全 文 ：收稿日期:2012 － 06 － 17
基金项目:国家自然科学基金(编号:30860161) ;云南省教育厅科学研
究基金(编号:2011 Y 212)。
作者简介:陈名红(1974 －) ，男(土家族) ，在读博士生，副教授，研究方
向:植物分子生物学;E-mail:cmhkm@ yahoo． com． cn。
通讯作者:李成云(1964 －) ，男，博士，教授，研究方向:植物分子生物
学;E-mail:li． chengyun@ gmail． com。
百合属 RAPD反应条件优化的研究
陈名红1，2， 刘 多1， 李 玉1， 王文亚1， 李成云2
(1．云南民族大学民族药资源化学国家民委-教育部重点实验室， 昆明 650031;
2．云南农业大学农业生物多样性与病虫害控制教育部重点实验室， 昆明 650201)
摘要:以百合 DNA为材料，对影响其 RAPD反应体系中的 6 个主要因素(模板 DNA、Mg2 +、TaqDNA聚合酶、引物、dNTPs、
退火温度)进行优化，最终确定了百合 RAPD反应的最佳体系(25 μL)为:40 ng 模板 DNA，1． 5 mmol /L Mg2 +，1． 0 U Taq
DNA聚合酶，1． 0 μmol /L引物，200 μmol /L dNTPs，引物 E 13 的最适退火温度为 37． 3 ℃。该体系的建立为今后应用
RAPD技术鉴定百合属植物的种质资源和遗传多样性研究奠定了基础。
关键词: 百合;RAPD;反应体系;优化
中图分类号: S 644． 1 文献标志码: A 文章编号: 1001 － 4705(2012)10-0009-04
Study on Optimization of RAPD Reaction Conditions for Lilium
CHEN Ming-hong1，2，LIU Duo1，LI Yu1，WANG Wen-ya1，LI Cheng-yun2
(1． Key Laboratory of Ethnic Medicine Resource Chemistry，State Ethnic Affairs Commission ＆ Ministry
of Education，Yunnan University of Nationalities，Kunming 650031，China;
2． Key Laboratory of the Ministry of Educational for Agro-biodiversity and Pests Control，
Yunnan Agricultural University，Kunming 650201，China)
Abstract:The optimum RAPD reaction system for Lilium was established using RAPD amplification with six
factors (DNA template，Mg2 +，TaqDNA polymerase，primer，dNTPs and annealing temperature)． The optimum
RAPD reaction system (25 μL)contains 40 ng DNA template，1． 5 mmol /L Mg2 +，1． 0 U TaqDNA polymerase，
1． 0 μmol /L RAPD primer and 200 μmol /L dNTPs． The suitable annealing temperature of primer E 13 was
37． 3 ℃ ． The research laid the foundation for RAPD analysis on studies of germplasm resources identification
and genetic diversity in Lilium．
Key words: Lilium;RAPD;reaction system;optimization
百合(Lilium spp．)是单子叶植物亚纲百合科
(Liliaccae)百合属(Lilium)植物的总称，为多年生鳞茎
草本植物，是一种集药用、食用及观赏于一体的花卉。
中国百合分布广、种类多且生态习性各异，据调查，约
有 47 个种 18 个变种，占世界百合总数的 50%以上，
其中有 36 个种 15 个变种为中国所特有;中国也是世
界百合起源的中心，药用、食用和观赏百合的栽培历史
十分悠久，早在 1 400 多年以前就有人工栽培的记
载［1］。RAPD是美国的 Williams 与 Welsh 两个研究小
组于 1990 年同时提出的一种 DNA分子标记技术［2，3］。
RAPD技术建立在 PCR 技术基础上，用一系列(通常
数百个)不同的随机排列碱基序列的寡核苷酸单链
(一般为 8 ～ 10 bp)作为引物，对所研究的基因组 DNA
进行单引物扩增，然后用凝胶电泳分离扩增片段，经染
色来显示扩增 DNA片段的多态性，扩增片段多态性反
映了基因组相应区域的 DNA 多态性［4］。相对于传统
的酶学、RFLP 等方法，RAPD 标记具有操作快速、简
便、多态性丰富、适应性广等诸多优点，现已广泛应用
于遗传图谱构建、基因定位，特别是遗传多样性的检
测［5］。但 RAPD标记也存在某些不足，其中最主要的
是其受反应条件影响较大，检测的重复性较差［6］，使
得不同研究者的研究结果难以比较，因此，建立一个稳
定性好、可重复性高的适合百合属植物的 RAPD-PCR
反应体系对于 RAPD技术在百合属植物研究中的应用
至关重要。本研究利用单因素实验方法优化百合
RAPD-PCR扩增体系，以期为 RAPD 标记技术在百合
属植物的种质资源和遗传多样性等研究奠定良好
基础。
·9·
研究报告 陈名红 等:百合属 RAPD反应条件优化的研究
DOI:10.16590/j.cnki.1001-4705.2012.10.043
1 材料与方法
1． 1 材 料
以观赏百合“黄天霸”为实验材料，采取新鲜幼嫩
无病虫害的叶片，放入塑料封口袋，硅胶干燥后备用。
1． 2 基因组 DNA提取与检测
采用改良的 CTAB 法提取基因组 DNA，具体步骤
为:取 0． 2 g硅胶干燥的叶片，在液氮中迅速研磨成细
粉末后转入 1． 5 mL 离心管中;加入 600 μL 65 ℃预热
的 2 × CTAB 提取缓冲液(2% CTAB，W/V，1． 4 mol /L
NaCl，20 mmol /L EDTA，pH 8． 0，100 mmol /L Tris-HCl，
pH 8． 0，2% β-巯基乙醇 V /V) ，迅速混匀，置于 65 ℃水
浴 1 h，期间每隔几分钟摇动 1 次;冷却，4 ℃12 000 r /
min离心 10 min;取上清液，加入等体积的氯仿 ∶ 异戊
醇(24 ∶ 1) ，振荡混匀 10 min;12 000 r /min离心10 min;
取上清液，加入 3 /4 体积的异丙醇，混匀后 － 20 ℃静
置 30 min;10 000 r /min 离心 5 min，70%乙醇洗 3 次;
自然风干后加 30 ～ 50 μL 1 × TE(10 mmol /L Tris-HCl，
1 mmol /L EDTA) ，室温静置 2 h，使 DNA充分溶解;每
管内加 1 mg /mL的 RNA酶 1 μL，37 ℃下消化 30 min，
65 ℃水浴处理 10 min使酶失活，－ 20 ℃保存备用。
取 2 μL DNA样品加 1 μL GoldView 核酸染料，在
1． 0%琼脂糖凝胶上，于 3 ～ 5 V /cm的电场中电泳 1 h，
在凝胶成像系统中观察、照相。以 ddH2O 为对照，测
定 DNA样品在 260 nm 和 280 nm 波长下的 OD 值，并
计算二者的比值。
1． 3 单因子实验确定 RAPD-PCR的最佳反应体系
以叶片基因组 DNA为模板，单因子考察因素为模
板 DNA、Mg2 +、TaqDNA 聚合酶、引物、dNTPs 的量，随
机引物由上海生工生物工程技术服务有限公司合成，
经初步筛选，以引物 E 13(序列为 5CCCGATTCGG 3)
作为实验引物，对影响 PCR反应的因素进行最适条件
考察。对影响扩增的主要参数设置了不同梯度处理，
反应总体积为 25 μL，其中 DNA模板浓度设置 20、40、
60、80、100 ng 5 个梯度;Mg2 +浓度设置 0． 5、1． 0、1． 5、
2． 0、2． 5、3． 0 mmol /L 6 个梯度;TaqDNA 聚合酶设置
0． 5、1． 0、1． 5、2． 0、2． 5 U 5 个梯度;引物浓度设置 0． 2、
0． 4、0． 6、0． 8、1． 0、1． 2 μmol /L 6 个梯度;dNTPs 设
100、150、200、250、300 μmol /L 5 个梯度。根据 Tm 值
设定退火温度为 32． 1、32． 6、33． 5、34． 6、35． 9、37． 3、
38． 6、39． 9、41． 0、41． 9 ℃ 10 个梯度。合适条件确定
后将作为后续研究的一个条件。反应程序为:94 ℃预
变性 5 min，94 ℃变性 30 s，32． 1 ～ 41． 9 ℃复性 40 s，
72 ℃延伸 90 s，40 个循环，72 ℃延伸 10 min。RAPD-
PCR扩增产物在 1． 2%琼脂糖凝胶上，于 3 ～ 5 V /cm
的电场中电泳 1 h，在凝胶成像系统中观察、照相。
2 结果与分析
2． 1 模板 DNA浓度的选择
为确定适于百合属 RAPD-PCR 扩增的最佳模板
DNA浓度，本研究考察了 20、40、60、80、100 ng 5 个不
同浓度的模板量，在其它条件不变的情况下，只改变模
板 DNA 的用量，进行相同条件的 RAPD-PCR 扩增。
不同浓度模板 DNA 的 RAPD-PCR 扩增结果见图 1。
从图 1 可见，当模板 DNA量低于 20 ng时，扩增谱带较
弱;当模板量在 60 ng和 80 ng时，扩增谱带特别明亮，
但模糊难辨且有非特异性产物产生;当模板量大于
100 ng时，扩增出的带型又变得微弱;只有当模板量在
40 ng时，PCR扩增谱带最为清晰和整齐，因此百合属
RAPD-PCR扩增的最佳模板 DNA浓度应为 40 ng。
M:Marker DL 2 000;1 ～ 5:DNA模板分别为
20、40、60、80、100 ng，由 E 13 扩增。
图 1 不同浓度 DNA模板的 RAPD-PCR扩增结果
2． 2 Mg2 +浓度的调整
本实验分别以 0． 5、1． 0、1． 5、2． 0、2． 5、3． 0 mmol /L
6 个不同浓度的 Mg2 +对引物 E 13 进行了 RAPD-PCR
扩增。不同 Mg2 +浓度的 RAPD-PCR扩增结果见图 2。
图 2 显示，在其它条件均相同的情况下进行 RAPD-
PCR扩增时，当 Mg2 +浓度低于 1． 0 mmol /L时，无扩增
谱带出现;当 Mg2 +浓度在 1． 5 mmol /L 时，能产生较清
晰的 RAPD谱带;当 Mg2 +浓度高于 2． 0 mmol /L 时，虽
然也能产生较多的谱带但谱带模糊，稳定性较差且非
特异性谱带增多。因此百合属 RAPD-PCR 扩增的最
佳 Mg2 +浓度应为 1． 5 mmol /L。
2． 3 TaqDNA聚合酶的用量
为确定最佳 TaqDNA 聚合酶用量，本实验选择了
0． 5、1． 0、1． 5、2． 0、2． 5 U 共 5 个梯度进行 RAPD-PCR
·01·
第 31 卷 第 10 期 2012 年 10 月 种 子 (Seed) Vol． 31 No． 10 Oct． 2012
扩增的考察。不同单位 TaqDNA聚合酶的 RAPD-PCR
扩增结果见图 3。图 3 表明，在 25 μL 体系中，加入
1． 0 U TaqDNA酶就可以获得重现性好而又清晰的谱
带，而随着酶用量的不断加大，扩增的谱带也逐渐变得
越来越模糊且会出现一些非特异性谱带。鉴于 Taq
DNA酶的成本较高，所以在确保实验结果稳定可靠的
前提下，选择了 1． 0 U TaqDNA酶为最终的用量。
M:Marker DL 2 000;1 ～ 6:Mg2 +浓度分别为
0． 5、1． 0、1． 5、2． 0、2． 5、3． 0 mmol /L，由 E 13 扩增。
图 2 不同 Mg2 +浓度的 RAPD-PCR扩增结果
M:Marker DL 2 000;1 ～ 5:TaqDNA聚合酶分别为
0． 5、1． 0、1． 5、2． 0、2． 5 U，由 E 13 扩增。
图 3 不同单位 Taq DNA聚合酶的 RAPD-PCR扩增结果
2． 4 引物浓度的调整
实验共设置了 0． 2、0． 4、0． 6、0． 8、1． 0、1． 2 μmol /L
6 个引物浓度梯度，RAPD-PCR 扩增结果如图 4 所示。
图 4 表明，当引物浓度为 0． 2 μmol /L 时，无扩增谱带
出现;引物浓度为 0． 4、0． 6、0． 8、1． 2 μmol /L 时，扩增
谱带极弱难以识别;而当引物浓度为 1． 0 μmol /L 时，
扩增谱带清晰，亮度适宜，重现性好，是较为理想的浓
度，因此百合属 RAPD-PCR 扩增的最佳引物浓度为
1． 0 μmol /L。
M:Marker DL 2 000;1 ～ 6:引物浓度分别为
0． 2、0． 4、0． 6、0． 8、1． 0、1． 2 μmol /L。
图 4 引物(E 13)不同浓度的 RAPD-PCR扩增结果
2． 5 dNTPs浓度的选择
为了确定最适 dNTPs的用量，本实验设置了 100、
150、200、250、300 μmol /L 共 5 个 dNTPs 梯度进行筛
选，结果见图 5，当 dNTPs 浓度为 100 μmol /L 时，无任
何扩增谱带;当 dNTPs 浓度为 150、250、300 μmol /L
时，虽然有扩增，但谱带少且相对较弱，产物不稳定。
从整体效果来看，dNTPs 浓度为 200 μmol /L 时，谱带
亮度高且产物稳定，因此百合属 RAPD-PCR 扩增的最
佳 dNTPs浓度为 200 μmol /L。
M:Marker DL 2 000;1 ～ 5:dNTPs的浓度分别为
100、150、200、250、300 μmol /L，由 E 13 扩增。
图 5 不同浓度 dNTPs的 RAPD-PCR扩增结果
2． 6 退火温度对 RAPD-PCR的影响
本实验在综合上述各因素最佳水平的基础上，根
据引物 Tm值设定退火温度为 32． 1、32． 6、33． 5、34． 6、
35． 9、37． 3、38． 6、39． 9、41． 0、41． 9 ℃ 10 个梯度。如
图 6 所示，当温度低于 35． 9 ℃时，扩增谱带较少且亮
度较弱;当温度高于 38． 6 ℃时，扩增谱带明显增多且
·11·
研究报告 陈名红 等:百合属 RAPD反应条件优化的研究
亮度增加，但谱带呈弥散状态，模糊难以辨认且非特异
性扩增增强;当温度为 37． 3 ℃时，谱带较为清晰，无非
特异性扩增，并且在重复实验中也得到了比较稳定的
结果。因此百合属 RAPD-PCR 反应体系的退火温度
选用37． 3 ℃较为合适。
M:Marker DL 2 000;1 ～ 10:退火温度分别为 32． 1、32． 6、33． 5、
34． 6、35． 9、37． 3、38． 6、39． 9、41． 0、41． 9 ℃，由 E 13 扩增。
图 6 不同退火温度下的 RAPD-PCR扩增结果
3 讨 论
RAPD-PCR扩增结果容易受到诸多因素的影响，
如模板 DNA 的浓度与纯度、Mg2 + 的浓度、引物的浓
度、TaqDNA聚合酶与 dNTPs的用量、扩增程序与循环
周期等［7］。因此，确定反应体系中每个因子合适的反
应参数是保证 RAPD 分析稳定性和重复性的前提［5］。
DNA模板的含量是制约 PCR 扩增产物得率及特异性
的一个重要因素，模板含量过低，分子碰撞的机率低，
偶然性大，扩增产物无或不稳定;模板浓度含量过高，
又会相应增加非特异性产物的扩增［8］。Mg2 + 是 Taq
DNA聚合酶的激活剂，Mg2 +不足会使 TaqDNA 聚合酶
效率降低，导致扩增产物减少;Mg2 +浓度过高对扩增
效果也不利，会引起特异性条带扩增产物的增加［9］。
在 PCR 扩增反应中，TaqDNA 聚合酶的使用量及质量
直接关系到反应的稳定性与重现性。不同生产厂家及
不同生产批次的 TaqDNA聚合酶在活性上可能存在较
大的差异，因此相关研究报道酶的使用量出入较大，但
总体来看，如果酶浓度过低则不能扩增，浓度太高又会
产生非特异性扩增且增加成本［10］。由于在 RAPD 反
应体系中，所使用的一般是 10 bp 的随机引物，这样的
引物与模板 DNA 的结合位点比较多，引物浓度过低
时，与模板结合机率降低，扩增受到影响;引物浓度过
高时，引起错配和非特异性扩增，且可增加引物之间形
成二聚体或多聚体的机会［11］。dNTPs 是 PCR 扩增的
原料，其浓度过高会导致 PCR 错配，从而出现非特异
性扩增，浓度过低又会影响扩增效果，甚至会因为
dNTPs过早消耗使产物单链化［12］。在 RAPD-PCR 体
系中不同模板 DNA及不同引物其最适退火温度不同，
退火温度过低易导致非特异性扩增，重复性降低;温度
过高又使谱带减少，导致一些可能反应多态性的谱带
消失［13］。本研究通过对上述 RAPD-PCR 反应体系及
反应参数的调整与优化，建立了适合百合属进行
RAPD-PCR扩增的反应体系和扩增程序。反应体系
为:1 × PCR buffer、40 ng模板 DNA、1． 5 mmol /L Mg2 +、
1． 0 U TaqDNA 聚合酶、1． 0 μmol /L 随机引物、200
μmol /L dNTPs，总体积为 25 μL;扩增程序为:94 ℃预
变性 5 min;94 ℃变性 30 s，37． 3 ℃退火 40 s，72 ℃延伸
90 s，共 40 个循环;最后 72 ℃延伸 10 min。该体系的
建立为今后应用 RAPD技术鉴定百合属植物的种质资
源和遗传多样性研究奠定了良好基础。
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