
* Corresponding author, zkzzxd@vip.sina.com
DOI: 10.3969/mpb.010.000012
Abstract Stigma/style cysteine-rich adhesin genes (SCA) were cloned from‘Tresor’(Lilium Asiatic Hybrids),
‘White heaven’(Lilium Longiflorum) and‘Caruso’(Lilium Oriental Hybrids) leaves by PCR approaches. In this
research we obtained four gene copies in both of‘Tresor’and‘Caruse’genomes and three gene copies in‘White
heaven’genome. The identities of the cloned SCA among the copies were in the ranges from 72.97% to 99.68%.
There are two exons and one intron in all of cloned SCA sequence, which could be deduced immature protein with
113 or 115 amino acid residues (encoding mature protein with 91 amino acid residues) SCA protein contains an
N-terminal signal peptide of typical LTP protein, eight conserved cysteine residues and two consensus pentapeptide
motifs. The identities among the amino acid sequences were in range from 87.91% to 98.90% higher than that of
the similarities of gene sequences. Alignment analysis of amino acid sequences of cloned SCAs showed there were
some distinct differences of amino acid site existing in the tested three species of lily hybrids. The phylogenetic tree
revealed the relationship of the cloned 11 amino acid sequences of SCA were all more close to LTP family of
monocotyledons than that ofdicotyledons, which were consistent with the conclusions of kinship in plant taxonomy.
Keywords Lily (Lilium spp.), Pollen tube adhesion, Oriented growth, SCA, Gene diversity
在亲和性授粉中，父本花粉在母本柱头乳突细
胞上萌发，花粉管从乳突细胞进入花柱、在花柱中从
基金项目：本研究由北京市自然科学基金(6122004)、北京市教委科技创新平台项目(PXM2009-014207-078529)、北京市科技新
星项目(2003B013)和北京市教育委员会科研水平提高经费共同资助
上向下定向生长、从花柱进入子房、在子房中定向生
长，以及花粉管从子房胎座向珠柄及珠孔的定向生
长等，上述各阶段花粉管定向生长如此精确和有序，
是与各阶段的相关基因分层调控有关(Higashiyama,
2010)。花粉管在花柱中的粘附与定向生长是重要的
一个环节，它影响到花粉管能否顺利穿越花柱，也影
响到后期花粉管向珠孔端的定向生长(Palanivelu and
Preuss, 2006)。分离及研究百合花粉管粘附与定向生
长相关基因(SCA 基因)，鉴定其功能，研究 SCA 基
因对同一品系或另一品系花粉管粘附与定向生长的
影响，有助于部分解释百合品系间杂交障碍产生的
分子机制。
加利福尼亚大学 Lord实验室从麝香百合(lilium
longiflorum)‘Nellie white’柱头及花柱道分泌物中分
离到 SCA (Stigma/style Cysteine-rich Adhesin)蛋白，
SCA蛋白能在果胶多聚糖的协助下促使花粉管粘附
到花柱引导组织表皮上，并促进花粉管的相互粘附
(Mollet et al., 2000; Park et al., 2000)。Lord实验室还
分离了一种 Chemocyanin蛋白，它能促进花粉管从
柱头向花柱的定向生长，SCA蛋白能增强这种定向
生长作用(Kim et al., 2003)。
目前的百合商业品种主要集中在 3大杂种系：亚
洲百合杂种系(Lilium Asiatic hybrids)、东方百合杂种
系(Lilium Oriental hybrids)和麝香百合杂种系(Lilium
Longiflorum hybrids)。杂种系内杂交育种较容易成
功，系间杂交较难亲合(Van Tuyl et al., 2000)。但是系
间杂种(如 OA杂种系, LA杂种系和 LO杂种系)具
有更高观赏价值或抗逆性，更值得人们去培育。对于
系间杂交育种，国外发明了离体整合技术(离体授
粉、离体子房培养、离体胚珠培养、离体胚抢救等技
术的整合) (Van Tuyl et al., 1991)，但是杂交成功率仍
较低(Van Tuyl et al., 2000)。重要原因是双亲亲缘关
系过远，父本花粉管在母本雌蕊中的定向生长能力
大大减弱——进入花柱上部的花粉管不向花柱下部
及子房进行定向生长，或者进入子房的花粉管不发
生转向珠孔端的定向生长。Lord 实验室关于百合
SCA基因促进花粉管粘附及定向生长的功能研究引
起了我们的兴趣，它或许能为我们阐明百合品系间
杂交障碍机制提供某些帮助。
Lord实验室组仅以麝香百合为材料，从转录组
水平和蛋白质水平对百合 SCA基因进行了研究，未
见从基因组层面分离和研究百合 SCA基因。本研究
从亚洲百合、东方百合、麝香百合 3个品系中各选一
个品种，从基因组层面克隆和分析 SCA基因，以期从
基因组层面发现 SCA基因的结构；同时探寻该基因
在百合不同杂种系间的差异，为阐明百合品系间杂
交障碍机制提供某些依据。
1结果与分析
1.1百合 SCA的特异 PCR扩增
用 LSCAF/LSCAR引物对 3个不同品种的百合
基因组 DNA进行 PCR扩增，扩增大小范围在 500~
700 bp之间(图 1)。将扩增结果克隆测序，亚洲百合
‘Tresor’和东方百合‘Caruso’各获得 4条不同序列，
麝香百合‘White heaven’获得 3条不同序列。为了方
便分析，将亚洲百合的 4条序列分别命名为 LaSCA1、
LaSCA2、LaSCA3和 LaSCA4；将东方百合的 4条序列
分别命名为 LoSCA1、LoSCA2、LoSCA3和 LoSCA4；将
麝香百合的 3条序列分别命名为 LlSCA1、LlSCA2和
LlSCA3。
1.2百合 SCA的 DNA序列分析
本实验选用了一对引物扩增到了基因全长。将
测序结果与麝香百合‘Nellie white’SCA cDNA序列
进行比对，发现实验所得各基因均含有 2个外显子和
1个内含子(表 1)，内含子剪接位点符合经典的GT-AG
法则(图 2)。前人将含有内含子的 LTP基因列为Ⅰ
型LTP，而将不含内含子的 LTP基因列为Ⅱ型 LTP
(YuberoSerrano et al., 2003)。本实验所得 SCA均属Ⅰ
型 LTP。编码区中内含子变化较大，外显子则相对保
守(图 2;表 1)。将 11条 SCA基因序列上传 GenBank，
获得相应的登录号(表 1)。采用 DNAMAN对测序得
到的 11个序列进行相似性比较，相似性在 72.97%~
99.68%之间(表 2)。
1.3百合 SCA的相似性比较及氨基酸序列分析
通过内含子剪切信号，开放阅读框和信号肽的确
图 1百合基因组中 SCA的 PCR扩增
注: M: DNA marker; A:亚洲百合‘Tresor’; L:麝香百合‘White
heaven’; O:东方百合‘Caruso’
Figure 1 SCA fragments amplified from lily genomic DNA by
SCA specific primers
Note:M: DNAmarker; A: Asiatic hybrids‘Tresor’; L: longiflorum
hybrids‘White heaven’; O: Oriental hybrids‘Caruso’
百合花粉管粘附与定向生长相关基因 SCA的克隆及基因多样性分析
Cloning of SCA Gene and Analysis of Gene Diversity in Lilium spp. 13
分子植物育种
Molecular Plant Breeding14
百合花粉管粘附与定向生长相关基因 SCA的克隆及基因多样性分析
Cloning of SCA Gene and Analysis of Gene Diversity in Lilium spp.
图 2克隆的 11个 SCA的核苷酸序列比对
注: *:表示完全相同的核苷酸;……标出引物序列,——标出编码信号肽的核苷酸序列;实线方框中是内含子序列;虚线方框中
分别为起始密码子“ATG”和终止密码子“TAA”
Figure 2 Alignment analysis of nucleotide sequences among 11 cloned SCA from lily
Note: *: Show the same nucleotide;……: Show primer sequences;——: Show the nucleotide sequences which encode signal peptide;
Introns are framed in solid line box; Dashed lines boxs show starting codon“ATG”and terminate codon“TAA”respectively
表 1三种百合的 11个 SCA基因结构分析和 GenBank登录号
Table 1 Gene structural analysis of cloned 11 SCAs from three species of lily and their accession numbers
序列名称
Name of cloned
sequences
LaSCA1
LaSCA2
LaSCA3
LaSCA4
LlSCA1
LlSCA2
LlSCA3
LoSCA1
LoSCA2
LoSCA3
LoSCA4
总长度(bp)
Total length of
framents (bp)
629
600
577
577
619
619
647
670
673
647
636
外显子区 1
Exon1
28-359
28-365
28-359
28-359
28-359
28-359
28-362
28-332
28-359
28-359
28-362
外显子区 2
Exon2
488-497
438-447
488-497
488-497
462-471
462-471
490-499
515-524
514-523
491-500
479-488
内含子长度(bp)
Length of intron
(bp)
128
72
128
128
102
102
127
155
154
131
116
ORF长度(bp)
Length of ORF
(bp)
342
348
342
342
342
342
345
342
342
342
345
GenBank登录号
GenBank Accession
no.
JQ009444
JQ009445
JQ009446
JQ009447
JN676989
JN603662
JN676990
JQ009440
JQ009441
JQ009442
JQ009443
外显子区
Regions of exons
15
分子植物育种
Molecular Plant Breeding
表 2三种百合 11个 SCA核苷酸序列与预测氨基酸序列相似性分析
Table 2 Identities of the nucleotide sequences and the deduced amino acid sequences of 11 cloned SCA from three species of lily
相似性
Identity
LaSCA1
LaSCA2
LaSCA3
LaSCA4
LlSCA1
LlSCA2
LlSCA3
LoSCA1
LoSCA2
LoSCA3
LoSCA4
LaSCA1
100.00
81.43
89.51
87.92
84.06
84.21
85.41
85.69
85.46
89.38
88.14
LaSCA2
94.51
100.00
76.54
77.20
85.56
85.71
82.60
79.21
78.48
81.79
83.85
LaSCA3
98.90
94.51
100.00
98.09
77.26
77.42
76.65
73.28
72.97
81.20
78.49
LaSCA4
96.70
94.51
97.80
100.00
77.10
77.26
77.11
73.88
73.12
81.36
78.96
LlSCA1
96.70
93.41
95.60
95.60
100.00
99.68
93.66
83.93
83.51
84.72
86.95
LlSCA2
97.80
94.51
96.70
96.70
98.90
100.00
93.97
84.23
83.80
85.03
87.11
LlSCA3
94.51
92.31
94.51
96.70
93.41
94.51
100.00
84.66
85.52
86.35
87.02
LoSCA1
91.21
90.11
90.11
90.11
92.31
93.41
87.91
100.00
92.17
91.37
87.41
LoSCA2
92.31
89.01
91.21
91.21
93.41
94.51
89.01
92.31
100.00
89.50
88.91
LoSCA3
95.60
92.31
94.51
94.51
96.70
97.80
92.31
95.60
96.70
100.00
91.72
LoSCA4
93.41
90.11
92.31
92.31
94.51
95.60
92.31
92.31
95.60
96.70
100.00
注:左下方为核苷酸序列相似性系数，右上方为预测氨基酸序列相似性系数
Note: Lower left shows the identities of nucleotide sequences, and upper right shows the identities of deduced amino acid sequences
定，推导出各序列相应成熟蛋白的氨基酸序列，进行
两两比对，氨基酸序列比核苷酸序列相似性更高，为
87.91%~98.90% (表 1)，将其与玉米 LTP、水稻 LTP、
台湾百合 LfLTP及麝香百合‘Nellie white’SCA的氨
基酸序列进行序列比对和相似性分析(图 3)。结果表
明，各序列与玉米 LTP的相似性最低为 54.84%，最
高为 56.99%；与水稻 LTP相似性最低为 50.55%，最
高为 52.75%；而与麝香百合‘Nellie white’SCA和台
湾百合 LfLTP相似性最高均达到 98.90%，最低均为
92.31%。推测这些序列具有同源性。
SCA氨基酸序列在品系间虽然有较高的同源性，
但也存在着一些明显的差别：麝香百合、台湾百合和
亚洲百合的第 22位均是缬氨酸(V)，但东方百合该
位点却为谷氨酸(E)或谷氨酰胺(Q)；麝香百合、台湾
百合和亚洲百合的第 64位点均是丙氨酸(A)，但是
东方百合该位点却为天冬酰胺(N)；台湾百合和亚洲
百合第 71位点均为丙氨酸(A)，东方百合却为甘氨酸
(G)，麝香百合‘Nellie white’SCA及‘White heaven’的
LlSCA1和 LlSCA2均为甘氨酸(G)，麝香百合‘White
heaven’的 LlSCA3则为丙氨酸(A)，而 Chae等从麝香
百合‘Nellie white’分离到三种 SCA亚型，其中 SCA3
的 71位氨基酸也为丙氨酸(A) (Chae et al., 2007)；第
82位氨基酸，除了从 GenBank中查到的麝香百合
‘Nellie white’为精氨酸(R)以外，其余的均为丝氨酸
(S)。这些种系间差异氨基酸位点是否会出现在蛋白
功能区而导致花粉粘附时的表现差异和影响花粉管
定向生长，从而产生种间不亲和现象，还有待进一步
的验证。
在蛋白序列结构上，各片段都含有 LTP的结构
特征，8个保守的半胱氨酸残基和 2个保守的五肽模
序(Thr/Ser-X1-X2-Asp-Arg/Lys和 Pro-Tyr-X-Ile-Ser)
(Douliez et al., 2000)。但在第一个模序中，LaSCA4和
LlSCA3的第一位氨基酸并不是苏氨酸或丝氨酸，而
是天冬酰胺，这与水稻 LTP中该位点氨基酸一致。第
二个模序中，LlSCA1的第一位氨基酸为亮氨酸而非
脯氨酸，比较 LlSCA1和 LlSCA2的氨基酸序列发现
两者只有这一个位点的差别，对其核苷酸序列进行
分析，发现第 325 个碱基在 LlSCA1 中为 T，而在
LlSCA2和 LlSCA3中对应碱基均为 C。对 LaSCA2核
苷酸序列进行分析，发现第 112位碱基从 C突变为
T，使得编码第五位氨基酸的序列从 CAG (谷氨酰胺)
变为 TAG (终止密码子)，导致了翻译的提前终止，但
为了进一步分析其后位点的情况，同时判断其是否具
有 LTP的保守结构特征，在图 3的序列比对中仍以
全序列进行，结果发现突变位点后的碱基编码的氨
基酸序列未发生变化，所以初步判断该位点可能发
生了点突变，导致翻译终止，进一步推测 LaSCA2可
能是 SCA 进化过程中产生的假基因。在玉米 LTP
中，46位精氨酸和 81位酪氨酸被认为是 LTP在离体
条件下与脂质分子作用的关键位点(Han et al., 2001)，
发现这两个位点在各序列中具有很高的保守性。
1.4 SCA系统进化树的构建和二级结构预测
将本实验预测所得的 10条百合 SCA氨基酸序
列(除 LaSCA2)与 57条其它植物已知 LTP氨基酸序
列进行比对，构建系统进化树(图 4)。结果发现，上述
16
10条序列首先与麝香百合‘Nellie white’SCA 和台
湾百合 LfLTP聚为一类，说明它们进化关系最近。同
品种百合不同的 SCA拷贝能较好的聚到一起，亚洲
百合 SCA与台湾百合 LfLTP聚为一类，麝香百合
‘White heaven’的 SCA与麝香百合‘Nellie white’的
SCA聚为一类。从聚类图中也可看出，亚洲百合与麝
香百合遗传距离比它与东方百合遗传距离近，这可
能与麝香百合和亚洲百合杂交比东方百合和亚洲百
合杂交更容易获得杂种后代的现象有一定关联度。
百合再与同为单子叶植物的禾本科植物聚在一起，
这与植物分类中亲缘关系的远近相契合。聚类分析
发现双子叶植物中的蔷薇科、茄科和十字花科的植
物分别能较为一致地聚为一个分支，说明 LTP基因
在进化过程中是相对保守的。但是从图中也发现，拟
图 3克隆的 SCA与其它百合科和禾本科植物的 LTP的氨基酸序列比对
注: *:表示完全相同的氨基酸残基; 8个保守的半胱氨酸残基用加粗的星号(*)标出;方框中为保守的五肽模体;最后四列数字表
示同源性;序列信息: Maize LTP (登录号: AAA33493), Rice LTP (登录号: AAB70541),麝香百合 SCA (登录号: Q9SW93),台湾
百合 LfLTP (登录号: ACP30545)
Figure 3 Alignment analysis of amino acid sequences of clonedSCAs compared with LTP in in families of liliaceous and
gramineousplants
Note: *: Shows the same amino acid; Eight conserved cysteine amino acid residues are shown as boldface asterisks (*); Two consensus
pentapeptide motifs are shown in boxes; The figures of the left four columns represents gene homology; Sequence data are adopted
from maize LTP (Acc. Nos. AAA33493), Rice LTP (Acc. Nos. AAB70541), lilium longiflorum SCA (Acc. Nos. Q9SW93) and Lilium
formosanum LfLTP (Acc. Nos. ACP30545)
百合花粉管粘附与定向生长相关基因 SCA的克隆及基因多样性分析
Cloning of SCA Gene and Analysis of Gene Diversity in Lilium spp. 17
分子植物育种
Molecular Plant Breeding
图 4百合 SCA与其它物种 LTP的系统进化树
Figure 4 Phylogenetic tree constructed based on deduced amino acid sequences of the cloned SCAs and other species LTPs
18
南芥 LTP6、LTP10、LTP8 和 LTP11 并未聚到十字花
科这一类中，而拟南芥 LTP9与拟南芥其它 LTP的遗
传距离更远，这可能是因为拟南芥 LTP由一个小的
多基因家族编码(Arondel et al., 2000)，从而产生了
氨基酸序列有差异的 LTP蛋白。大麦 LTP2、小麦
LTP2-1和小麦 LTP2-2并未聚在禾本科组中，而是
与豇豆 nsLTP单独聚为一个大分支，这是因为植物
中，根据蛋白质分子量的大小 LTP可分为 LTPⅠ和
LTPⅡ，LTPⅠ定位于细胞壁，分子量约为 10 kDa，由
90~95个氨基酸残基组成，主要存在于植物地上部分
的组织和器官；LTPⅡ分子量约为 7 kDa，由大约 70
个氨基酸残基组成，主要存在于根部 (李长生等 ,
2009)，豇豆 nsLTP、大麦 LTP2、小麦 LTP2-1和小麦
LTP2-2属于Ⅱ型 LTP，其它各序列均属Ⅰ型 LTP。
对蛋白二级结构进行预测(图 5)，结果显示，在
二级结构上Ⅰ型 LTP和Ⅱ型 LTP也存在着较大差
别。Ⅱ型 LTP的 α-螺旋比Ⅰ型 LTP少，而 β-转角
比Ⅰ型 LTP多。而Ⅰ型 LTP各序列之间在二级结构
总体差别不大，α-螺旋和不规则盘绕是其主要的结
构元件，且四股 α-螺旋主要分布在氨基酸序列的前
中部，尾端则主要由不规则盘绕和延伸连构成。在单
子叶植物中，SCA和 LTP蛋白的第一个 α- 螺旋区
内均没有出现 β-转角，而在双子叶植物中，部分
LTP蛋白在该区域中存在 β-转角结构。从系统进化
树和二级结构预测可以推断，植物 LTP基因的分化
可能存在于单子叶植物和双子叶植物分化之前。
2讨论
Lord实验室从麝香百合‘Nellie White’柱头和花
柱中分离到一种 SCA蛋白。他们采用免疫金电镜技
术进行活体观察，同时进行离体粘附实验，均证明
SCA蛋白对花粉管具有粘附作用(Park et al., 2000)。
Lord实验室提取柱头和花柱总 RNA，根据 SCA蛋
白 N端序列，设计相关引物，克隆到编码 SCA蛋白
的 cDNA序列(Park et al., 2000)。但是他们仅从转录
组水平和蛋白质水平对百合 SCA基因进行了研究，
未从基因组层面全面研究 SCA的基因结构；并且只
对麝香百合(Lilium Longiflorum hybrids)一个品系中
的一种百合进行了 SCA基因的研究。
我们研究发现，百合 SCA基因的开放阅读框包
含 2个外显子和 1个内含子。在外显子方面，由三个
品系 SCA基因外显子推导的各氨基酸序列相似性较
高，均在 80%以上，且都含有 LTP基因的保守结构特
征，但是在第 22、64和 71个位点，氨基酸存在明显
的品系间差异(图 3)。是否因为这几个氨基酸位点的
差异，就导致了 SCA蛋白功能的变化?抑或是这些
位点的变化影响了 SCA与花粉管顶端质膜上 SCA
受体的特异性识别，从而影响不同品系间花粉管的
粘附与定向生长、并进而影响品系间的杂交亲和性?
目前我们正在进行上述不同品系百合 SCA蛋白体
外表达及纯化，通过体外粘附实验确定该蛋白对品
系内和品系间花粉管的粘附和向化性诱导能力，从
而判断这几个氨基酸位点的变化是否足以引起不同
品系间 SCA蛋白对花粉管粘附的差异。
在内含子方面，三个品系内含子的位置相对保
守但长度不尽相同，同源性比外显子低；同一品系不
同拷贝之间的内含子序列相同或存在少许差异。内
含子虽然不编码蛋白质，但其在基因表达中具有重
要调控作用。多数情况下，内含子具有增强基因表达
的作用(Callis et al., 1987)，其对基因表达的增强程
度跟许多因素有关，如内含子自身特征(Clancy and
Hannah, 2002)、启动子和外显子序列特征、内含子在
载体上的位置(王悦冰, 2008)、目的基因序列结构、细
胞类型及细胞生理状态等。有的内含子调节基因表
达具有组织特异性(Stemmler et al., 2005)，有的内含
子在一些基因表达中亦起抑制作用(Hormuzdi et al.,
1998)。本研究中,三个品系的内含子序列有较大差
异，它们有可能影响到 SCA的表达量、进而影响到不
同品系花粉管感知 SCA的能力。同一品系中 SCA不
同拷贝间也存在内含子的差异，它们是否会导致不
同拷贝 SCA在不同组织中的差异表达，从而导致同
一品系中不同拷贝 SCA的主要功能有差异? 这也是
后续研究中需要考虑的问题。
我们的研究还发现，SCA在百合基因组中存在
多样性，这与前人在其他物种中对 LTP 基因的研
究结果基本一致(Arondel et al., 2000; Soufleri et al.,
1996)。拟南芥 LTP基因具有多样性，拟南芥 LTP4基
因在保卫细胞中特异表达，LTP6基因在各组织中均
有表达，LTP1基因在柱头中大量表达，LTP3和 LTP6
基因在胚珠中表达；用 2% PEG和 300 mmol/L NaCl
处理出芽幼苗，LTP2和 LPT4的表达量增加；黑暗条
件下 LTP5 在胚轴中的表达量增加，干旱条件下
LTP6在子叶顶端特异表达(Chae et al., 2010)。LTPs
被认为是与防御蛋白、硫素蛋白一类的抗逆性多肽
(Broekaert et al., 1997)。抗逆性是其第一功能，近来认
为这类蛋白可能具有第二种功能，即作为为信号转
导中的向化性因子(Yang et al., 1999)。百合 SCA基因
存在多样性，也可能是一种多功能基因，但这需要进
百合花粉管粘附与定向生长相关基因 SCA的克隆及基因多样性分析
Cloning of SCA Gene and Analysis of Gene Diversity in Lilium spp. 19
分子植物育种
Molecular Plant Breeding20
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百合花粉管粘附与定向生长相关基因 SCA的克隆及基因多样性分析
Cloning of SCA Gene and Analysis of Gene Diversity in Lilium spp. 21
分子植物育种
Molecular Plant Breeding
行进一步的生物学验证。
从系统进化树及二级结构分析图发现，植物
LTP基因在进化过程中相对保守，其分化可能存在
于单子叶植物和双子叶植物分化之前。
本研究是在前人对麝香百合‘Nellie white’SCA
基因的研究基础上，首次从基因组层面分离 SCA基
因，揭示了 SCA的基因结构；发现了 SCA基因在百合
三个不同品系之间存在差异；并且发现 SCA基因在
百合同一个体之内存在多样性，上述研究结果均是
对 Lord实验室关于百合 SCA基因研究的重要延伸。
研究结果对于我们揭示百合品系间杂交障碍的分子
机理具有一定的指导作用。
3材料与方法
3.1供试材料
材料亚洲百合(Lilium Asiatic Hybrids)‘Tresor’、
麝香百合(Lilium Longiflorum)‘White heaven’和东方
百合(Lilium Oriental Hybrids)‘Caruso’种球购置于北
京神州克劳沃园艺技术有限责任公司，种植于北京
农学院组培中心的花房内，分别采新鲜幼嫩无病虫
害的叶片于塑料封口袋，封口后立即放入冰盒带回
实验室置-80℃超低温冰箱保存备用。
2×Taq PCR Green Mix 购自北京鼎国昌盛生物
技术有限责任公司；DNA分子量标准、凝胶回收试
剂盒、大肠杆菌感受态细胞 Top10均购自天根公司；
T载体为宝生物工程有限公司产品。
3.2基因组 DNA提取
基因组 DNA提取采用 CTAB法(林菊生, 2004,
科学出版社, 138-141)。
3.3引物设计及 PCR扩增
根据 NCBI GenBank中麝香百合‘Nellie white’
SCA的 cDNA非编码区设计引物，引物序列分别为
LSCAF：5-ACTCCCATTCTTACCAGCTCTCCTT-3
和 LSCAR：5-CTGAAACAGAAGACTACAACACC
GC-3。引物合成工作由上海英骏公司完成。
PCR反应体系为 25 μL，其中 2×Taq PCR Green
Mix 12.5μL，引物(10μmol/L)各 0.5μL，模板(35 ng/μL)
5 μL，ddH2O 6 μL。PCR程序为：94℃预变性 5 min；
38个循环的 94℃变性 40 s，55℃退火 30 s，72℃延伸
40 s；72℃延伸 10 min；最后 4℃保温。PCR产物进行
2.0%琼脂糖凝胶电泳并用凝胶成像系统拍照观察。
3.4 SCA扩增片段的克隆、测序
将扩增产物切胶回收后连接到 pMD19-T载体
中，并转入大肠杆菌感受态 TOP10中进行克隆。蓝
白斑筛选挑取阳性克隆，进行菌液 PCR 检测，电泳
检测产物，确定插入片段为目的片段的送菌液至上
海英骏生物技术有限公司进行测序。
3.5序列分析
利用 DNAMAN软件对克隆所得的各序列进行
相似性比较；利用 DNAStar软件寻找最大开放阅读
框，推导氨基酸序列；使用 SignalP (http://www.cbs.
dtu.dk/services/SignalP/)预测可能存在的信号肽；利
用 NCBI的在线 BLAST 程序进行同源搜索，并利
用 ClustalX和Mega4对序列做多重比较，再以邻接
法 (neighbor-joining method)构建系统进化树；利用
SPOMA在线分析软件对各序列推导蛋白的二级结
构进行预测。
作者贡献
邬月娟是本研究的实验设计和实验研究的执行
人，同时完成数据和试验结果分析，论文初稿的写
作；崔金腾和贾月慧参与实验设计和实验结果分析；
张克中是项目的构思者及负责人，指导实验设计，数
据分析，论文写作与修改。全体作者都阅读并同意最
终的文本。
致谢
本研究由北京市自然科学基金(6122004)、北京市
教委科技创新平台项目(PXM2009-014207-078529)、
北京市科技新星项目(2003B013)和北京市教育委员
会科研水平提高经费共同资助。作者感谢实验室相
关人员的指导和帮助。
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