全 文 ：西北林学院学报 ２０１５，３０（２）：１５～２１
Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｎｏｒｔｈｗｅｓｔ　Ｆｏｒｅｓｔｒｙ　Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ
　　ｄｏｉ：１０．３９６９／ｊ．ｉｓｓｎ．１００１－７４６１．２０１５．０２．０３
葡萄风信子转录因子ＭａＭＹＢ２的克隆及表达模式分析
　收稿日期：２０１４－０５－１４　修回日期：２０１４－０８－２５
　基金项目：国家自然科学基金项目“单子叶植物蓝色花形成关键转录因子基因克隆与功能分析”（３１１７０６５２）。
　作者简介：李志根，男，在读硕士，研究方向：园林植物分子育种。Ｅ－ｍａｉｌ：ｌｉｚｈｉｇｅｎ２０４９＠１６３．ｃｏｍ
＊通信作者：刘雅莉，女，教授，硕士，硕士生导师，研究方向：园林植物遗传育种。Ｅ－ｍａｉｌ：ｌｙｌ６１５１＠１２６．ｃｏｍ
李志根１，２，刘雅莉１，２＊，杨慧萍１，２，刘妮妮１，２
（１．旱区作物逆境生物学国家重点实验室，西北农林科技大学／农业部西北地区园艺作物生物学与种质创制重点实验室，
陕西 杨陵７１２１００；２．西北农林科技大学 林学院，陕西 杨陵７１２１００）
摘　要：试验从葡萄风信子“亚美尼亚”中利用ＲＡＣＥ技术克隆了一个 ＭＹＢ类转录因子，命名为
ＭａＭＹＢ２，Ｇｅｎｅｂａｎｋ登陆号为 ＫＪ７４４０３８。克隆到的 ＭａＭＹＢ２全长７１１ｂｐ，开放阅读框为６００
ｂｐ，编码１９９个氨基酸，推测的蛋白分子量约为２２．３４ｋｕ，理论等电点为５．４６，保守域具有ＤＮＡ结
合位点；与矮牵牛（ＡＡＦ６６７３０．１）关系最近；核定位试验表明 ＭａＭＹＢ２蛋白定位在细胞核中；实时
定量ＰＣＲ分析了ＭａＭＹＢ２在葡萄风信子“亚美尼亚”不同组织部位中的表达模式，结果不同组织
中均有表达，在花中表达量最高，且随着花色变深表达量逐渐升高。结果表明，ＭａＭＹＢ２有可能参
与了葡萄风信子中花青素积累的转录调控。
关键词：葡萄风信子；ＭＹＢ转录因子；基因克隆；表达模式分析
中图分类号：Ｓ７１８．３　　　文献标志码：Ａ　　　文章编号：１００１－７４６１（２０１５）０２－００１５－０７
Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ　ｏｆ　ａ　ＭＹＢ　Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ　Ｆａｃｔｏｒ　ａｎｄ　Ａｎａｌｙｓｉｓ　ｏｆ　Ｉｔｓ　Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ　ｉｎ
Ｇｒａｐｅ　Ｈｙａｃｉｎｔｈｓ（Ｍｕｓｃａｒｉ　ｂｏｔｒｙｏｉｄｅｓ）
ＬＩ　Ｚｈｉ－ｇｅｎ１，２，ＬＩＵ　Ｙａ－ｌｉ　１，２＊，ＹＡＮＧ　Ｈｕｉ－ｐｉｎｇ１，２，ＬＩＵ　Ｎｉ－ｎｉ　１，２
（１．Ｓｔａｔｅ　Ｋｅｙ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　ｏｆ　Ｃｒｏｐ　Ｓｔｒｅｓｓ　Ｂｉｏｌｏｇｙ　ｉｎ　Ａｒｉｄ　Ａｒｅａｓ，Ｎｏｒｔｈｗｅｓｔ　Ａ＆Ｆ　Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ／Ｋｅｙ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　ｏｆ　Ｈｏｒｔｉｃｕｌｔｕｒａｌ　Ｐｌａｎｔ
Ｂｉｏｌｏｇｙ　ａｎｄ　Ｇｅｒｍｐｌａｓｍ　Ｉｎｎｏｖａｔｉｏｎ　ｉｎ　Ｎｏｒｔｈｗｅｓｔ　Ｃｈｉｎａ，Ｍｉｎｉｓｔｒｙ　ｏｆ　Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒｅ，Ｙａｎｇｌｉｎｇ，Ｓｈａａｎｘｉ　７１２１００，Ｃｈｉｎａ；
２．Ｃｏｌｌｅｇｅ　ｏｆ　Ｆｏｒｅｓｔｒｙ，Ｎｏｒｔｈｗｅｓｔ　Ａ＆Ｆ　Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ，Ｙａｎｇｌｉｎｇ，Ｓｈａａｎｘｉ　７１２１００，Ｃｈｉｎａ）
Ａｂｓｔｒａｃｔ：Ｉｎ　ｔｈｉｓ　ｓｔｕｄｙ，ｗｅ　ｉｓｏｌａｔｅｄ　ａ　ｎｏｖｅｌ　ＭＹＢ　ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ　ｆａｃｔｏｒ　ｆｒｏｍ　Ｇｒａｐｅ　Ｈｙａｃｉｎｔｈｓ，ｎａｍｅｄ
ＭａＭＹＢ２ａｎｄ　ｔｈｅｎ　ａｎａｌｙｚｅｄ　ｉｔｓ　ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ　ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ　ａｎｄ　ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ　ｐａｔｔｅｒｎ．Ｔｈｅ　ＯＲＦ　ｏｆ　ＭａＭＹＢ２ｗａｓ
６００ｂｐ　ａｎｄ　ｅｎｃｏｄｉｎｇ　１９９ａｍｉｎｏ　ａｃｉｄｓ．Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ　ａｎａｌｙｓｉｓ　ｓｈｏｗｅｄ　ｔｈａｔ　ｔｈｅ　ｄｅｄｕｃｅｄ　ｐｒｏｔｅｉｎ　ｍｏｌｅｃｕｌａｒ
ｗｅｉｇｈｔ　ｏｆ　ｔｈｅ　ｇｅｎｅ　ｗａｓ　２２．３４ｋｕ．ＭａＭＹＢ２ｐｒｏｔｅｉｎ　ｗａｓ　ｌｏｃａｌｉｚｅｄ　ｉｎ　ｔｈｅ　ｎｕｃｌｅｕｓ　ｗｈｅｎ　ｉｔ　ｗａｓ　ｔｒａｎｓｉｅｎｔｌｙ
ｅｘｐｒｅｓｓｅｄ　ｉｎ　ｏｎｉｏｎ　ｅｐｉｄｅｒｍａｌ　ｃｅｌｓ．Ｒｅａｌ－ｔｉｍｅ　ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ　ＰＣＲ　ａｎａｌｙｓｉｓ　ｒｅｖｅａｌｅｄ　ｔｈａｔ　ＭａＭＹＢ２ｔｒａｎｓｃｒｉｐ－
ｔｉｏｎ　ｉｎｃｒｅａｓｅｄ　ｉｎ　ｆｌｏｗｅｒｓ　ｃｏｍｐａｒｅｄ　ｗｉｔｈ　ｏｔｈｅｒ　ｏｒｇａｎｓ．Ｔｈｅ　ｇｅｎｅ　ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ　ｌｅｖｅｌ　ｉｎ　ｆｌｏｗｅｒ　ｔｉｓｓｕｅｓ　ｉｎｃｒｅａｓｅｄ
ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔｌｙ　ｄｕｒｉｎｇ　ｆｌｏｗｅｒ　ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ，ｗｈｉｃｈ　ｉｓ　ｃｏｎｓｉｓｔｅｎｔ　ｗｉｔｈ　ｔｈｅ　ｂｌｏｏｍｉｎｇ　ｐｒｏｇｒｅｓｓ．
Ｋｅｙ　ｗｏｒｄｓ：Ｍｕｓｃａｒｉ　ａｒｍｅｎｉａｃｕｍ；ＭＹＢ　ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ　ｆａｃｔｏｒ；ｇｅｎｅ　ｃｌｏｎｉｎｇ；ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ　ｐａｔｔｅｒｎ
　　葡萄风信子（Ｍｕｓｃａｒｉ　ａｒｍｅｎｉａｃｕｍ）是天门冬
科葡萄风信子属的一种多年生草本观花地被，它以
其较为特有的蓝紫色花色而深受人们喜爱。葡萄风
信子４０多个种具有不同程度的蓝色［１］，这为研究单
子叶植物蓝色形成机理提供了理想的材料。植物的
花色是多种因子共同作用，从而导致细胞中特定花
色素积累的结果。花色素的合成主要是受２类基因
的调控，一类是结构基因，编码花色素生物合成的催
化酶；另一类是调节基因，有些调节基因编码的转录
因子能够应答外界刺激，调控基因时空表达［２］。在
调控色素合成的基因中，ＭＹＢ转录因子研究最为
广泛，目前报道的几乎所有的花色素合成途径都受
到 ＭＹＢ转录因子的调控［３］。
ＭＹＢ转录因子是植物中最大的转录因子家族
之一，它广泛参与植物多种次生代谢过程的调控，例
如：色素合成，细胞的分化与发育，信号转导以及抗
逆抗病等［４］。根据在ＤＮＡ结合功能域中不完全重
复序列的数目，ＭＹＢ转录因子可分为３个亚族
（１Ｒ，２Ｒ和３Ｒ）［５］。有１个重复的 ＭＹＢ类似的蛋
白被称为 ‘ＭＹＢ１Ｒ’，有 ２ 个重复的为 ‘Ｒ２Ｒ３－
ＭＹＢ’，有３个重复的为‘ＭＹＢ３Ｒ’［３］。自Ｐａｚ－Ａｒ－
ｅｓ［６］等从玉米中分离到第一个 ＭＹＢ 转录因子以
来，大量ＭＹＢ类基因被分离和鉴定［７］。近年来，在
苹果［８－９］，龙胆［１０］，百合［１１］等植物中也克隆和鉴定出
调控色素合成相关基因的 ＭＹＢ 类型转录因子，此
外，也有ＭＹＢ类型转录因子调控黄酮醇［１２］、大豆中
不饱和脂肪酸生物合成的报道［１３］。在葡萄风信子
关于其花色成因分子机理的报道则并不多见，与此
同时，葡萄风信子组织培养的器官发生和体胚发生
调控已经有了较为成熟的技术［１４］，可以为葡萄风信
子的后续转基因验证提供技术支撑。
课题组前期建立了蓝色葡萄风信子花组织转录
组 数 据 库 （ＮＣＢＩ　ＢｉｏＰｒｏｊｅｃｔ　Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ：ＰＲＪ－
ＮＡ２１８１５４，ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｂｉｏ－
ｐｒｏｊｅｃｔ／ＰＲＪＮＡ２１８１５４），筛选出了若干有可能参与
调控花青素生物合成的ＭＹＢ转录因子。本研究以
葡萄风信子“亚美尼亚”（Ｍ．ａｒｍｅｎｉａｃｕｍ）为材料，
根据前期获得的 ＭＹＢ 基因片段序列设计特异引
物，利用ＲＡＣＥ技术从花瓣中克隆 ＭＹＢ基因ｃＤ－
ＮＡ全长，并通过实时荧光定量ＰＣＲ分析该基因在
葡萄风信子不同组织中的表达模式，验证其转录激
活活性和核定位性质，为进一步研究 ＭＹＢ 基因的
生物学功能和加深对葡萄风信子蓝色花色形成分子
机制的理解奠定基础。
１　材料与方法
１．１　材料与试剂
试验于２０１３年在西北农林科技大学旱区作物
逆境生物学国家重点实验室进行。材料是由西安植
物园提供的葡萄风信子“亚美尼亚”（Ｍ．ａｒｍｅｎｉａ－
ｃｕｍ）。根据花器官形态，分为５个花发育时期：时
期１（Ｓ１），完全未着色的花蕾；时期２（Ｓ２），开始着色
的花蕾；时期３（Ｓ３），完全着色未开放的花蕾；时期４
（Ｓ４），完全开放的花蕾；时期５（Ｓ５），衰败的花蕾。
分别采集５个发育时期的花蕾，根，茎，叶，于液氮中
速冻后置于－８０℃冰箱中备用。
所用试剂：ＲＮＡ提取试剂盒购自北京百泰克生
物技术有限公司；ＳＭＡＲＴＴＭＲＡＣＥ　ｃＤＮＡ　Ａｍｐｌｉ－
ｆｉｃａｔｉｏｎ　Ｋｉｔ购自 Ｃｌｏｎｔｅｃｈ 公司；ＰｒｉｍｅＳｃｒｉｐｔＴＭ
ＲＴ　ｒｅａｇｅｎｔ　Ｋｉｔ ，ｐＭＤ１９－Ｔ，ＳＹＢＲ? Ｐｒｅｍｉｘ　Ｅｘ
ＴａｑＴＭ　ＩＩ为 ＴａＫａＲａ公司产品；所用引物合成及
测序由北京奥科生物公司完成。
１．２　方法
１．２．１　葡萄风信子总 ＲＮＡ的提取与 ＭＹＢ 基因
ｃＤＮＡ全长的克隆　采用北京百泰克生物技术有限
公司的多糖多酚植物总ＲＮＡ快速提取试剂盒从葡
萄风信子“亚美尼亚”的根，茎，叶以及花不同发育时
期（Ｓ１－Ｓ５）提取总ＲＮＡ，１％琼脂糖凝胶电泳检测，
利用 ＴａＫａＲａ　ＰｒｉｍｅＳｃｒｉｐｔＴＭＲＴ－ＰＣＲ　Ｋｉｔ试剂盒
进行ＲＴ－ＰＣＲ反应合成ｃＤＮＡ，－８０℃冰箱保存以
备ＲＡＣＥ扩增和实时定量分析使用。
以葡萄风信子“亚美尼亚”转录组测序获得的
ＭＹＢ序列片段分别设计３’ＲＡＣＥ和５’ＲＡＣＥ引物
ＭａＭＹＢ－３’ＧＳＰ和ＭａＭＹＢ－５’ＧＳＰ引物（表１），参
照Ｃｌｏｎｔｅｃｈ公司的 ＲＡＣＥ试剂盒对已经提取的
ＲＮＡ分别进行ＲＡＣＥ反转录获得５’－ＲＡＣＥ－Ｒｅａｄｙ
ｃＤＮＡ和３’－ＲＡＣＥ－Ｒｅａｄｙ　ｃＤＮＡ，以之为模板，按
照ＳＭＡＲＴｅｒＴＭ　ＲＡＣＥ　ｃＤＮＡ　Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ　Ｋｉｔ
试剂盒快速扩增ｃＤＮＡ末端，反应体系为２５μＬ。
反应程序为：９４℃预变性３ｍｉｎ，（９４℃变性３０ｓ，
６８℃退火３０ｓ，７２℃延伸３ｍｉｎ）２０ｃｙｃｌｅｓ，７２℃延伸
２ｍｉｎ。扩增产物用１％琼脂糖凝胶电泳检测，回收
纯化目的条带后，与ｐＭＤ１９－Ｔ连接，１６℃过夜连
接，１２ｈ后，将５μＬ连接产物转化２０μＬ大肠杆菌
感受态细胞Ｔｏｐ１０中，经带有氨苄抗生素的平板上
筛选蓝白斑阳性克隆，挑取白色菌落于１００ｍｇ·
Ｌ－１氨苄液体ＬＢ培养基中，３７℃，１８０ｒｐｍ培养１０
～１２ｈ，菌液ＰＣＲ鉴定重组质粒后，由北京奥科鼎
盛测序部测序。测序后，将获得的３’和５’片段进行
拼接。拼接后的序列找到其ＯＲＦ并设计全长引物
ＭａＭＹＢ２－Ｆ和 ＭａＭＹＢ２－Ｒ（表１），以普通反转录
ｃＤＮＡ为模板，反应体系为２５μＬ，其上下游引物各
１μＬ，ｃＤＮＡ模板１μＬ，ｄｄＨ２Ｏ　９．５μＬ，Ｑｕｉｃｋ　Ｔａｑ
ＨＳ　ＤｙｅＭｉｘ　１２．５μＬ。反应程序为９４℃预变性５
ｍｉｎ；９４℃３０ｓ，５７℃３０ｓ，７２℃１ｍｉｎ，循环３０次；
７２℃延伸１０ｍｉｎ，４℃反应结束测序后得到葡萄风
信子 ＭＹＢ基因的全长序列［１５］。
１．２．２　生物信息学分析　开放阅读框的查找用
ＮＣＢＩ中的 ＯＲＦ　Ｆｉｎｄｅｒ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．
ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｐｒｏｊｅｃｔｓ／ｇｏｒｆ／）在线工具完成；利用 Ｅｘ－
ＰＡＳｙ工具包中的ＰｒｏｔＰａｒａｍ（ｈｔｔｐ：／／ｗｅｂ．ｅｘｐａｓｙ．
ｏｒｇ／ｐｒｏｔｐａｒａｍ／）程序分析核酸及编码的氨基酸序
６１ 西北林学院学报 ３０卷　
列的组成成分及理化性质；同源序列的搜索用 ＮＣ－
ＢＩ数据库中的Ｂｌａｓｔｐ（ｈｔｔｐ：／／ｂｌａｓｔ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．
ｇｏｖ／Ｂｌａｓｔ．ｃｇｉ？ＰＡＧＥ＝ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ）完 成，运 用
ＤＮＡＭＡＮ软件对同源序列作多重比对；系统进化
树的构建运用 ＭＥＧＡ５．０软件完成；运用ＰｒｏｔＳｃａｌｅ
（ｈｔｔｐ：／／ｗｅｂ．ｅｘｐａｓｙ．ｏｒｇ／ｐｒｏｔｓｃａｌｅ／）在线工具预
测 ＭＹＢ蛋白的亲水性／疏水性［１５］；利用 ＴＭｐｒｅｄ
（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｃｈ．ｅｍｂｎｅｔ．ｏｒｇ／ｓｏｆｔｗａｒｅ／ＴＭ－
ＰＲＥＤ＿ｆｏｒｍ．ｈｔｍｌ）在线工具分析 ＭＹＢ蛋白的跨膜
结构域；利用ＰＳＯＲＴ Ⅱ Ｐｒｅｄｉｃｔｉｏｎ（ｈｔｔｐ：／／ｐｓｏｒｔ．
ｈｇｃ．ｊｐ／ｆｏｒｍ２．ｈｔｍｌ）在线工具进行亚细胞定位分
析；ＭＹＢ蛋白二级结构和三级结构由ＳＯＰＭＡ（ｈｔ－
ｔｐ：／／ｎｐｓａ－ｐｂｉｌ．ｉｂｃｐ．ｆｒ／ｃｇｉ－ｂｉｎ／ｎｐｓａ＿ａｕｔｏｍａｔ．ｐｌ？
ｐａｇｅ＝／ＮＰＳＡ／ｎｐｓａ＿ｓｏｐｍａ．ｈｔｍｌ）和 Ｐｈｙｒｅ（ｈｔ－
ｔｐ：／／ｗｗｗ．ｓｂｇ．ｂｉｏ．ｉｃ．ａｃ．ｕｋ／～ｐｈｙｒｅ／）在线工具
完成。
１．２．３　ＭａＭＹＢ２蛋白的亚细胞定位分析　在去除
终止密码子的ＭＹＢ基因的开放阅读框两侧设计引
物（表１），分别加ＸｂａⅠ、ＫｐｎⅠ２个酶切位点，扩增
ＭＹＢ序列，提取质粒，与载体ＰＢＩ２２１－ＧＦＰ进行酶
切连接，得到重组质粒。材料选用新鲜洋葱，于超净
工作台内剥取鳞片内表皮，接种于高渗培养基（ＭＳ
无机盐、４０ｇ／Ｌ甘露醇、０．７％ａｇａｒ）平板上，预培养
４～６ｈ，供基因枪轰击用。参照Ｓｃｈｗｉｎｎ［１６］ｅｔ　ａｌ方
法制备基因枪微弹，同时参照ＰＳＤ－１０００说明书，用
ＰＤＳ　１０００／Ｈｅ型基因枪（Ｂｉｏ－Ｒａｄ）轰击洋葱表皮。
转化完成后的材料转入等渗培养基（ＭＳ无机盐、３０
ｇ／Ｌ蔗糖、０．７％ａｇａｒ）继续培养１６ｈ后，用激光共
聚焦荧光显微镜（ＬＳＭ－５１０ＭＥＴＡ）进行观察并采集
图像，激发光波长为４８８ｎｍ。
１．２．４　ＭａＭＹＢ２基因的表达模式分析　将反转录
得到的葡萄风信子“亚美尼亚”根、茎、叶，以及花蕾
不同发育时期（Ｓ１，Ｓ２，Ｓ３，Ｓ４，Ｓ５）ｃＤＮＡ作为模板，
荧光定量ＰＣＲ在ＢＩＯ－ＲＡＤ　Ｃｙｃｌｅｒ　ＩＱ５荧光定量
ＰＣＲ仪上进行，方法参照ＴａＫａＲａ公司的荧光定量
试剂盒ＳＹＢＲ? Ｐｒｅｍｉｘ　Ｅｘ　ＴａｑＴＭ　ＩＩ说明书。反
应体系为２０μＬ，反应程序为：９４℃，３ｍｉｎ；９４℃１５
ｓ，５８℃３０ｓ，４５个循环，每个反应重复３次。定量
ＲＴ－ＰＣＲ软件会自动生成溶解曲线，标准曲线和扩
增曲线。同时阀值（Ｃｔ值）由ＩＱ５软件自动产生。
每个样品设置３个生物学重复，ｍＲＮＡ的相对比值
依据Ｌｉｖａｋ　ａｎｄ　Ｓｃｈｍｉｔｔｇｅｎ进行计算。内参基因为
葡萄风信子Ａｃｔｉｎ基因。取平均值运用Ｏｒｉｇｉｎ　８．０
软件进行数据处理。定量ＲＴ－ＰＣＲ反应所需的引
物见表１。
表１　基因克隆及表达分析所用引物
Ｔａｂｌｅ　１　Ｐｒｉｍｅｒｓ　ｕｓｅｄ　ｉｎ　ｇｅｎｅ　ｃｌｏｎｉｎｇ　ａｎｄ　ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ　ａｎａｌｙ
引物名称Ｐｒｉｍｅｒ 引物序列Ｐｒｉｍｅｒ　ｓｅｑｕｅｎｃｅ（５’－３’） 用途 Ａｉｍ
ＭａＭＹＢ２－３’ＧＳＰ　 ＡＡＧＣＣＡＣＡＧＣＣＴＣＡＧＡＧＣＡＴＣＣＣＣＣＧ　 ＲＡＣＥ
ＭａＭＹＢ２－５’ＧＳＰ　 ＡＣＣＣＣＧＣＡＣＧＣＣＧＣＡＡＴＧＣＣＡＴＣＡＣＡ
ＭａＭＹＢ２－Ｆ　 ＡＴＧＴＣＧＡＧＧＡＣＴＧＡＡＧＧＣＣ 全长克隆
ＭａＭＹＢ２－Ｒ　 ＣＴＡＡＡＴＡＧＡＡＴＣＧＡＡＡＴＣＡＡＡＣＣＡＡＡＧ
Ａｃｔｉｎ－Ｆ　 ＧＣＣＴＧＣＣＡＴＧＴＡＴＧＴＴＧＣＧ 实时定量
Ａｃｔｉｎ－Ｓ　 ＣＧＧＡＧＣＴＴＣＣＡＴＴＣＣＧＡＴＣ
ＭａＭＹＢ２－ＲＴ－Ｆ　 ＧＴＣＡＴＴＡＡＧＣＣＡＣＡＧＣＣＴＣＡＧＡ 实时定量
ＭａＭＹＢ２－ＲＴ－Ｒ　 ＣＣＴＴＣＡＴＴＣＡＣＣＡＴＧＣＣＡＣＣＣ
ＰＢＩ２２１－ＭａＭＹＢ２－Ｆ　 ＴＣＴＡＧＡＡＴＧＴＣＧＡＧＧＡＣＴＧＡＡＧＧＣＣ 亚细胞定位
ＰＢＩ２２１－ＭａＭＹＢ２－Ｒ　 ＧＧＴＡＣＣＡＡＴＡＧＡＡＴＣＧＡＡＡＴＣＡＡＡＣＣＡＡＡＧ
２　结果与分析
２．１　葡萄风信子ＭＹＢ基因全长克隆与序列特征
提取葡萄风信子“亚美尼亚”花蕾总 ＲＮＡ（图
１Ｄ），根据转录组测序获得的ＭＹＢ序列片段设计末
端特异引物 ＭＹＢ－５’ＧＳＰ，ＭＹＢ－３’ＧＳＰ（表１），以
５’－ＲＡＣＥ－Ｒｅａｄｙ　ｃＤＮＡ和３’－ＲＡＣＥ－Ｒｅａｄｙ　ｃＤＮＡ
为模板，按照ＲＡＣＥ试剂盒操作步骤，分别扩增得
到一条１　４８２ｂｐ（图１）和６８７ｂｐ（图１Ａ）大小的条
带（图１Ｂ）。测序后拼接，分析其完整的开放读码框
并设计全长引物 ＭａＭＹＢ－Ｆ和 ＭａＭＹＢ－Ｒ（表１），
经过ＰＣＲ扩增得到了１条长７１１ｂｐ的ｃＤＮＡ序列
（图１Ｃ），命名为ＭａＭＹＢ２。
序列分析表明，其全长７１１ｂｐ，包含１个长度为
３２ｂｐ的５’非翻译区和７９ｂｐ的３’非翻译区，包括完
整的开放阅读框（ＯＲＦ），长度为６００ｂｐ，编码１个含
有１９９个氨基酸的蛋白质，将序列登陆了Ｇｅｎｅｂａｎｋ，
登陆号为ＫＪ７４４０３８。用在线分析工具ＰｒｏｔＰａｒａｍ分
析表明，理论分子量为２２．３４ｋＤ，理论等电点（ＰＩ）为
５．４６，其不稳定系数为３８．３７，属于稳定蛋白。
７１第２期 李志根 等：葡萄风信子转录因子ＭａＭＹＢ２的克隆及表达模式分析
Ｍ：ＤＮＡ标准分子量（Ｔｒａｎｓ２ＫＰｌｕｓ）；Ａ：ＭａＭＹＢ２的５’ＲＡＣＥ电泳结果；Ｂ：ＭａＭＹＢ２的３’ＲＡＣＥ电泳结果；
Ｃ：ＭａＭＹＢ２的ｃＤＮＡ全长扩增结果；Ｄ：不同组织部位ＲＮＡ提取电泳图；１～８：根、茎、叶以及Ｓ１－Ｓ５。
图１　ＲＡＣＥ－ＰＣＲ以及ｃＤＮＡ全长电泳结果
Ｆｉｇ．１　Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ　ｒｅｓｕｌｔｓ　ｏｆ　ＲＡＣＥ－ＰＣＲ　ａｎｄ　ｃＤＮＡ　ｆｕｌ　ｌｅｎｇｔｈ
小写字母代表５’和３’非翻译区；起始密码子用下划线表示，终止密码子用＊表示，同时加下划线。
图２　葡萄风信子ＭａＭＹＢ２的ｃＤＮＡ序列及其推定的氨基酸序列
Ｆｉｇ．２　Ｔｈｅ　ｃＤＮＡ　ａｎｄ　ｄｅｄｕｃｅｄ　ａｍｉｎｏ　ａｃｉｄ　ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ　ｏｆ　ＭａＭＹＢ２ｇｅｎｅｓ　ｆｒｏｍ　Ｍ．ａｒｍｅｎｉａｃｕｍ
２．２　葡萄风信子 ＭａＭＹＢ２编码的蛋白同源性及
其进化分析
　　在ＮＣＢＩ上将葡萄风信子ＭａＭＹＢ２推导的氨
基酸序列与其他近２０种植物的蛋白序列进行
Ｂｌａｓｔｐ 比 对 分 析 表 明，ＭａＭＹＢ２ 与 矮 牵 牛
（ＡＡＦ６６７３０．１）的同源性最高，为８２％；与百合
（Ｌｉｌｉｕｍ　ｂｒｏｗｎｉｉ　ｖａｒ．ｖｉｒｉｄｕｌｕｍ）、耧斗菜（Ａｑｕｉｌｅ－
ｇｉａ　ｖｉｒｉｄｉｆｌｏｒａ）、夏堇（Ｔｏｒｅｎｉａ　ｆｏｕｒｎｉｅｒｉ）、苹果
（Ｍａｌｕｓ　ｐｕｍｉｌａ）、番茄（Ｌｙｃｏｐｅｒｓｉｃｏｎ　ｅｓｃｕｌｅｎｔｕｍ）、
草莓（Ｆｒａｇａｒｉａ×ａｎａｎａｓｓａ）、大丽花（Ｄａｈｌｉａ　ｐｉｎ－
ｎａｔａ）、扶桑花（Ｈｉｂｉｓｃｕｓ　Ｒｏｓａ－ｓｉｎｅｎｓｉｓ）等其他１８种
植物 ＭＹＢ转录因子的同源性都在４３％～８２％。对
葡萄风信子 ＭａＭＹＢ２蛋白序列分析发现，在保守
域上具有典型 ＨＴＨ 结构可与ＤＮＡ相结合区域，
表明其很可能具有转录调控作用。进一步对多种植
物的基因进行了聚类 分析，发现其 与 矮 牵 牛
（ＡＡＦ６６７３０．１）、番茄属（ＡＣＴ３６６１０．１）等相关基因
关系最近，其次为陆地棉（Ｇｏｓｓｙｐｉｕｍ　ｈｉｒｓｕｔｕｍ）、可
可树（Ｔｈｅｏｂｒｏｍａ　ｃａｃａｏ）等，但在拟南芥上没有发现
与之高度同源的基因，可能是由于葡萄风信子作为
单子叶植物与双子叶植物拟南芥亲缘关系差别大
所致。
８１ 西北林学院学报 ３０卷　
氨基酸序列相同的部分用黑色阴影表示；相近的部分用灰色阴影表示；黑色三角标示差异氨基酸。
图３　ＭａＭＹＢ２与其他植物的 ＭＹＢ氨基酸序列比较
Ｆｉｇ．３　Ａｍｉｎｏ　ａｃｉｄ　ｓｅｑｕｅｎｃｅ　ａｌｉｇｎｍｅｎｔ　ａｍｏｎｇ　ＭａＭＹＢ２ａｎｄ　ＭＹＢ　ｐｒｏｔｅｉｎｓ　ｆｒｏｍ　ｏｔｈｅｒ　ｐｌａｎｔ　ｓｐｅｃｉｅｓ
图４　ＭａＭＹＢ２蛋白与其他物种的 ＭＹＢ蛋白的系统进化树，圆形标记处为 ＭａＭＹＢ２
Ｆｉｇ．４　Ｐｈｙｌｏｇｅｎｅｔｉｃ　ｔｒｅｅ　ｏｆ　ＭａＭＹＢ２ｐｒｏｔｅｉｎ　ａｎｄ　ＭＹＢ　ｐｒｏｔｅｉｎｓ　ｆｒｏｍ　ｏｔｈｅｒ　ｓｐｅｃｉｅｓ
９１第２期 李志根 等：葡萄风信子转录因子ＭａＭＹＢ２的克隆及表达模式分析
２．３　ＭａＭＹＢ２蛋白的生物信息学分析
利用ＰｒｏｔＳｃａｌｅ分析，ＭａＭＹＢ２编码的蛋白亲
水性最大值２．１４４，位于第１３６位谷氨酸，最小值为
－２．９５６，位于第１０７位色氨酸。在整个肽链中亲水
性氨基酸残基比疏水性氨基酸残基多，由此推测葡
萄风信子 ＭａＭＹＢ２基因编码的蛋白为亲水性蛋
白。同时运用ＴＭｐｒｅｄ程序对ＭａＭＹＢ２编码的蛋
白的跨膜结构进行了预测，发现不具有跨膜螺旋结
构，表明该蛋白很有可能不会分布在细胞膜上，这与
转录因子基因在细胞核中表达并且起作用的性质相
一致，后续的亚细胞定位试验也印证了其分布位置。
ＳＯＰＭＡ预测的 ＭＹＢ蛋白二级结构结果表
明，ＭａＭＹＢ２编码的１９９个氨基酸残基中，α－螺旋
（Ａｌｐｈａ　ｈｅｌｉｘ）占２８．１４％，延伸链（Ｅｘｔｅｎｄ　ｓｔｒａｎｄ）
占１４．０７％，β－转角（Ｂｅｔａ　ｔｕｒｎ）６．５３％，无规则卷曲
（Ｒａｎｄｏｍ　ｃｏｉｌ）占５１．２６％。预测的蛋白质三级结构
中具有明显的螺旋－转角－螺旋结构（ＨＴＨ），同多
数报道的 ＭＹＢ转录因子结果相一致（图５）。
图５　ＭａＭＹＢ２蛋白的三级结构预测
Ｆｉｇ．５　Ｔｈｅ　ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ　ｐｒｅｄｉｃｔｉｏｎ　ｏｆ　ＭａＭＹＢ２ｐｒｏｔｅｉｎ
２．４　葡萄风信子 ＭａＭＹＢ２蛋白的亚细胞定位
利用ＰＳＯＲＴ Ⅱ Ｐｒｅｄｉｃｔｉｏｎ对 ＭａＭＹＢ２表达
产物进行了亚细胞定位预测，发现在细胞核中有定
位信号。为了确定其在细胞内的定位，构建了亚细
胞定位的表达载体ｐＢＩ２２１－ＭａＭＹＢ２－ＧＦＰ。利用
基因枪转化洋葱表皮细胞后在激光共聚焦显微镜下
观察，ｐＢＩ２２１－ＭａＭＹＢ２－ＧＦＰ融合蛋白定位于细胞
核中（图６）。
２．５　组织中的表达特性分析
利用实时定量ＰＣＲ对 ＭａＭＹＢ２在不同组织
中的表达情况进行分析。结果表明，在根、茎、叶以
及各个时期花组织中都检测到 ＭａＭＹＢ２的表达，
在花中的表达量较高。而就花的不同发育时期而
言，其表达量也不相同，其中，Ｓ５表达量最高，Ｓ１表
达量最低，且从Ｓ１～Ｓ５随着花发育ＭａＭＹＢ２表达
量逐渐升高（图７），与花发育阶段具有明显的正相
关，且与花色由浅及深的表型相一致（图７），此外，
花组织的各个时期均高于根、茎、叶中的表达。
绿色荧光显示靶蛋白的位置
图６　ＭａＭＹＢ２蛋白的亚细胞定位
Ｆｉｇ．６　Ｓｕｂｃｅｌｕｌａｒ　ｌｏｃａｌｉｚａｔｉｏｎ　ｏｆ　ＭａＭＹＢ２ｐｒｏｔｅｉｎ
葡萄风信子花发育各个时期，依次为Ｓ１，Ｓ２，Ｓ３，Ｓ４，Ｓ５。
图７　ＭａＭＹＢ２在不同组织和不同花时期中的表达特性
Ｆｉｇ．７　Ｒｅｓｕｌｔ　ｏｆ　ｇｅｎｅ　ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ　ｉｎ　ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ　ｔｉｓｓｕｅｓ
ａｎｄ　ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ　ｓｔａｇｅ　ｏｆ　ｆｌｏｗｅｒｓ
３　结论与讨论
转录因子也称反式作用因子，是指能够与基因
启动子区域中顺式作用元件发生特异性相互作用的
ＤＮＡ结合蛋白，通过它们之间以及与其他相关蛋白
之间的相互作用激活或抑制某些基因的转录。通过
前期 对 花 瓣 组 织 转 录 组 的 测 序 结 果 筛 选 出
ＭａＭＹＢ２基因，克隆全长并对其做序列和表达特性
分析。
本试验中，我们克隆到了１个ＭＹＢ转录因子，具
有典型的螺旋－转角－螺旋结构，在ＤＮＡ结合域中
具有高度保守的色氨酸残基。全长７１１ｂｐ，开放阅读
框为６００ｂｐ，编码１９９个氨基酸，与已知物种的ＭＹＢ
保守结构域的比对结果表明，ＭａＭＹＢ２基因与已知
的Ｒ２Ｒ３－ＭＹＢ有很高的同源性。蛋白生物信息学分
析表明其为亲水性蛋白，不具有跨膜结构。
０２ 西北林学院学报 ３０卷　
此外，有报道称在调节花色素生物合成中的
Ｒ２Ｒ３－ＭＹＢ转录因子与 ＢＨＬＨ 转录因子密切相
关。Ｗｅｉｓｓ　Ｄ［１７］等认为，Ｒ２Ｒ３－ＭＹＢ转录因子往往
与ＢＨＬＨ转录因子相互作用形成转录复合物，共同
调节生物体内花青素的合成。例如金鱼草Ｒｏｓｅａ１，
Ｒｏｓｅａ２和Ｖｅｎｏｓａ　ＭＹＢｓ［１８］，玉米的ＺｍＣ１　ＭＹＢ和
ＺｍＢ　ｂＨＬＨ，以及矮牵牛的ＡＮ２和ＡＮ１／ＪＡＦ１３
ｂＨＬＨｓ等［１９］。这些 ＭＹＢ 转录因子都需要与
ＢＨＬＨ形成二聚体的形式来发挥其调节功能。而
ＭａＭＹＢ２基因在保守域内存在着一个与ＢＨＬＨ蛋
白结合的结构域，由此可推断，ＭａＭＹＢ２在起调控
功能的时候，可能需要与ＢＨＬＨ蛋白的结合，才能
发挥或更好地起到转录调节的作用。
为了阐明克隆到的转录因子的表达部位，构建
了ＰＢＩ２２１－ＭＹＢ－ＧＦＰ融合质粒，基因枪法转化洋葱
表皮细胞激光共聚焦显微镜下观察，绿色荧光出现
在细胞核中，表明该基因定位于细胞核中，确实在细
胞核中行使转录调控的功能。
实时定量ＰＣＲ分析结果表明，ＭａＭＹＢ２在花
中的表达高于其他组织，且随着花发育，花色不断加
深，ＭａＭＹＢ２的表达量也有着显著的升高，因此推
测，ＭａＭＹＢ２可能是在花中起着表达调控功能，并
与花青素的合成相关，与苜蓿属中的有关报道相一
致［２０］。
通过前期的筛选以及序列和表达模式的分析，
推测ＭａＭＹＢ２基因可能是在葡萄风信子的花中起
调控功能，且有可能与花青素的合成相关。没有转
化目标植物进行基因功能验证是本试验的不足。下
一步，构建植物表达载体，寻找相互作用的ＢＨＬＨ
转录因子是以后的工作重点。
参考文献：
［１］　ＤＯＵＳＳＩ　Ｍ　Ａ，ＴＨＡＮＯＳ　Ｃ　Ａ．Ｅｃｏｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ　ｏｆ　ｓｅｅｄ　ｇｅｒｍｉ－
ｎａｔｉｏｎ　ｉｎ　Ｍｅｄｉｔｅｒｒａｎｅａｎ　ｇｅｏｐｈｙｔｅｓ．１．Ｍｕｓｃａｒｉ　ｓｐｐ［Ｊ］．Ｓｅｅｄ
Ｓｃｉｅｎｃｅ　Ｒｅｓｅａｒｃｈ，２００２，１２（３）：１９３－２０１．
［２］　马春雷，姚明哲，王新超，等．茶树２个 ＭＹＢ转录因子基因的
克隆与表达分析［Ｊ］．林业科学，２０１２，４８（３）：３１－３７．
［３］　ＳＴＲＡＣＫＥ　Ｒ，ＷＥＲＢＥＲ　Ｍ，ＷＥＩＳＳＨＡＡＲ　Ｂ．Ｔｈｅ　Ｒ２Ｒ３－
ＭＹＢ　ｇｅｎｅ　ｆａｍｉｌｙ　ｉｎ　Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ　ｔｈａｌｉａｎａ［Ｊ］．Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．
Ｐｌａｎｔ　Ｂｉｏｌ．，２００１（４）：４４７－４５６．
［４］　ＪＩＮ　Ｈ，ＭＡＲＴＩＮ　Ｃ．Ｍｕｌｔｉｆｕｎｃｔｉｏｎａｌｉｔｙ　ａｎｄ　ｄｉｖｅｒｓｉｔｙ　ｗｉｔｈｉｎ
ｔｈｅ　ｐｌａｎｔ　ＭＹＢ－ｇｅｎｅ　ｆａｍｉｌｙ［Ｊ］．Ｐｌａｎｔ　Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，１９９９，４１：
５７７－５８５．
［５］　ＲＯＳＩＮＳＫＩ　Ｊ　Ａ，ＡＴＣＨＬＥＹ　Ｗ　Ｒ．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ　ｏｆ　ｔｈｅ
Ｍｙｂ　ｆａｍｉｌｙ　ｏｆ　ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ　ｆａｃｔｏｒｓ：ｅｖｉｄｅｎｃｅ　ｆｏｒ　ｐｏｌｙｐｈｙｌｅｔｉｃ
ｏｒｉｇｉｎ［Ｊ］．Ｊ．Ｍｏｌ．Ｅｖｏｌ．，１９９８，４６：７４－８３．
［６］　ＰＡＺ－ＡＲＥＳ　Ｊ，ＧＨＯＳＡＬ　Ｄ，ＷＩＥＮＡＮＤ　Ｕ，ｅｔ　ａｌ．Ｔｈｅ　ｒｅｇｕ－
ｌａｔｏｒｙ　ｃ１ｌｏｃｕｓ　ｏｆ　ｅｎｃｏｄｅｓ　ａ　ｐｒｏｔｅｉｎ　ｗｉｔｈ　ｈｏｍｏｌｏｇｙ　ｔｏ　ｍｙｂ　ｐｒｏ－
ｔｏ－ｏｎｃｏｇｅｎｅ　ｐｒｏｄｕｃｔｓ　ａｎｄ　ｗｉｔｈ　ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ　ｓｉｍｉｌａｒｉｔｉｅｓ　ｔｏ　ｔｒａｎ－
ｓｃｒｉｐｔｉｏｎａｌ　ａｃｔｉｖａｔｏｒｓ［Ｊ］．ＥＭ－ＢＯ　Ｊ．，１９８７，６（１２）：３５５３－３５５８．
［７］　ＬＯＧＵＥＲＩＣＯ　Ｌ　Ｌ，ＺＨＡＮＧ　Ｊ　Ｑ，ＷＩＬＫＩＮＳ　Ｔ　Ａ．Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌ
ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ　ｏｆ　ｓｉｘ　ｎｏｖｅｌ　ＭＹＢ－ｄｏｍａｉｎ　ｇｅｎｅｓ　ｄｅｆｉｎｅｓ　ｔｗｏ　ｄｉｓｔｉｎｃｔ
ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ　ｐａｔｔｅｒｎｓ　ｉｎ　ａｌｏｔｅｔｒａｐｌｏｉｄ　ｃｏｔｔｏｎ（Ｇｏｓｓｙｐｉｕｍ　ｈｉｒｓｕ－
ｔｕｍＬ．）［Ｊ］．Ｍｏｌ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔ，１９９９，２６１（４－５）：６６０－６７１．
［８］　ＥＳＰＬＥＹ　Ｒ　Ｖ，ＨＥＬＬＥＮＳ　Ｒ　Ｐ，ＰＵＴＴＥＲＩＬＬ　Ｊ，ｅｔ　ａｌ．Ｒｅｄ
ｃｏｌｏｕｒａｔｉｏｎ　ｉｎ　ａｐｐｌｅ　ｆｒｕｉｔ　ｉｓ　ｄｕｅ　ｔｏ　ｔｈｅ　ａｃｔｉｖｉｔｙ　ｏｆ　ｔｈｅ　ＭＹＢ
ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ　ｆａｃｔｏｒ，ＭｄＭＹＢ１０［Ｊ］．Ｔｈｅ　Ｐｌａｎｔ　Ｊｏｕｒｎａｌ，２００７，
４９：４１４－４２７．
［９］　ＢＡＮ　Ｙ，ＨＯＮＤＡ　Ｃ，ＨＡＴＳＵＹＡＭＡ　Ｙ，ｅｔ　ａｌ．Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ　ａｎｄ
ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ　ａｎａｌｙｓｉｓ　ｏｆ　ａ　ＭＹＢｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ　ｆａｃｔｏｒ　ｇｅｎｅ　ｔｈａｔ　ｉｓ　ａ
ｋｅｙ　ｒｅｇｕｌａｔｏｒ　ｆｏｒ　ｔｈｅ　ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ　ｏｆ　ｒｅｄ　ｃｏｌｏｒａｔｉｏｎ　ｉｎ　ａｐｐｌｅ
ｓｋｉｎ［Ｊ］．Ｐｌａｎｔ　ａｎｄ　Ｃｅｌ　Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ，２００７，４８：９５８－９７０．
［１０］　ＮＡＫＡＴＳＵＫＡ　Ｔ，ＨＡＲＵＴＡ　Ｋ　Ｓ，ＰＩＴＡＫＳＵＴＨＥＥＰＯＮＧ
Ｃ，ｅｔ　ａｌ．Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ　ａｎｄ　ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ　ｏｆ　Ｒ２Ｒ３－ＭＹＢ
ａｎｄ　ｂＨＬＨ　ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ　ｆａｃｔｏｒｓ　ｒｅｇｕｌａｔｉｎｇ　ａｎｔｈｏｃｙａｎｉｎ　ｂｉｏ－
ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ　ｉｎ　ｇｅｎｔｉａｎ　ｆｌｏｗｅｒｓ［Ｊ］．Ｐｌａｎｔ　ａｎｄ　Ｃｅｌ　Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ，
２００８，４９：１８１８－１８２９．
［１１］　ＹＡＭＡＧＩＳＨＩ　Ｍ，ＳＨＩＭＯＹＡＭＡＤＡ　Ｙ，ＮＡＫＡＴＳＵＫＡ　Ｔ，
ｅｔ　ａｌ．Ｔｗｏ　Ｒ２Ｒ３－ＭＹＢ　ｇｅｎｅｓ，ｈｏｍｏｌｏｇｓ　ｏｆ　ｐｅｔｕｎｉａ　ＡＮ２，
ｒｅｇｕｌａｔｅ　ａｎｔｈｏｃｙａｎｉｎ　ｂｉｏｓｙｎｔｈｅｓｅｓ　ｉｎ　ｆｌｏｗｅｒ　ｔｅｐａｌｓ，ｔｅｐａｌ
ｓｐｏｔｓ　ａｎｄ　ｌｅａｖｅｓ　ｏｆ　ａｓｉａｔｉｃ　ｈｙｂｒｉｄ　ｌｉｌｙ［Ｊ］．Ｐｌａｎｔ　ａｎｄ　Ｃｅｌ　Ｐｈｙｓ－
ｉｏｌｏｇｙ，２０１０，５１：４６３－４７４．
［１２］　ＸＩＡＯ　Ｗ　Ｌ，ＪＩＮＧ　Ｗ　Ｌ，ｅｔ　ａｌ．Ａ　Ｒ２Ｒ３－ＭＹＢ　ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ
ｆａｃｔｏｒ，ＧｍＭＹＢ１２Ｂ２，ａｆｆｅｃｔｓ　ｔｈｅ　ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ　ｌｅｖｅｌｓ　ｏｆ　ｆｌａ－
ｖｏｎｏｉｄ　ｂｉｏｓｙｎｔｈｅｓｉｓ　ｇｅｎｅｓ　ｅｎｃｏｄｉｎｇ　ｋｅｙ　ｅｎｚｙｍｅｓ　ｉｎ　ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ
ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ　ｐｌａｎｔｓ［Ｊ］．２０１３，５３２：７２－７９．
［１３］　ＹＵＮ　Ｆ　Ｌ，ＱＩＮＧ　Ｔ　Ｌ，ｅｔ　ａｌ．Ｓｏｙｂｅａｎ　ＧｍＭＹＢ７３ｐｒｏｍｏｔｅｓ
ｌｉｐｉｄ　ａｃｃｕｍｕｌａｔｉｏｎ　ｉｎ　ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ　ｐｌａｎｔｓ　ＢＭＣ［Ｊ］．Ｐｌａｎｔ　Ｂｉｏｌｏ－
ｇｙ，２０１４，１４：７３．
［１４］　张雯，周存田，王飞，等．葡萄风信子器官和体胚发生的解剖及
生理特性研究［Ｊ］．西北林学院学报，２０１３，２８（４）：３２－３７．
［１５］　张浩，韩崇选，郑雪莉，等．草兔卵透明带３（ＺＰ３）基因的克隆
与序列分析［Ｊ］．西北林学院学报，２０１３，２８（６）：６３－６８．
［１６］　ＳＣＨＷＩＮＮ　Ｋ，ＶＥＮＡＩＬ　Ｊ，ＳＨＡＮＧ　Ｙ　Ｊ，ｅｔ　ａｌ．Ａ　ｓｍａｌ　ｆａｍ－
ｉｌｙ　ｏｆ　ＭＹＢ－ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ　ｇｅｎｅｓ　ｃｏｎｔｒｏｌｓ　ｆｌｏｒａｌ　ｐｉｇｍｅｎｔａｔｉｏｎ　ｉｎ－
ｔｅｎｓｉｔｙ　ａｎｄ　ｐａｔｔｅｒｎｉｎｇ　ｉｎ　ｔｈｅ　ｇｅｎｕｓ　ａｎｔｉｒｒｈｉｎｕｍ［Ｊ］．Ｔｈｅ
Ｐｌａｎｔ　Ｃｅｌ，２００６，１８（４）：８３１－８５１．
［１７］　ＭＯＬ　Ｊ　Ｊ，ＳＣＨＡＦＥＲ　Ｅ，ＷＥＩＳＳ　Ｄ．Ｓｉｇｎａｌ　ｐｅｒｃｅｐｔｉｏｎ，ｔｒａｎｓ－
ｄｕｃｔｉｏｎ，ａｎｄ　ｇｅｎｅ　ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ　ｉｎｖｏｌｖｅｄ　ｉｎ　ａｎｔｈｏｃｙａｎｉｎ　ｂｉｏ－ｓｙｎ－
ｔｈｅｓｉｓ［Ｊ］．Ｃｒｉｔ．Ｒｅｖ．Ｐｌａｎｔ．Ｓｃｉ，１９９６，１５：５２５－５５７．
［１８］　ＧＯＦＦ　Ｓ　Ａ，ＣＯＮＥ　Ｋ　Ｃ，ＣＨＡＮＤＬＥＲ　Ｖ　Ｌ．Ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ　ａｎａｌ－
ｙｓｉｓ　ｏｆ　ｔｈｅ　ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎａｌ　ａｃｔｉｖａｔｏｒ　ｅｎｃｏｄｅｄ　ｂｙ　ｔｈｅ　ｍａｉｚｅ　Ｂ
ｇｅｎｅ：ｅｖｉｄｅｎｃｅ　ｆｏｒ　ａ　ｄｉｒｅｃｔ　ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ　ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎ　ｂｅｔｗｅｅｎ　ｔｗｏ
ｃｌａｓｓｅｓ　ｏｆ　ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ　ｐｒｏｔｅｉｎｓ［Ｊ］．Ｇｅｎｅｓ　Ｄｅｖ．，１９９２（６）：８６４－
８７５．
［１９］　ＧＯＯＤＲＩＣＨ　Ｊ，ＣＡＲＰＥＮＴＥＲ　Ｒ，ＣＯＥＮ　Ｅ　Ｓ．Ａ　ｃｏｍｍｏｎ
ｇｅｎｅ　ｒｅｇｕｌａｔｅｓ　ｐｉｇｍｅｎｔａｔｉｏｎ　ｐａｔｔｅｒｎ　ｉｎ　ｄｉｖｅｒｓｅ　ｐｌａｎｔ　ｓｐｅｃｉｅｓ
［Ｊ］．Ｃｅｌ，１９９２，６８：９５５－９６４．
［２０］　Ｅｌ－ＫＥＲＥＡＭＹ　Ａ，ＢＩ　Ｙ　Ｍ，ＲＡＮＡＴＨＵＮＧＥ　Ｋ，ｅｔ　ａｌ．Ｔｈｅ
ｒｉｃｅ　Ｒ２Ｒ３－ＭＹＢ　ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ　ｆａｃｔｏｒ　ＯｓＭＹＢ５５ｉｓ　ｉｎｖｏｌｖｅｄ　ｉｎ
ｔｈｅ　ｔｏｌｅｒａｎｃｅ　ｔｏ　ｈｉｇｈ　ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ　ａｎｄ　ｍｏｄｕｌａｔｅｓ　ａｍｉｎｏ　ａｃｉｄ
ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ［Ｊ］．ＰＬＯＳ　Ｏｎｅ，２０１２，７（１２）：２０－３０．
１２第２期 李志根 等：葡萄风信子转录因子ＭａＭＹＢ２的克隆及表达模式分析