全 文 ：收稿日期:2007-01-20
基金项目:北京市花卉重点项目(YLHH2006001)
作者简介:孙晓梅(1970-),女,沈阳农业大学副教授,博士,从事花卉遗传育种研究。*通讯作者 Corespondingauthor:罗凤霞(1958-),女,金陵科
技学院研究员,硕士,从事花卉育种和植物组织培养研究。
东方百合杂交种胚囊发育与双受精过程细胞学观察
孙晓梅 1,王 晶 1,罗凤霞 2*,杨宏光 1,李智辉 1
(1.沈阳农业大学 林学院,沈阳 110161;2.金陵科技学院 园艺学院,南京 210038)
摘要:以东方百合索蚌(Sorbonne)和元帅(Acapulca)为试材,采用石蜡切片法和荧光显微技术研究其胚囊发育,观察花粉管生长和
双受精过程,研究适合百合的授粉及进行胚抢救的时期。结果表明:百合大孢子的发育形式为贝母型,其胚囊发育最终形成育性正
常的7细胞胚囊,-2级的胚囊已经发育成熟,适宜授粉受精。异花授粉后花粉管 3～5d到达胚囊,并释放出 2个精核进行双受精。
百合胚胎发育经过合子、原胚、球形胚、子叶型最终发育成熟。胚乳发育与胚胎同步,属于核型胚乳,在形成球形胚后胚乳细胞逐渐
形成细胞壁。授粉后45d进行胚抢救较好。
关键词:百合;石蜡切片法和荧光显微技术;胚囊发育;花粉管生长;双受精
中图分类号:S682.2 文献标识码:A 文章编号:1000-1700(2008)02-0165-04
ObservationoftheDevelopmentofEmbryoSacandDoubleFertilization
ofOrientalLilyHybrids
SUNXiao-mei1,WANGJing1,LUOFeng-xia2*,YANGHong-guang1,LIZhi-hui1
(1.ColegeofForestry,ShenyangAgriculturalUniversity,Shenyang110161,China;
2.ColegeofHorticulture,JinlingInstituteofTechnology,Nanjing210038,China)
Abstract:Astudywasconductedondevelopmentofembryosac,polentubegrowthanddoublefertilizationprocessinoriental
lilySorbonneandAcapulca,usingthemethodofparafinsectionandfluorescentmicroscope,tofindthesuitableperiodofpoli-
nationandembryorescue.Thedevelopmentofmegasporewasfritilarytype;theembryosachadsevencelsatlast,and-2
embryosac,becamemature.Aftercross-polinate3~5days,thepolentubesrantotheembryosacreleasedthecontentswith
twosperms,andbegantodoublefertilization.Liliumembryobecamematureaftertheprocessofzygote,proembryo,globularem-
bryo,cotyledonembryo.Meanwhile,fertilizepolarnucleuswentintonucleartypeendosperm,itgrewwalsuntilglobularstage
formed.Thesuitableperiodofembryorescuewas45dafterpolination.
Keywords:Lilium;parafinsectionandfluorescentmicroscope;developmentofembryosac;polentubegrowth;doublefertilization
杂交育种是获得百合新品种的重要途径,百合品种间杂交能否成功与父母本之间的亲缘关系远近、胚囊
发育状况、雄配子育性、授粉受精方式等多因子有关。有关百合胚囊的发育,国内外已有研究报道。对百合胚囊
发育和花粉在柱头上的萌发、花粉管生长的观察,前人多采用切片法和电镜或荧光显微技术[1-4]。研究发现,不
同成熟度的雌蕊对百合植株结实性有影响,表现为Liliumrubelum的-3,-1,0级花,自交授粉都能形成带有种
子的果实,但延迟授粉可有效克服百合自交不亲和性,将花开后的天数划为+1,+3,+5,L.speciosum+5级别的
花形成少量种子,L.longiflorum没有形成带种子的果实[4,5]。尽管关于植物胚囊发育、受精过程的报道很多[6-12],
可是如何从外部形态上判断雌蕊中胚囊的发育时期、雌蕊发育时期与接收花粉中精核的能力以及授粉受精后
胚胎的发育过程,国内外在百合这方面研究的较少。本试验以百合科百合属的2个东方百合杂交种为试材,拟
观察百合的胚囊发育与双受精过程,确定最佳胚抢救时期,以期为百合发育生物学以及遗传育种的研究提供
参考。
1 材料与方法
1.1 材料
试验于2005年6月在北京市农林科学院进行。供试东方百合杂交种索蚌(Sorbonne)和元帅(Acapulca)采自
北京市农林科学院蔬菜研究中心温室。
沈阳农业大学学报,2008-04,39(2):165-168
JournalofShenyangAgriculturalUniversity,2008-04,39(2):165-168
第39卷沈 阳 农 业 大 学 学 报
表 1索蚌百合子房外部形态
Table1Theovaryexternalform ofSorbonne
级别Level
-14～-16
-11～-13
-6～-10
-3～-5
0～-2
花蕾长度Lengthofbuds/cm
4.5±0.5
5.1±0.5
5.8±0.5
8.6±0.5
10±0.5
蕾色Colorofbuds
绿色Green
绿色Green
浅绿色 Lightgreen
粉白色White-pink
粉红色 Pink
子房长度Lengthofovary/cm
1.3±0.2
1.6±0.2
1.8±0.2
2.0±0.3
2.3±0.3
1.2 方法
1.2.1 胚囊形成过程及子房外部形态观察 设开花当天的花蕾为 0级,开花前1d的花蕾为-1级,以此类推。
取开-16~0级的索蚌花蕾,剥取胚珠,采样后用改良卡诺固定液固定,石蜡切片观察;测定百合花蕾长度和子房
长度,观察蕾色。
1.2.2 花粉管萌发至受精过程观察 以开花当天的索蚌为母本,元帅为父本进行杂交授粉,授粉后4,8,48,96,120h
取样,采用卡诺固定液固定雌蕊,苯胺蓝染色[13],采用OLYMPUS荧光显微镜观察花粉管生长情况。
1.2.3 合子形成至胚形成过程观察 授粉10d后,每隔5d取子房用改良卡诺固定液固定。爱氏苏木精与番红对
染,采用石蜡切片法制片,切片厚度8~12μm,中性树胶封片,采用OLYMPUS显微镜观察,并用数码相机照相[13]。
2 结果与分析
2.1 百合子房的外部形态与内部胚囊的发育
从表1和图版Ⅰ可以看出,百合花蕾为-16级时,胚珠原基为凸起的一团珠心组织,但由于珠心组织左右
生长不均衡,左侧生长快于右侧,使之向右弯曲,以后将发育为倒生胚珠。在珠被发育的同时,珠心中产生一个
孢原细胞,其与周围的珠心细胞显著不同,即细胞较大,细胞核大而明显,细胞质液泡化程度低(图版Ⅰ-1)。孢
原细胞再经分裂分化,或直接增大形成胚囊母细胞(-12~-10级),胚囊母细胞只被一层珠心表皮层包被着,位
于珠心外层,故属薄珠心类型。珠心组织基部内、外珠被已先、后发生,珠柄开始弯曲生长,形成倒生胚珠。大孢
子母细胞已开始减数分裂的第1次分裂(-9级),核质内已出现染色体(图版Ⅰ-2)。大孢子母细胞(2n)经过一
次分裂(-7~-9级),形成了2个单倍体子核,即二分体时期。二分体再次分裂形成4个单倍染色体数目的大孢
子,即四分体时期。其中3个大孢子核靠近合点端,1个大孢子核位于珠孔端(图版Ⅰ-3)。百合属于四孢子胚
囊,合点端的3个大孢子核的纺锤体相互融合形成一个三倍体的大纺锤体,经过有丝分裂后三倍体的大纺锤体
分裂终结形成2个三倍体的大核,1个单倍体的小纺锤体分裂为2个单倍体小核,其再经过一次有丝分裂所形
成,即雌配子体。其中含4个三倍体的大核即大极核和3个反足细胞核,下方是4个单倍体小核,即小极核和卵
器的3个细胞核(-5~-3级)(图版Ⅰ-4)。在成熟的胚囊中,珠孔端由2个助细胞和1个卵细胞组成卵器,在胚
囊合点端是3个反足细胞(-2~0级)(图版Ⅰ-5)。
2.2 双受精过程、合子的形成与胚的发育
百合的卵细胞与其中一个精子结合后发育为合子(图版Ⅰ-6),合子要经过一个短暂的休眠期,当胚乳大量
生长、积累了足够的供胚发育的营养时,合子胚才分裂。授粉后15～20d,合子第1次分裂,形成上下2个细胞。
靠近珠孔端的为基细胞,远离珠孔端的为顶细胞,此为2细胞原胚。顶细胞和基细胞同时进行第2次横裂形成
直线形的四细胞原胚,之后分裂为八细胞原胚,八细胞原胚进行平周分裂,进一步分裂成球形胚。索蚌授粉后
35d,进入球形胚阶段,基细胞横向分裂最终形成胚柄细胞,顶细胞不断分裂形成胚体(图版Ⅰ-7)。授粉后45d,
胚的顶端开始伸长生长,即子叶开始发生,产生1片顶生子叶(图版Ⅰ-8)。胚进一步发育,分化出胚芽、胚根、胚
轴和子叶,并产生细胞化胚乳,胚体的器官和组织分化大约需70d完成,发育成成熟胚(图版Ⅰ-9、图版Ⅰ-10)。
2.3 花粉管萌发及生长
授粉后4~8h,花粉在柱头上可以萌发,紫外光激发下可见花粉管出现荧光(图版Ⅰ-11),先萌发的花粉管已
伸进花柱组织上端。授粉后48h,花粉管伸长达到整个花柱组织长度的中部位置,授粉后96h,花粉管已经穿过花
柱到达子房1/4~1/2处,授粉后120h,花粉管到达子房3/4或底部,通过珠孔进入到胚囊受精(图版Ⅰ-12)。
2.4 胚乳的发育
索蚌和元帅杂交授粉后,极核与精核融合形成初生胚乳,初生胚乳很快分裂,游离胚乳经常由胚囊侧壁经合
166· ·
第2期
图版Ⅰ1.已分化出孢原细胞的珠心结构;2.大孢子母细胞的第1次减数分裂;3.四个大孢子;4.雌配子体5.成熟的七细胞胚囊;6.受精后合子形成;
7.球形胚初期;8.子叶型胚;9.细胞化胚乳;10.成熟胚;11.花粉在柱头上萌发;12.花粉管到达胚珠
PlateⅠ1.Constructionofnuceluswherearchesporialcelhasbeendiferentiated;2.Thefirststepofmeiosisofmegasporocyte;3.Fourmegaspore;
4.Femalegemetophyic;5.Matureembryosac;6.Zygoteafterfertilization;7.Earlierstageofglobularembryo;8.Cotyledonembryo;9.Celular
endosperm;10.Matureembryo;11.Germinationofpolensonstigma;12.Polentubereachingtheovary
点端向另一侧移动,边移动边不停分裂,胚囊内的空隙很快被呈游离状态的核所充满。授粉后10d,随着珠心细胞
的不断解体和胚囊的不断扩大,胚囊中央形成了一个大液泡,而胚乳核常常被挤到胚囊的周缘(图版Ⅰ-6)。当胚
胎发育到球形胚后期(授粉后40~45d),游离核之间开始从珠孔端胚体周围向合点端,从胚囊周围向里面自由地
进行胚乳的细胞化(图版Ⅰ-9)。随着胚的发育,胚附近的胚乳不断解体,释放其内容物为胚提供营养。
3 结论与讨论
通过对索蚌的大孢子的发育时期进行观察,索蚌胚囊母细胞减数分裂至胚囊的发育成熟,没有发现异常情
况,最终形成育性正常的七细胞胚囊。百合的花蕾外部形态与胚囊的发育成正比关系,越接近成熟的花蕾,胚囊
发育的越成熟。本研究结果表明,可以通过对外部形态观测,确定适宜的授粉时间。-2级花蕾,其中的胚囊已经
发育成熟,适宜授粉受精。索蚌百合为母本,元帅为父本在开花当天进行人工授粉。同一时间进行人工授粉后,
不同部位子房内的胚珠受精顺序是有差别的,靠近花柱的上位胚珠较早,受精也早,而下位胚珠受精较晚。综合
胚囊成熟时期和花粉管生长情况,本研究认为,蕾期授粉最早可以提前到-5或-6级进行。在本试验中还观察
到,百合胚在发育到40～45d时处于球形胚阶段,因此授粉后45d进行胚抢救较好。观察到的索蚌百合胚比其他
的发育慢,可能和当年的外部环境因素有关。
前人研究表明,百合受精后,合子要经过一个短暂的休眠期,当胚乳大量生长、积累了足够的供胚发育的营
养时,合子胚才分裂[2]。利用组培的方法进行胚抢救时,建议在胚龄大于70d时进行离体培养,有利于胚成活。百
合的胚乳属于核型胚乳,胚乳的发育过程观察到的结果与刘穆[14]的观点一致。百合合子形成前,卵细胞与精子
的融合与极核与精子的融合时胚囊内的变化及其时间的确定,极核与精核融合最初形成初生胚乳阶段的时间
和分裂状态有待于进一步研究。
孙晓梅等:东方百合杂交种胚囊发育与双受精过程细胞学观察 167· ·
第39卷沈 阳 农 业 大 学 学 报
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[责任编辑 马迎杰]
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