全 文 ：百合(Lilium spp.)为百合科百合属多年生球根类
花卉，是目前世界上最受欢迎的高档切花之一。近年
来，随着百合在国内外鲜切花市场的走俏，百合种球和
鲜切花生产逐年增加。由于百合易受病毒病侵染，不
但中国繁殖的种球质量不佳，进口的种球也不能连年
使用，不得不每年花掉大量外汇从荷兰等国进口。因
此培育无病毒种球，尽早实现百合种球国产化早已是
中国的一项长期国策。目前在中国百合种球生产主要
依靠鳞片扦插，子球培育成母球的方法获得，但该方法
存在病毒感染率高、种球品质退化快、不能重复使用等
缺点。近年通过组织培养快速繁殖百合种球的报道增
多，但大多数研究报道主要侧重于不同外植体对百合
基金项目：国家自然科学基金资助项目“siRNA抑制百合无症病毒（LSV）表达的研究”（30771760）；大连市科技局计划项目“百合无病毒组培种球产
业化生产及配套栽培技术示范体系的建立”（2006B10NC140）。
第一作者简介：徐品三，男，1958年出生，研究生学历，博士，研究方向为百合组织培养及分子育种，在百合种球脱毒及转基因研究中发表过多篇论
文。通信地址：116023大连市凌工路2号大连理工大学环境与生命学院，Tel：0411-84706356-606，E-mail：xupinsan@hotmail.com。
收稿日期：2008-12-29，修回日期：2009-03-30。
无病毒百合组培种球快速繁殖体系的建立
徐品三，刘华夏
（大连理工大学环境与生命学院，大连 116023）
摘 要：以铁炮百合(Lilium Longiflorum)感病种球为材料，对热处理后的种球进行了培养基附加物和移栽
基质的优化，建立了无病毒组培种球快速繁殖体系。结果表明：以MS为基本培养基，当附加植物激素
NAA和KT时能促进子球再生，再生率达86%以上，在0.2 mg/L NAA和 0.4 mg/L KT的培养基中平均再
生子球数显著增多；附加5 mg/L多效唑培养基能促进子球增大，3 mg/L多效唑有利于子球再分化；活性
炭对子球增大无明显影响，但适当浓度的活性炭能提高培养子球的品质；高浓度蔗糖能促进子球增大，
但对子球再分化有抑制影响。蛭石∶土、珍珠岩以及珍珠岩︰土作为基质时，均能达到较高的成活率和
株高，但在珍珠岩∶土为3∶1作为基质移栽组培球，其成活率和生长状况最佳。37℃热处理随着处理天数
的增加，处理后培养鳞片的成活率和子球再生率显著下降，但处理20天子球再生率只能达40%左右，但
LSV检出率明显低于未处理的种球，脱毒率达95%以上。
关键词：百合；热处理；病毒检测；子球快繁；户外移栽
中图分类号：S 682.2 文献标识码：A
Establishment of In vitro Rapid Propagation System on Virus-free
Bulblets of Lilium spp.
Xu Pinsan, Liu Huaxia
(School of Environmental & Biological Science & Technology, Dalian University of Technology, Dalian 116023)
Abstract: Virus-free in vitro bulblet rapid propagation system was established using Lilium Longiflorum as
experimental material. The results showed that the best medium for bulblets regeneration from bulb scales was
MS+KT 0.4 mg/L+NAA0.2 mg/L. Optimum bulblet enlargement was observed in medium with Paclobutrazol
5mg/L, while Paclobutrazol in concentration 3 mg/L was propitious to bulblet formation. The quality of bulblets
can be enhanced in the medium with appropriate concentration of AC. Medium with 90g/L sucrose can promote
bulblet enlargement but inhibit bulblet formation. The best matrix for the highest surviving rate and best growth
situation was pearlite/soil(3 ∶1). About 50% bulb scales survived and regenerated after the treatment of high
temperature 37℃ for 20 days, the effectiveness of eliminating virus with the method got to more than 95%.
Key words: Lilium spp., heat treatment, virus-detection, rapid propagation, transplantation
中国农学通报 2009,25(09):174-178
Chinese Agricultural Science Bulletin
再生效果的研究，或是利用组培苗叶片不同部位进行
快速繁殖和结鳞茎的研究[1-2]，而对无病毒百合组培子
球的获得、培养外植体的再生、子球增大以及出瓶移栽
等多因素的系统研究的报道几乎没有。
此研究以建立完善的无病毒百合组培种球快速繁
殖体系为目标，通过热处理获得无病毒组培种球，对影
响百合外植体分化、子球增大以及移栽后的生长发育
等诸多影响因素进行了系统研究，为今后利用组培技
术获取无病毒种球，培育优良品种，加速植株更新复壮
提供技术参考，为中国百合无病毒种球产业化生产奠
定理论基础。
1 材料与方法
1.1 材料
供试材料铁炮百合(Lilium Longiflorum)‘白天堂’3
年生种球（周径约12~14 cm），由大连佛伦德球根花卉
有限公司提供。百合病毒检测所用 Trizol、反转录、
PCR试剂等购于大连宝生物有限公司。于 2008年 7
月在大连理工大学环境与生命学院完成试验。
1.2方法
1.2.1 种球病毒检测及热处理 采用RT-PCR法[3]进行百
合无症病毒（LSV）检测：用Trizol法（此实验用 1 ml），
取百合叶片（约 0.1 g）提取总RNA，将提取的RNA溶
解于 20 μl的 ddH2O中。以模板RNA 0.8 μl、下游引物
1 μl、ddH2O 4.2 μl配置引物混合液，采用 5×M-MLV
Buffer 2 μ l，10 mmol/L dNTP Mixture 1 μ l，40 U/μ l
RNase Inhibitor 0.25 μ l ， 200 U/μ l RTase M-MLV
0.25 μl，加ddH2O补足至总体积10 μl。42℃放置1 h，
70 ℃放置 15 min，合成 cDNA。取 2 μl cDNA溶液为
模板，上下游引物各 1 μl，变性 45 s，扩增 60 s，35次循
环，进行PCR扩增。
将感染该病毒的供试种球放入 37℃恒温箱中分
别进行10天和20天热处理。
1.2.2 母球鳞片培养子球再生 对热处理后的母球进行
如下处理和培养：首先冲洗母球，去除外层病斑或损伤
的鳞片，将好的鳞片从鳞茎上剥离下来，洗涤剂浸泡、
清洗后，用 75%的酒精浸泡 30 s，无菌水冲洗，再用
0.1%升汞消毒 15 min，无菌水冲洗 4~5次。将灭菌后
的鳞片切成方块（5 mm×5 mm），内侧向上接种到含有
不同生长调节剂（见表1）的MS基本培养基中，所有培
养基均添加30 g/L蔗糖，5 g/L琼脂，pH调到5.8。培养
条件为：温度(24±1)℃，光照4000 lx（16 h/天）。培养6
周后，调查统计鳞片分化情况。
表1 热处理及生长调节剂对铁炮百合母球鳞片再生子球的影响
注：*同一列不同字母代表邓肯氏分析5%水平差异显著。
热处理时间/天
0
10
20
6-BA/(mg/L)
0.5
1.0
0.5
1.0
0.5
1.0
NAA/(mg/L)
0.1
0.2
0.1
0.2
0.1
0.2
存活率/%
85.9a*
87.3a
80.9b
75.3bc
63.4c
61.8cd
子球再生率/%
76.7a
71.7a
76.7a
66.7b
43.3c
30.0cd
1.2.3 子球鳞片诱导小子球扩增 以母球鳞片分化出的
子球为外植体，将子球鳞片做成切口接种于含有不同
生长调节剂（见表 2）的MS基本培养基中。其他添加
物和培养条件同上。每处理设3个重复，每重复10个
外植体。培养6周后，调查统计小子球再生情况。
1.2.4 组培子球诱导增大 挑选直径约为0.4 cm的再生
子球为外植体接种在以下3组培养基中：第一组：MS+
5 g/L琼脂+30 g/L蔗糖+1、3、5 mg/L多效唑（PP333）；第
二组：MS+5 g/L琼脂+ 30 g/L蔗糖+2、4、6、10 g/L活性
炭（AC）；第三组：MS+5 g/L琼脂+30、60、90 g/L蔗糖。
其他培养条件同上。每处理设3个重复，每重复12个
外植体。培养6周后，用游标卡尺测量子球的直径，进
行统计分析。
1.2.5 组培球的户外移栽 将组配苗出瓶炼苗 2天
后，洗去附着在根上的培养基，用 500倍多菌灵浸泡
20 min灭菌，选取子球直径为1~1.5 cm的组配苗，移栽
于经过 30 min高压灭菌后的四种组合基质上：①蛭
石，②蛭石∶土3∶1，③珍珠岩，④珍珠岩∶土3∶1。将移栽
后的种苗放置在设有防虫网的温室中，8周后统计生
长情况，同时进行病毒检测。
2 结果与分析
2.1 热处理和生长调节剂对母球鳞片诱导子球再生的
影响
母球鳞片接种到培养基上，其成活率因热处理
和热处理的时间不同而有所差异，尤其热处理后的
母球鳞片比未处理的鳞片降低明显，并随着处理时
徐品三等：无病毒百合组培种球快速繁殖体系的建立 ·· 175
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间的增加成活率递减；生长调节剂的配比对热处理
后的鳞片成活无显著影响（表 1）。成活后的鳞片颜
色逐渐由浅黄转绿，10天左右鳞片基部略膨大，15
天左右开始出现浅绿色小鳞茎状突起，25天左右突
起逐渐分化出小子球。由成活鳞片再生子球的能力
上差异明显，处理的时间越长再生率越低，处理 20
天要比未处理的鳞片子球再生率低一倍左右；对于
热处理后的材料，在 MS 培养基中添加 0.5 mg/L
6-BA和 0.1 mg/L NAA时，表现出有利于诱导子球再
生的倾向。
2.2 生长调节剂不同配比对子球鳞片培养小子球分化
的影响
生长素 IBA和NAA对诱导子球再分化没有明显
的差异，但高浓度的生长素有抑制子球分化的倾向（表
2）。再分化强弱与细胞分裂素密切相关，其顺序为
KT、2-ip、ZT，尤其当KT与NAA组合时，其分化率和
每个外植体上形成平均子球数都最高，分化率达 85%
以上。当 0.2 mg/L NAA与 0.4 mg/L KT组合时，平均
形成子球数达3.8个。ZT的添加对子球的形成和平均
形成子球数明显低于其他两种细胞分裂素的作用。
生长调节剂/(mg/L)
IBA
0.1
0.1
0.2
0
0
0
0.1
0.1
0.2
0
0
0
0.1
0.1
0.2
0
0
0
NAA
0
0
0
0.1
0.1
0.2
0
0
0
0.1
0.1
0.2
0
0
0
0.1
0.1
0.2
2-ip
0.2
0.4
0.4
0.2
0.4
0.4
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
KT
0
0
0
0
0
0
0.2
0.4
0.4
0.2
0.4
0.4
0
0
0
0
0
0
ZT
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0.2
0.4
0.4
0.2
0.4
0.4
分化率/%
70.00±0.15 ab*
70.00±0.12 ab
66.67±0.23 c
83.00±0.00 ab
56.67±0.22 c
73.33±0.07 ab
70.00±0.00 ab
60.00±0.06 ab
56.67±0.24 c
98.00±0.00 a
93.33±0.18 a
86.67±0.07 ab
76.67±0.03 ab
66.67±0.15 bc
63.33±0.19 bc
36.67±0.12 d
40.00±0.12 d
26.67±0.20 d
再生子球数
1.30±0.17 bc
1.46±0.54 bc
1.54±0.42 bc
2.67±0.43 b
2.26±0.54 b
2.39±0.39 b
1.37±0.09 bc
1.23±0.07 c
1.98±0.20 bc
2.37±0.09 b
2.62±0.15 b
3.78±0.18 a
1.30±0.11 c
1.45±0.12 bc
1.18±0.25 c
1.94±0.15 bc
0.67±0.33 c
0.63±0.38 c
表2 生长调节剂不同配比对铁炮百合子球鳞片离体分化的影响
注：*为平均值±标准误差；同一列不同字母代表邓肯氏分析5%水平差异显著
2.3 蔗糖、多效唑（Paclobutrazol，PP333）、活性炭
（Activated Charcoal, AC）对组培子球增大及分化的影
响
随着蔗糖、多效唑和活性炭浓度的增加，子球直径
增大倍数也随之增高（见表3）。添加5.0 PP333 mg/L对
子球增大效果最显著，直径增大倍数平均值为4.06，最
大值为 4.75，最大直径达 1.9 cm；其次依次为 90g/L蔗
糖、10 g/L AC，增大倍数分别为 3.04与 2.88。在增大
的同时，组培子球基部会分化出小子球，随着蔗糖、多
效唑和活性炭的浓度降低，每个子球平均再分化小子
球数增加，在添加 1.0 mg/L PP333培养基中再生小子球
数最多，平均为 2.90个；当添加 3.0 mg/L PP333时，子球
的分化率最高为52.8%。在添加蔗糖和多效唑的处理
中，随着浓度的升高，子球的叶片与根的生长受到了明
显的抑制，植株矮小，鳞片增厚。实验结果表明：多效
唑对子球的增大和再分化具有明显的促进作用，即
5.0 mg/L PP333适合百合组培子球增大，3.0 mg/L PP333
诱导子球再生效果最好。
2.4 不同栽培基质对组培种球移栽后的影响及病毒检测
移栽后，蛭石加土、珍珠岩和珍珠岩加土处理均达
到 100%成活率，其中长势最好的是珍珠岩加土基质，
组培苗生长快，植株高，根系发达（表4）。蛭石加土和
珍珠岩基质虽然成活率也达到了 100%，但是苗较弱，
生长不够旺盛，根系少。只用蛭石为基质时不但成活
·· 176
率低，而且株高明显矮小。试验结果表明：最适合百合
组培苗移栽的介质是珍珠岩∶土为3∶1。热处理10天百
合无症病毒的检出率和未经处理无太大差别，都能达
到 50%的脱毒率。热处理 20天的检出率要明显低于
前两者，尤其是在没有添加土壤的基质中栽培的植株
病毒检出率为0，说明土壤容易引起病毒再感染。
注：*为平均值±标准误差；同一列不同字母代表邓肯氏分析5%水平差异显著。
表3 培养基添加蔗糖、多效唑和活性炭对铁炮百合子球增大及再分化的影响
蔗糖/(g/L)
30
60
90
30
30
30
30
30
30
30
PP333/(mg/L)
0
0
0
1
3
5
0
0
0
0
AC /(g/L)
0
0
0
0
0
0
2
4
6
10
增大倍数
2.24±0.08 cd*
2.71±0.10 bc
3.04±0.10 b
1.83±0.06 e
2.42±0.10 c
4.06±0.10 a
2.26±0.14 cd
2.46±0.08 c
2.74±0.11 bc
2.88±0.08 b
再生子球数
2.43±0.20 ab
1.83±0.08 ab
1.83±0.17 ab
2.90±0.74 a
1.92±0.51 ab
1.00±0.00 b
1.00±0.00 b
1.57±0.30 ab
2.00±0.00 ab
0.00±0.00 c
分化率/%
41.7 ab
33.0 c
13.9 d
33.3 c
52.8 a
33.3 c
17.0 d
19.0 d
11.0 d
0.0 e
基质
蛭石
蛭石:土 3∶1
珍珠岩
珍珠岩:土 3∶1
成活率/%
75
100
100
100
根数/cm
9.0 a*
6.4 b
6.2 b
9.0a
植株高度/cm
4.9 b
10.2 a
10.2 a
9.3 a
干热处理后的LSV检出率/%
0天
40
50
20
30
10天
35
40
20
25
20天
0
5
0
2
3 讨论
高温可抑制植物病毒复制或杀死病毒已在有些植
物上得到证明，但热处理的温度和时间不同植物差异
很大[4]，热处理的效果如何也受处理方式、处理材料等
影响[5]。一般来讲热处理温度越高脱毒效果越好，但
活体植物的耐受温度是有限的，所以要在生长温度与
致死温度之间找到最佳温度，才能达到最佳效果。
为了建立百合高效的再生繁殖体系，一般用组培
子球鳞片诱导子球再生，不仅能提高繁殖速度，而且通
过组织培养新品种选育以及获得转基因个体都必须首
先建立再生体系。尽管百合鳞片培养的研究论文很
多，但由于不同品种间差异[6-7]、不同外植体差异[8]以及
培养条件的差异，其研究结果多种多样。通过查阅大
量文献，NAA与 6-BA这两种生长调节剂已被广泛应
用于百合的组织培养中 [9-10]，但是笔者在实际中却发
现，对于铁炮百合 6-BA与NAA搭配诱导出的苗不易
成球，且生长缓慢，浓度过高的话，所诱导出的鳞茎多
为畸形苗，也许是因为所用的母球材料当时的生理状
况所致。在用子球鳞片做外植体时，也表现出低浓度
生长调节剂对诱导子球形成有一定促进作用，在
NAA、IBA、2-ip、ZT、KT的不同组合中，NAA和KT虽
然与其他三种相比没有表现出显著的优势，但诱导率、
总芽数最多，而且容易成球，直径较大。
鳞茎是百合的营养贮藏器官，其周径大小直接影
响地上部分的生长发育，百合组培球的直径大小是衡
量其质量的重要指标。多效唑是一种植物生长延缓
剂，能改变同化物的分配，使同化物运输到正在生长的
球茎上，促进球茎的形成与生长。王爱勤等[11]研究表
明：多效唑对百合根、叶生长有抑制作用，浓度越高越
明显，而对鳞茎的形成及增大有明显的促进作用。笔
者也得出了相同的结论，多效唑 5.0 mg/L时组培子球
增大效果好，多效唑3.0 mg/L时，再生效果好。一般认
为活性炭能吸附培养中的有害代谢产物、调节激素配
比，从而提高培养物的成活率。Loretta Bacchetta等[12]
以直径为3 mm百合组培鳞茎为材料，经过1~2个月的
培养，大于 6 mm的鳞茎的处理均添加了 0.4%的活性
炭。此研究活性炭对促进组培子球的增大效果与多效
唑比不明显，但培养的子球鳞片呈深绿色，说明活性炭
注：*为同一列不同字母代表邓肯氏分析5%水平差异显著；LSV.百合无症病毒。
表4 不同栽培基质对组培种球移栽后的影响及百合无症病毒检测
徐品三等：无病毒百合组培种球快速繁殖体系的建立 ·· 177
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能改善培养基的环境，从而能提高百合子球的品质。
糖的浓度对百合组培子球的生长有很大的影响，胡凤
荣等[13]以东方百合‘sorbonne’‘siberia’为材料，当蔗糖
浓度为 80 g/L时，子球重和直径均达到最大。此研究
随着蔗糖浓度的增加，虽然组培子球再分化能力下降，
但是能促进子球直径增加而抑制鳞片叶的生长。这充
分说明调节蔗糖浓度就是调节C/N比，增加碳水化合物
在鳞茎中的累积能力是影响组培种球生长的重要因素。
由于植物病毒在植株内的分布存在不均匀性，植
物茎尖培养脱毒是根据茎尖组织无病毒或浓度较低的
原理。但对于百合来讲，采用该方法脱毒操作繁琐、繁
殖率低，到达成球时间长，不太适合无病毒种球产业化
生产。在百合无病毒种球生产上，笔者[14-15]曾做过不定
芽培养、抗病毒药剂处理等研究，但又存在着无病毒种
球户外栽培一段时间后出现再感染植株。实验通过热
处理不仅能有效的抑制病毒，而且该方法处理简单，短
期内可以得到大量无病毒种球。如果对移栽户外的无
病毒种球进行科学的严格管理，定期进行病毒检测，使
种球保持长时间无病毒状态是完全可能的。
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