全 文 ：文章编号:1001-4829(2011)01-0266-04
　　收稿日期:2010-04-09
　　基金项目:云南省自然科学基金资助项目(2007C121M);国家科
技支撑计划项目(2007BAD45B01、2007BAD45B04)
作者简介:杨秀梅(1977-), 女 ,助理研究员 ,主要从事花卉质
量控制与标准化研究 , ＊为通讯作者。
百合鳞片 DNA提取及 RGA-PCR体系的优化
杨秀梅 ,瞿素萍 ,王丽花 ,崔光芬 ,彭绿春 ,王继华＊
(云南省农业科学院花卉研究所 农业部花卉质检中心 ,云南 昆明　650205)
摘　要:以百合鳞片为材料 ,采用改良的 CTAB法获得了高质量的基因组 DNA。通过影响 PCR反应各因子的优化 ,建立了适合百
合的 RGA-PCR反应体系:25μl体系中含 30ng模板 DNA、 2.5mmol/LMgCl2、 0.2 mmol/LdNTPs、0.6 μmol/L引物及 1.5UTaq
酶。扩增程序为:94℃预变性 5min, 94℃变性 1min, 44℃退火 1min, 72℃延伸 2min, 40个循环;最后 72℃延伸 7min。利用该
体系对 35个百合品种进行RGA-PCR,表明该反应体系具有较好的稳定性和可靠性。
关键词:百合;DNA提取;RGA-PCR
中图分类号:S644.1　　　文献标识码:A
DNAExtractionandOptimizationofRGA-PCR
ReactionSystemforBulbsofLilium
YANGXiu-mei, QUSu-ping, WANGLi-hua, CUIGuang-fen, PENGLv-chun, WANGJi-hua＊
(SupervisionandTestingCentreforFlowerofAgriculturalMinistry, FlowerResearchInstitute, YunnanAcademyofAgriculturalScience,
YunnanKunming650205, China)
Abstract:HighqualitygenomicDNAwasobtainedfromlilybulbsusingimprovedCTABmethod.Diferentfactorsthatafectedamplification
reactionwereoptimizedtoestablishtheRGA-PCRreactionsystemandprocedureoflily.Thereactionwereperformedinavolumeof25μl
containing30ngofDNA, 2.5mmol/LMgCl2 , 0.2mmol/LdNTPs, 0.6μmol/Lprimerand1.5 UTaqDNApolymerase.Thereaction
procedurewasasfolows:pre-denaturingat94℃for5min, 40cyclesofdenaturingat94℃ for1min, annealingat44℃ for1minand
extendingat72℃ for2min, extendingat72℃for7minafterthecycles.TheoptimizedRGA-PCRsystemwastestedon30lilycultivars
andshowntobesteadyandreliable.
Keywords:Lilium;DNAextraction;RGA-PCR
　　百合有 “球根花卉之王 ” 的美称 ,为百合科
(Liliaceae)百合属(Lilium)植物 ,其用途广泛 ,具有
药用 、食用和观赏价值 [ 1 ～ 2] 。百合是当今花卉市场
上的重要切花之一 ,近年来由于种植面积不断扩大
和连年种植 ,百合病害变得日趋严重。利用植物自
身携带的抗性基因培育和推广抗病品种是防治病害
最经济 、有效的方法 [ 3] 。根据抗病基因序列编码蛋
白的保守结构域 ,设计抗病基因同源相似序列(re-
sistancegeneanalogs, RGA)引物 ,利用 PCR技术扩
增植物基因组 DNA或 cDNA,得到的扩增产物经测
序和序列对比即可作为抗病基因同源序列(RGA),
与已克隆抗病基因同源性较高的 RGA可作为探针 ,
经分子标记定位后进一步筛选抗病近等位基因系文
库 ,可获得抗病基因候选序列 [ 4] 。由于 RGA是针对
抗病基因保守序列设计引物进行基因组扩增 ,因而
可转化为分子标记进行运用 ,用于作物的标记辅助
育种 [ 5] 。
本研究以云南省农业科学院花卉研究所保存的
百合种质资源为材料 ,进行 DNA提取方法及 RGA-
PCR条件的优化 ,利用优化的体系对 35个百合品种
进行 RGA-PCR扩增 ,了解百合不同种之间的抗性
遗传变异状况 ,为进一步开展百合的抗性遗传分析
及杂交育种工作提供科学参考。
266
西　南　农　业　学　报
SouthwestChinaJournalofAgriculturalSciences　　　　　　　　　　　　　　
2011年 24卷 1期
Vol.24　　No.1
1　材料与方法
1.1　材料
试验材料为云南省农业科学院花卉研究所种质
资源圃内保存的百合种质资源 ,包括东方百合品种
13个 ,亚洲百合品种 13个 , OT系列百合品种 6个 ,
铁炮百合品种 3个 。采集新鲜百合鳞片 ,洗净晾干
后于 4℃冰箱保存待用。
1.2　方法
1.2.1　总 DNA的提取　采用液氮研磨与不用液氮
研磨 2种改良的 CTAB法提取百合鳞片基因组
DNA。液氮研磨的提取方法:①取 0.2 g百合鳞片
于灭菌研钵 ,加入适量液氮后迅速研磨成细粉 ,将细
粉倒入离心管 ,加入 800 μl65 ℃预热的 2×CTAB
提取缓冲液 、少许 PVP及 25 μl巯基乙醇 , 65 ℃水
浴 1 h。 ②取出离心管冷却至室温 ,加入 5mol/L的
乙酸钾 200μl,冰浴 1 h。 ③取出离心管 , 10 000 r/
min离心 10 min,将上清液倒入另一离心管 ,加入等
体积氯仿 /异戊醇(v/v:24∶1),混匀 10 min后 7000
r/min离心 10min。重复 2次。 ④吸取上清 ,加入等
体积异丙醇 ,混匀后置于 -20 ℃沉淀 30 ～ 60 min。
⑤10 000r/min离心 10 min,弃上清。沉淀加入 75
%乙醇 400μl洗涤 , 7 500 r/min离心 2min,重复 2
次 。再用 100 %乙醇洗 1次 , 7500 r/min离心 2
min。⑥控干沉淀 , 加入 40 ～ 80 μlddH2O溶解
DNA, -20℃长期保存备用 。
不用液氮研磨的提取方法:①取 0.2 g百合鳞
片于灭菌研钵 ,加入少许石英砂 、PVP、1.5 mL去多
糖缓冲液(40mmol/LTris-HCl, 5mmol/LEDTA, 1.5
% NaCl)及 20μl巯基乙醇后研磨 ,将组织匀浆倒入
离心管 , 8000 r/min离心 5 min。 ②弃上清液 ,加入
1.0mL去多糖缓冲液及 20 μl巯基乙醇 ,用毛细管
充分搅匀后于 8000r/min离心 5min。③弃上清液 ,
加入 800 μl65 ℃预热的 2×CTAB及 25 μl巯基乙
醇 , 65 ℃水浴 1 h。其余步骤与采用液氮研磨的提
取方法相同 。通过 1.0 %琼脂糖凝胶电泳对 DNA
进行检测。
1.2.2　RGA-PCR反应体系的优化　引物 XLRR
For/Rev根据水稻抗白叶枯病 Xa21基因编码 LRR
区域的 DNA序列设计 [ 6] 。上游引物为 5 -CCGTT-
GGACAGGAAGGAG-3 , 下游引物为 5 -CCCATA-
GACCGGACTGTT-3 ,由上海生工生物工程有限公
司合成 。TaqDNA聚合酶 、dNTPs购自大连宝生物
工程有限公司。反应体系为 25 μl,其中 10×bufer
2.5μl, 10μmol/L引物 1.5 μl, 1.5 UTaq酶 ,其余
因子逐一设置浓度梯度进行试验 ,找出适合百合
RGA-PCR反应的最佳条件 。
PCR反应的最初程序为:94℃预变性 5 min;94
℃变性 1 min, 45℃退火 1 min, 72 ℃延伸 2 min, 40
个循环;最后 72 ℃延伸 7 min。筛选出优化的体系
后 ,进行退火温度和循环次数的调整。 PCR扩增在
ABIVeriti型 PCR仪上完成 ,整个 PCR反应时间大
约持续 3.5h。反应结束后在 PCR管中加入 5μl上
样缓冲液混匀 ,取 6 μl于 1.5%琼脂糖凝胶电泳检
测 ,紫外透射反射分析仪观察 、凝胶成像系统拍照记
录。
2　结果与分析
2.1　DNA的提取
DNA的浓度和质量直接关系到 RGA-PCR反应
的成败。由于百合鳞片中多糖含量较高 ,多糖 、多酚
往往与 DNA一起形成共沉淀而难以得到高质量的
DNA。实验比较了液氮研磨与不用液氮研磨 2种方
法对 DNA提取质量和浓度的影响 ,结果表明 ,不用
液氮而直接加去多糖缓冲液研磨的样品 DNA质量
好 、纯度高 ,条带清晰明亮 ,完全符合 RGA-PCR反
应的要求(图 1)。采用液氮研磨方法得到的 DNA
浓度较低 , 1号 、 5号 、6号和 8号点样孔有明显滞
留 ,在主带前面有明显亮带 ,表明 DNA样品不纯 ,可
能含有 RNA、蛋白质及多糖等杂质(图 2)。
2.2　RGA-PCR反应体系的优化
2.2.1　模板 DNA　模板 DNA的量在 10 ～ 80 ng时
均有扩增产物 ,模板浓度低于 20 ng时 ,条带较为模
糊;高于 50 ng时 ,易产生弥散性产物 ,条带不清晰。
模板浓度在 20 ～ 50 ng时扩增效果较理想 ,但在弱
带的重复性方面 ,以 30ng的模板浓度最佳 ,因此模
板 DNA的用量为 30 ng。
2.2.2　Mg2 +浓度　引物 、模板解链以及退火温度
均受 Mg2+的影响 ,确定扩增反应的最佳 Mg2+浓度
对 PCR反应至关重要 。本试验设置了 1.5 , 2.0 ,
2671期 　　　　　　杨秀梅等:百合鳞片DNA提取及 RGA-PCR体系的优化
泳道 1～ 4的 Mg2+浓度依次为 3.0, 2.5, 2.0, 1.5mmol/L
TheconcentrationofMg2+inlane1-4are3.0, 2.5, 2.0, 1.5
mmol/L, respectively
图 3　不同 Mg2+浓度 RGA-PCR扩增结果
Fig.3　RGA-PCRresultofdiferentconcentrationofMg2+
2.5, 3.0 mmol/L4个不同的 Mg2+浓度水平 , 当
Mg2 +浓度为 1.5, 3.0 mmol/L时均无扩增条带 ,浓
度为 2.5 mmol/L时扩增效果最理想 ,故百合 RGA-
PCR反应中 Mg2+浓度为 2.5 mmol/L(图 3)。
2.2.3　dNTPs浓度　试验比较了 0.15、0.20、0.25
mmol/L3个 dNTPs浓度对扩增的影响。浓度为 0.
15、0.25 mmol/L时条带模糊或无条带 ,浓度为 0.20
mmol/L时条带清晰 、明亮 , 扩增效果最佳 , 因此
dNTPs的浓度为 0.20 mmol/L。
2.2.4　百合品种的 RGA-PCR扩增　试验结果表
明 ,当 25 μl反应体系中各成分为:ddH2O13.7 μl,
10 ×bufer2.5 μl, 25 mmol/LMgCl2 2.5 μl, 2.5
mmol/LdNTPs2.0 μl, 10 μmol/L引物各 1.5 μl,
Taq酶 0.3 μl, 30 ng的模板 DNA1 μl时 ,所获得的
条带清晰 ,多态性好。其余体系中出现了不同程度
的拖带 、无条带或条带不清晰现象。通过退火温度
实验发现 ,当退火温度为 44 ℃、循环次数为 40次
时 ,扩增产物量大 ,电泳条带清晰 , PCR扩增结果最
佳 。为了检测 RGA-PCR体系的稳定性 ,利用优化
的体系对提取的 35份百合品种 DNA样品进行 PCR
扩增 ,由图 4可看出 ,优化后的体系反应稳定 ,条带
清晰 ,适合于百合品种的 RGA-PCR分析。
3　讨　论
PCR扩增的效果与模板 DNA的提取方法 、提取
质量及 DNA的纯度和完整性有着密切的关系 ,不同
植物必须采取与之相适宜的 DNA提取方法 [ 7] 。百
合是多年生草本植物 ,每年开花后地上部分枯萎 ,选
取叶片作为 DNA提取材料受到一定的时间限制。
而且 ,新鲜叶片在 4 ℃保存时间不长 , 1周后叶面即
开始长霉 ,提取的 DNA也有明显降解现象。冷冻保
存可以延长样品保存时间 ,但提取 DNA时必须使用
液氮研磨 ,否则也容易造成 DNA降解 ,影响 DNA提
取质量。在百合生长发育的任何时期 ,鳞茎的干物
质率显著高于茎叶 。而且 ,百合鳞片采集方便 ,在 4
℃可长期保存 ,可繁殖再生 ,是提取 DNA的好材
料[ 8] 。本研究采用改良的 CTAB法 ,于细胞核裂解
之前利用去多糖缓冲液将细胞核从富含多糖 、蛋白
质等次生物质的细胞质中分离出来 ,在细胞核裂解
之前即去除了大部分多糖 、酚类物质 。该方法既可
节省液氮使用成本 ,又能高效去除样品中的多糖 、酚
类等物质 ,得到高质量的模板 DNA,证明是一种理
想的百合 DNA提取方法 。
除 DNA模板外 ,影响 RGA-PCR反应的因素还
有 Taq酶活性 、Mg2 +、dNTP及引物浓度等 ,这些因
素相互作用。 Taq酶浓度过低不能获得足够的扩增
产物 ,过高容易出现非特异性扩增 。dNTP的浓度直
接影响反应中起重要作用的 Mg2 +浓度。模板或引
物的浓度过高或过低都不利于引物与模板的结
合[ 9-14] 。试验对百合 RGA-PCR反应体系进行了优
化 ,得到的最佳体系为:25 μl反应体系中含 30 ng
模板 DNA、2.5 mmol/LMgCl2 、0.2 mmol/LdNTPs、
0.6 μmol/L引物及 1.5UTaq酶。利用该体系对 35
个百合品种进行 RGA-PCR扩增 ,得到了清晰 、重复
性好的条带。本试验的目的在于建立和优化反应体
图 4　引物 XLRRFor/Rev对 35个百合品种 DNA的扩增结果
Fig.4　Theamplificationresultsof35lilycultivarsDNAwithprimerXLRRFor/Rev
268 西　南　农　业　学　报　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　23卷
系 ,因此采用 1.5 %琼脂糖凝胶电泳检测 [ 15] ,在进
一步获得品种间多态性信息时 ,采用变性聚丙烯凝
胶电泳将得到更多谱带 ,便于分析基因组间的差异
信息。
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(责任编辑　王家银)
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