全 文 ：第４２卷　第１１期
２０１４年１１月
西北农林科技大学学报（自然科学版）
Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｎｏｒｔｈｗｅｓｔ　Ａ＆Ｆ　Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ（Ｎａｔ．Ｓｃｉ．Ｅｄ．）
Ｖｏｌ．４２ Ｎｏ．１１
Ｎｏｖ．２０１４
网络出版时间：２０１４－１０－１６　１３：５５ ＤＯＩ：１０．１３２０７／ｊ．ｃｎｋｉ．ｊｎｗａｆｕ．２０１４．１１．０８８
网络出版地址：ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｃｎｋｉ．ｎｅｔ／ｋｃｍｓ／ｄｏｉ／１０．１３２０７／ｊ．ｃｎｋｉ．ｊｎｗａｆｕ．２０１４．１１．０８８．ｈｔｍｌ
葡萄风信子ＭａＭＹＢ１基因的克隆及表达分析
　［收稿日期］　２０１３－０８－０９
　［基金项目］　国家自然科学基金项目“单子叶植物蓝色花形成关键转录因子基因克隆与功能分析”（３１１７０６５２）
　［作者简介］　姜　玲（１９８８－），女，四川岳池人，在读硕士，主要从事园林植物分子育种研究。Ｅ－ｍａｉｌ：３０６７８５１７＠１６３．ｃｏｍ
　［通信作者］　刘雅莉（１９６０－），女，陕西西安人，教授，硕士，硕士生导师，主要从事园林植物遗传育种研究。
Ｅ－ｍａｉｌ：ｌｙｌ６１５１＠１２６．ｃｏｍ
姜　玲ａ，ｂ，刘雅莉ａ，ｂ，娄　倩ａ，ｃ，焦淑珍ａ，ｂ，权永辉ａ，ｂ
（西北农林科技大学ａ旱区作物逆境生物学国家重点实验室，ｂ林学院，ｃ园艺学院，陕西 杨凌７１２１００）
［摘　要］　 【目的】克隆葡萄风信子 ＭＹＢ转录因子基因（ＭａＭＹＢ１），并对其进行生物信息学和表达模式的分
析。【方法】以开蓝色花的葡萄风信子品种“亚美尼亚”为材料，利用ＲＡＣＥ技术得到其 ＭａＭＹＢ１基因ｃＤＮＡ全长，
对其进行生物信息学分析，利用酵母单杂交方法检测其转录激活活性，并用实时定量ＰＣＲ方法分析该基因在根、茎、
叶及不同发育时期花中的表达特性。【结果】通过ＲＡＣＥ－ＰＣＲ，克隆得到９５３ｂｐ的ＭａＭＹＢ１基因，其开放阅读框长
７５０ｂｐ，编码２４９个氨基酸，推测的蛋白分子质量约为２７．７ｋｕ，理论等电点为９．３。ＭａＭＹＢ１基因编码的蛋白序列中
具有２个典型的 ＭＹＢ结构域Ｒ２和Ｒ３，且在Ｒ３结构域下游含有与ＢＨＬＨ蛋白结合的［Ｄ／Ｅ］Ｌｘ２［Ｒ／Ｋ］ｘ３Ｌｘ６Ｌｘ３Ｒ
结构域。ＭａＭＹＢ１与玉米ＺｍＰ１及拟南芥 ＭＹＢ１２的关系较近。酵母单杂交检测表明：ＭａＭＹＢ１具有转录激活活
性。实时定量ＰＣＲ分析结果表明：ＭａＭＹＢ１在不同组织中均有表达，以在花中表达量较高，且在花不同发育时期表
达量差异显著。【结论】从葡萄风信子中克隆到１个新的ＭＹＢ基因ＭａＭＹＢ１；推测该基因可能参与了葡萄风信子花
发育过程的调控。
［关键词］　葡萄风信子；ＭＹＢ转录因子；基因克隆；表达分析
［中图分类号］　Ｓ６８２．２＋９ ［文献标志码］　Ａ ［文章编号］　１６７１－９３８７（２０１４）１１－０１５６－０７
Ｃｌｏｎｉｎｇ　ａｎｄ　ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ　ｏｆ　ＭａＭＹＢ１　ｇｅｎｅ　ｉｎ　Ｍｕｓｃａｒｉ　ｂｏｔｒｙｏｉｄｅｓ
ＪＩＡＮＧ　Ｌｉｎｇａ，ｂ，ＬＩＵ　Ｙａ－ｌｉ　ａ，ｂ，ＬＯＵ　Ｑｉａｎａ，ｃ，ＪＩＡＯ　Ｓｈｕ－ｚｈｅｎａ，ｂ，ＱＵＡＮ　Ｙｏｎｇ－ｈｕｉ　ａ，ｂ
（ａＳｔａｔｅ　Ｋｅｙ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　ｏｆ　Ｃｒｏｐ　Ｓｔｒｅｓｓ　Ｂｉｏｌｏｇｙ　ｉｎ　Ａｒｉｄ　Ａｒｅａｓ，ｂ　Ｃｏｌｌｅｇｅ　ｏｆ　Ｆｏｒｅｓｔｒｙ，
ｃ　Ｃｏｌｌｅｇｅ　ｏｆ　Ｈｏｒｔｉｃｕｌｔｕｒｅ，Ｎｏｒｔｈｗｅｓｔ　Ａ＆Ｆ　Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｙａｎｇｌｉｎｇ，Ｓｈａａｎｘｉ　７１２１００，Ｃｈｉｎａ）
Ａｂｓｔｒａｃｔ：【Ｏｂｊｅｃｔｉｖｅ】Ａ　ｎｏｖｅｌ　ＭＹＢ　ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ　ｆａｃｔｏｒ　ｗａｓ　ｉｓｏｌａｔｅｄ　ｆｒｏｍ　ｇｒａｐｅ　ｈｙａｃｉｎｔｈｓ　ａｎｄ　ｉｔｓ　ｂｉｏ－
ｌｏｇｉｃａｌ　ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ　ａｎｄ　ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ　ｐａｔｔｅｒｎ　ｗｅｒｅ　ａｎａｌｙｚｅｄ．【Ｍｅｔｈｏｄ】Ｔｈｅ　ｂｌｕｅ　ｇｒａｐｅ　ｈｙａｃｉｎｔｈｓ　ｖａｒｉｅｔｙ
‘Ｍｕｓｃａｒｉ　ａｒｍｅｎｉａｃｕｍ’ｗａｓ　ｓｅｌｅｃｔｅｄ　ａｓ　ｍａｔｅｒｉａｌ．Ｔｈｅ　ｆｕｌ－ｌｅｎｇｔｈ　ｓｅｑｕｅｎｃｅ　ｏｆ　ＭＹＢｇｅｎｅ　ｗａｓ　ｏｂｔａｉｎｅｄ　ｕｓｉｎｇ
ＲＡＣＥ　ｍｅｔｈｏｄ，ｗｈｉｃｈ　ｗａｓ　ｄｅｓｉｇｎａｔｅｄ　ａｓ　ＭａＭＹＢ１，ａｎｄ　ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ　ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ　ａｎａｌｙｓｉｓ　ｗａｓ　ｐｅｒｆｏｒｍｅｄ．Ｔｈｅ
ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎａｌ　ａｃｔｉｖｉｔｙ　ｏｆ　ｔｈｅ　ＭＹＢ　ｐｒｏｔｅｉｎ　ｗａｓ　ｄｅｔｅｃｔｅｄ　ｂｙ　ｙｅａｓｔ　ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ　ｓｙｓｔｅｍ，ａｎｄ　ｔｈｅ　ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ
ｐａｔｔｅｒｎ　ｉｎ　ｒｏｏｔ，ｓｔｅｍ，ｌｅａｆ，ａｎｄ　ｆｌｏｗｅｒｓ　ａｔ　ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ　ｓｔａｇｅｓ　ｗａｓ　ａｎａｌｙｚｅｄ　ｂｙ　ｒｅａｌ－ｔｉｍｅ　ＰＣＲ．【Ｒｅｓｕｌｔ】Ｔｈｅ
ＯＲＦ　ｏｆ　ＭａＭＹＢ１ｗａｓ　７５０ｂｐ，ｅｎｃｏｄｉｎｇ　２４９ａｍｉｎｏ　ａｃｉｄｓ．Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ　ａｎａｌｙｓｉｓ　ｓｈｏｗｅｄ　ｔｈａｔ　ｔｈｅ　ｄｅｄｕｃｅｄ　ｐｒｏ－
ｔｅｉｎ　ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　ｗｅｉｇｈｔ　ｏｆ　ｔｈｅ　ｇｅｎｅ　ｗａｓ　２７．７ｋｕ，ｔｈｅ　ｔｈｅｏｒｅｔｉｃａｌ　ｉｓｏｅｌｅｃｔｒｉｃ　ｐｏｉｎｔ　ｗａｓ　９．３，ａｎｄ　ｔｈｅ　ｐｒｏｔｅｉｎｓ
ｃｏｎｔａｉｎｅｄ　ｔｗｏ　ｃｏｎｓｅｒｖｅｄ　ＭＹＢ　ｄｏｍａｉｎｓ　ｎｅａｒ　ｔｈｅ　Ｎ－ｔｅｒｍｉｎｕｓ　ａｎｄ　ａ　ＢＨＬＨ　ｂｉｎｄｉｎｇ　ｍｏｔｉｆ（［Ｄ／Ｅ］Ｌｘ２［Ｒ／Ｋ］
ｘ３Ｌｘ６Ｌｘ３Ｒ）ｉｎ　Ｒ３ｄｏｍａｉｎｓ．Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ　ａｎａｌｙｓｉｓ　ｓｈｏｗｅｄ　ｔｈａｔ　ＭａＭＹＢ１ｈａｄ　ｃｌｏｓｅ　ｈｏｍｏｌｏｇ　ｗｉｔｈ　ＺｍＰ１
ｆｒｏｍ　Ｚｅａ　ｍａｙｓ　ａｎｄ　ＭＹＢ１２ｆｒｏｍＡｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ　ｔｈａｌｉａｎａ．Ｔｈｅ　ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎａｌ　ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ　ａｃｔｉｖｉｔｙ　ｏｆ　ＭａＭＹＢ１
ｐｒｏｔｅｉｎ　ｗａｓ　ｃｏｎｆｉｒｍｅｄ　ｂｙ　ｔｈｅ　ｙｅａｓｔ　ｓｙｓｔｅｍ．Ｔｈｅ　ｒｅｓｕｌｔ　ｏｆ　ｒｅａｌ　ｔｉｍｅ－ＰＣＲ　ａｎａｌｙｓｉｓ　ｓｈｏｗｅｄ　ｔｈｅ　ｇｅｎｅ　ｗａｓ　ｐｒｅ－
ｄｏｍｉｎａｎｔｌｙ　ｅｘｐｒｅｓｓｅｄ　ｉｎ　ｆｌｏｗｅｒ　ｔｉｓｓｕｅｓ　ａｎｄ　ｃｈａｎｇｅｄ　ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔｌｙ　ｄｕｒｉｎｇ　ｆｌｏｗｅｒ　ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ．【Ｃｏｎｃｌｕｓｉｏｎ】
Ｏｎｅ　ｎｏｖｅｌ　ｇｅｎｅ　ｅｎｃｏｄｉｎｇ　ＭＹＢ　ｐｒｏｔｅｉｎ，ＭａＭＹＢ１，ｗａｓ　ｉｓｏｌａｔｅｄ　ｆｒｏｍ　ｇｒａｐｅ　ｈｙａｃｉｎｔｈｓ．Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ　ａｎａｌｙ－
ｓｉｓ　ａｎｄ　ｒｅａｌ　ｔｉｍｅ－ＰＣＲ　ａｎａｌｙｓｉｓ　ｓｈｏｗｅｄ　ｔｈａｔ　ＭａＭＹＢ１ｍａｙ　ｂｅ　ｉｎｖｏｌｖｅｄ　ｉｎ　ｔｈｅ　ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ　ｏｆ　ｆｌｏｗｅｒ　ｄｅｖｅｌｏｐ－
ｍｅｎｔ．
Ｋｅｙ　ｗｏｒｄｓ：Ｍｕｓｃａｒｉ　ｂｏｔｒｙｏｉｄｅｓ；ＭＹＢ　ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ　ｆａｃｔｏｒ；ｇｅｎｅ　ｃｌｏｎｉｎｇ；ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ　ｐａｔｔｅｒｎ
　　葡萄风信子（Ｍｕｓｃａｒｉ　ｂｏｔｒｙｏｉｄｅｓ）是天门冬科
葡萄风信子属的一种多年生草本观花地被植物，其
因开较为稀少的蓝紫色花而深受人们喜爱。植物的
花色是多种因子共同作用的结果，但绝大多数植物
的花色是由细胞中的特定花色素而决定。花色素的
合成主要受２类基因的调控，一类是结构基因，负责
编码花色素生物合成的催化酶；另一类是调节基因，
其编码的转录因子可应答外界刺激，调控基因时空
表达［１］。在调控色素合成的因子中，以对 ＭＹＢ转
录因子的研究最为广泛，目前报道的几乎所有的花
色素合成途径都受到 ＭＹＢ转录因子的调控［２］。
ＭＹＢ转录因子是植物中最大的转录因子家族
之一，它广泛参与植物色素合成、细胞分化与发育、
信号转导以及抗逆抗病等次生代谢过程的调控［３］。
根据ＤＮＡ结合功能域中不完全重复序列数目的不
同，ＭＹＢ转录因子可分为３个亚族（１Ｒ、２Ｒ 和
３Ｒ）［３－４］：有 １ 个重复的 ＭＹＢ 类似蛋白被称为
ＭＹＢ１Ｒ，有２个重复的为Ｒ２Ｒ３－ＭＹＢ，有３个重复
的为 ＭＹＢ３Ｒ［２］。在 ＭＹＢ转录因子中，Ｒ２Ｒ３－ＭＹＢ
转录因子在植物的调控中起着重要的作用。自Ｐａｚ－
Ａｒｅｓ等［５］从植物中分离到第１个 ＭＹＢ转录因子以
来，大量 ＭＹＢ类因子被分离和鉴定［６］。近年来，科
研人员在苹果［７－８］、龙胆［９］、百合［１０］等植物中也克隆
和鉴定出色素合成相关的Ｒ２Ｒ３－ＭＹＢ转录因子，而
关于葡萄风信子色素合成的调节基因及其功能的研
究还未见报道。本研究从葡萄风信子中克隆出１个
ＭＹＢ转录因子基因，并对其进行生物信息学和表达
模式分析，以期为明确该基因在葡萄风信子花发育
过程中的调控作用奠定基础。
１　材料与方法
１．１　材料与试剂
以开蓝色花的葡萄风信子品种‘亚美尼亚’
（Ｍｕｓｃａｒｉ　ａｒｍｅｎｉａｃｕｍ）为试验材料，试验种球采自
西安植物园，种植于西北农林科技大学人工气候室。
将葡萄风信子花发育过程分为４个时期（Ｓ１．未着
色，Ｓ２．开始着色，Ｓ３．完全着色未开放，Ｓ４．完全着
色开放），并分别采集这４个时期的花及根、茎、叶组
织，用液氮冷冻处理后，于－８０℃冰箱中保存备用。
ＰｒｉｍｅＳｃｒｉｐｔ　ＲＴ　ｒｅａｇｅｎｔ　ｋｉｔ试剂盒、ＳＭＡＲＴ－
ｅｒ　ＴＭ ＲＡＣＥ　ｃＤＮＡ扩增试剂盒、实时定量ＰＣＲ试剂
盒ＳＹＢＲ　Ｐｒｅｍｉｘ　Ｅｘ　ＴａｑＴＭⅡ和克隆载体ｐＭＤ１９－Ｔ
ｖｅｃｔｏｒ均购于大连ＴａＫａＲａ公司；ＲＮＡ快速提取试
剂盒购于北京百泰克公司；ＤＮＡ回收试剂盒购于
ＴＩＡＮＧＥＮ公司；Ｍａｔｃｈｍａｋｅｒ　Ｓｙｓｔｅｍ　３酵母杂交
试剂盒购于Ｃｌｏｎｔｅｃｈ公司。ＰＣＲ扩增引物的合成
与扩增产物序列测定由北京奥科生物技术有限公司
完成。
１．２　方　法
１．２．１　植物各组织总ＲＮＡ的提取　根据ＲＮＡ快
速提取试剂盒说明书提取葡萄风信子不同组织的
ＲＮＡ，用１％琼脂糖凝胶电泳检测其质量，于－８０
℃冰箱中保存，以备后期ＲＡＣＥ扩增和实时定量分
析用。
１．２．２　葡萄风信子 ＭＹＢ 基因全长序列的克隆　
前期，本课题组对葡萄风信子转录组进行了测序，目
的是通过筛选获得与葡萄风信子花发育相关的转录
因子基因。根据转录组测序结果，将筛选出的葡萄
风信子 ＭＹＢ 基因暂命名为ＭａＭＹＢ１。为了获得
ＭａＭＹＢ１基因全长，用该基因的已知序列（转录组
测序获得）设计特异性引物（表１），参考ＳＭＡＲＴ－
ｅｒ　ＴＭ　ＲＡＣＥ　ｃＤＮＡ 扩增试剂盒说明书，准备３′－
ＲＡＣＥ－Ｒｅａｄｙ　ｃＤＮＡ 和５′－ＲＡＣＥ－Ｒｅａｄｙ　ｃＤＮＡ 进
行ＰＣＲ反应。３′ＲＡＣＥ的反应体系为２５μＬ，其中
ＰＣＲ－Ｇｒａｄｅ　ｗａｔｅｒ　１７．２５μＬ，１０×Ａｄｖａｎｔａｇｅ　２ＰＣＲ
Ｂｕｆｆｅｒ　２．５μＬ，ｄＮＴＰ　Ｍｉｘ　０．５μＬ，５０×Ａｄｖａｎｔａｇｅ
２Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ　Ｍｉｘ　０．５μＬ，将其混合液涡旋混匀，瞬
时离心；在混合液中加入３′－ＲＡＣＥ－Ｒｅａｄｙ　ｃＤＮＡ　１．
２５μＬ，ＧＳＰ引物（ＭａＭＹＢ１－３′ＲＡＣＥ）０．５μＬ以及
ＵＰＭ引物２．５μＬ。５′ＲＡＣＥ末端的扩增体系同３′
ＲＡＣＥ端扩增体系，模板为５′－ＲＡＣＥ－Ｒｅａｄｙ　ｃＤ－
ＮＡ，ＧＳＰ引物为 ＭａＭＹＢ１－５′ＲＡＣＥ。５′ＲＡＣＥ和
３′ＲＡＣＥ扩增程序均为９４℃变性３０ｓ，６７℃ 退火
３０ｓ，７２℃ 延伸２ｍｉｎ，２５个循环。对３′ＲＡＣＥ和
５′ＲＡＣＥ的扩增产物进行１％琼脂糖凝胶电泳后回
收测序。用ｓｅｑｍａｎ软件将得到的序列与已知的
ＥＳＴ序列（转录组测序获得）进行拼接，查找拼接后
序列的开放读码框，在开放阅读框两端设计引物
７５１第１１期 姜　玲，等：葡萄风信子ＭａＭＹＢ１基因的克隆及表达分析
（ＭａＭＹＢ１－Ｆ－Ｓ 和 ＭａＭＹＢ１－Ｆ－Ａ），ＰＣＲ 扩 增
ＭａＭＹＢ１基因ｃＤＮＡ的全长。ＰＣＲ反应体系为：
１０×Ｂｕｆｆｅｒ　２．５μＬ，ｄＮＴＰ（２．５ｍｍｏｌ／Ｌ）２μＬ，
ＭａＭＹＢ１－Ｆ－Ｓ　１μＬ，ＭａＭＹＢ１－Ｆ－Ａ　１μＬ，Ｔａｑ 酶
０．２５μＬ，ｄｄＨ２Ｏ　１７．２５μＬ。扩增程序为：９４℃３
ｍｉｎ；９４℃３０ｓ，５８℃退火３０ｓ，７２℃延伸１ｍｉｎ，３０
个循环；７２℃１０ｍｉｎ。对扩增产物进行１％的琼脂
糖凝胶电泳后回收测序。
表１　ＭａＭＹＢ１基因克隆及表达分析所用引物
Ｔａｂｌｅ　１　Ｐｒｉｍｅｒｓ　ｕｓｅｄ　ｉｎ　ＭａＭＹＢ１ｇｅｎｅ　ｃｌｏｎｉｎｇ
ａｎｄ　ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ　ａｎａｌｙｓｉｓ
引物名称
Ｐｒｉｍｅｒ
引物序列（５′→３′）
Ｐｒｉｍｅｒ　ｓｅｑｕｅｎｃｅ（５′→３′）
ＭａＭＹＢ１－３′ＲＡＣＥ　ＣＡＣＧＡＡＣＡＡＧＧＧＧＧＣＧＴＧＧＡＣＡＡＧ
ＭａＭＹＢ１－５′ＲＡＣＥ　ＣＧＧＡＡＣＣＣＧＡＴＡＧＣＧＣＴＴＣＴＣＡＴＧＧＴ
ＭａＭＹＢ１－Ｆ－Ｓ　 ＡＴＧＧＧＧＡＧＧＴＣＧＣＣＡＴＧＣＴ
ＭａＭＹＢ１－Ｆ－Ａ　 ＴＣＡＡＡＣＧＣＴＴＣＴＧＴＡＧＴＣＣＡＧＧＡＧＣＣ
ｐＧＢＫＴ７－Ｍ－Ｓ　 ＣＣＡＴＧＧＡＴＧＧＧＧＡＧＧＴＣＧＣＣＡＴＧＣ
ｐＧＢＫＴ７－Ｍ－Ａ ＧＧＡＴＣＣＴＣＡＡＡＣＧＣＴＴＣＴＧＴＡＧＴＣ－ＣＡＧＧＡＧ
ＭａＭＹＢ１－ＲＴ－Ｓ　 ＧＧＧＧＧＣＧＴＧＧＡＣＡＡＡＧＧ
ＭａＭＹＢ１－ＲＴ－Ａ　 ＡＧＧＴＣＧＧＧＧＣＧＧＡＧＧＴＡ
Ａｃｔｉｎ－Ｓ　 ＧＣＣＴＧＣＣＡＴＧＴＡＴＧＴＴＧＣＧ
Ａｃｔｉｎ－Ａ　 ＣＧＧＡＧＣＴＴＣＣＡＴＴＣＣＧＡＴＣ
１．２．３　ＭａＭＹＢ１基因序列分析　用ＯＲＦｆｉｎｄｅｒ在
线分析ＭａＭＹＢ１基因的开放阅读框，并推测该基
因所编码的氨基酸序列，分析蛋白质分子质量大小
及等电点；用 Ｍｅｇａ　５．０软件对其进行系统进化分
析；利用ＤＮＡｍａｎ软件对 ＭａＭＹＢ１蛋白序列与已
知的部分 ＭＹＢ蛋白序列进行比对分析。用Ｂｌａｓｔｐ
（ｈｔｔｐ：／／ｂｌａｓｔ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／Ｂｌａｓｔ．ｃｇｉ）将推测
的蛋白序列与ＮＣＢＩ上的同源序列进行比对。
１．２．４　ＭａＭＹＢ１基因的转录激活活性分析　用带
有酶切位点的引物ｐＧＢＫＴ７－Ｍ－Ｓ和ｐＧＢＫＴ７－Ｍ－Ａ
（表１）将 ＭａＭＹＢ１克隆进ｐＧＢＫＴ７载体中，构建
ｐＧＢＫＴ７－ＭａＭＹＢ１载体；同时扩增ＧＡＬ４基因，克
隆到ｐＧＢＫＴ７载体中作阳性对照。将上述重组质
粒和空载体ＰＧＢＫＴ７转化酵母 ＡＨ１０９感受态细
胞，然后涂布于一缺培养基（ＳＤ／－Ｔｒｐ）上，３０℃培养
３ｄ。将于ＳＤ／－Ｔｒｐ培养基上生长的转化子划线接
种于含有 Ｘ－α－ｇａｌ的三缺培养基 （ＳＤ／－Ｔｒｐ－Ｈｉｓ－
Ａｄｅ）中，通过显色情况检测其转录激活活性。
１．２．５　ＭａＭＹＢ１基因的表达特性分析　以葡萄风
信子Ａｃｔｉｎ基因为内参基因，设计其特异引物 Ａｃ－
ｔｉｎ－Ｓ和 Ａｃｔｉｎ－Ａ（表１）。根据 ＭａＭＹＢ１序列设计
定量引物 ＭａＭＹＢ１－ＲＴ－Ｓ 和 ＭａＭＹＢ１－ＲＴ－Ａ（表
１）。参照ＰｒｉｍｅＳｃｒｉｐｔ　ＲＴ　ｒｅａｇｅｎｔ　ｋｉｔ操作说明，将
葡萄风信子‘亚美尼亚’的根、茎、叶以及不同发育时
期（Ｓ１，Ｓ２，Ｓ３，Ｓ４）花的ＲＮＡ反转录为ｃＤＮＡ，反应
体系为：５×ＰｒｉｍｅＳｃｒｉｐｔ　Ｂｕｆｆｅｒ　４μＬ，ＰｒｉｍｅＳｃｒｉｐｔ
ＲＴ　Ｅｎｚｙｍｅ　１μＬ，Ｏｌｉｇｏ　ｄＴ　Ｐｒｉｍｅ　１μＬ，Ｒａｎｄｏｍ　６
ｍｅｒｓ　１μＬ，加入１　０００ｎｇ的ＲＮＡ，然后加入Ｒｎａｓｅ
Ｆｒｅｅ　ｄＨ２Ｏ至总体积为２０μＬ。反应条件为：３７℃
１５ｍｉｎ，８５℃５ｓ。以反转录后的ｃＤＮＡ为模板，参
考ＳＹＢＲ　Ｐｒｅｍｉｘ　Ｅｘ　ＴａｑＴＭⅡ操作说明，在 ＢＩＯ－
ＲＡＤ　Ｃｙｃｌｅｒ　ＩＱ５荧光定量ＰＣＲ仪上进行实时荧光
定量ＰＣＲ。其反应体系为：ＳＹＢＲ　Ｐｒｅｍｉｘ　Ｅｘ　Ｔａｑ
１０μＬ，上、下游引物各０．８μＬ，模板ｃＤＮＡ　１μＬ，加
水至总体积为２０μＬ。反应程序为９４℃３０ｓ；９４℃
１５ｓ，５８℃３０ｓ，４５个循环，每个反应重复３次。
２　结果与分析
２．１　ＭａＭＹＢ１全长序列的获得
３′ＲＡＣＥ结果在约１ｋｂ处有一条带（图１－Ａ），
而５′ＲＡＣＥ在约２ｋｂ和５００ｂｐ各有一条带（图１－
Ｂ），其中２ｋｂ处的条带为非特异扩增产物。将１ｋｂ
和５００ｂｐ处的片段与原有的 ＥＳＴ序列拼接在一
起，获得一条长９５３ｂｐ的序列，利用ＯＲＦ　ｆｉｎｄｅｒ软
析分析其开放阅读框，根据开放阅读框两端序列设
计引物，经ＰＣＲ扩增获得一条长约７５０ｂｐ的序列
（图１－Ｃ）。
２．２　ＭａＭＹＢ１基因编码蛋白的生物信息学分析
利用ＯＲＦｆｉｎｄｅｒ软件对ＭａＭＹＢ１基因序列进
行分析，发现其开放阅读框长７５０ｂｐ，编码２４９个氨
基酸，其蛋白分子质量约为２７．７ｋｕ，等电点为９．３。
推测该基因编码的部分氨基酸序列如图２所示。
ＭａＭＹＢ１与部分已知的Ｒ２Ｒ３－ＭＹＢ蛋白氨基酸序
列的比对结果（图２）表明，在该序列 Ｎ端有２个典
型的 ＭＹＢ结构域（Ｒ２和Ｒ３），该结构域与部分已
报道的 ＭＹＢ转录因子结构域有很高的相似性，在
Ｒ２结构域中，从推测的第１７个氨基酸开始每隔１９
个氨基酸就有１个色氨酸残基；在Ｒ３结构域中，第
１个色氨酸被苯丙氨酸取代，之后每隔１８个氨基酸
就有１个色氨酸残基；在此Ｒ３结构域内，还存在１
个与ＢＨＬＨ 蛋白结合的结构域［Ｄ／Ｅ］Ｌｘ２［Ｒ／Ｋ］
ｘ３Ｌｘ６Ｌｘ３Ｒ，而在与原花青素和花青素合成相关的
ＭＹＢ转录因子中该结构域是一常见特征［１１－１５］。因
此可以推断克隆的转录因子为典型的 Ｒ２Ｒ３－ＭＹＢ
转录因子。将序列提交 ＮＣＢＩ　Ｂｌａｓｔｐ发现，其蛋白
序列与可可树（Ｔｈｅｏｂｒｏｍａ　ｃａｃａｏ）ＭＹＢ蛋白的相似
性为６３％，与苹果（Ｍａｌｕｓ　ｄｏｍｅｓｔｉｃａ）和黄瓜（Ｃｕｃｕ－
８５１ 西北农林科技大学学报（自然科学版） 第４２卷
ｍｉｓ　ｓａｔｉｖｕｓ）ＭＹＢ 蛋白的相似性均为 ６４％。将
ＭａＭＹＢ１与其他物种的 ＭＹＢ蛋白进行进化分析，
结果（图３）表明，ＭａＭＹＢ１与玉米的ＺｍＰ１以及拟
南芥的 ＭＹＢ１２关系较近。
图１　葡萄风信子ＭＹＢ基因的ＲＡＣＥ－ＰＣＲ以及ＣＤＮＡ全长电泳结果
Ａ．ＭａＭＹＢ１的３′ＲＡＣＥ结果；Ｂ．ＭａＭＹＢ１的５′ＲＡＣＥ结果；
Ｃ．ＭａＭＹＢ１ｃＤＮＡ全长的扩增结果；Ｍ．ＤＮＡ　Ｍａｒｋｅｒ　Ｔｒａｎｓ　Ｐｌｕｓ　２０００
Ｆｉｇ．１　Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ　ｒｅｓｕｌｔｓ　ｏｆ　ＭＹＢｇｅｎｅ　ＲＡＣＥ－ＰＣＲ　ａｎｄ　ｃＤＮＡ　ｆｕｌ　ｌｅｎｇｔｈ
Ａ．３′ＲＡＣＥ　ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ　ｐｒｏｄｕｃｔ　ｏｆ　ＭａＭＹＢ１；Ｂ．５′ＲＡＣＥ　ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ　ｐｒｏｄｕｃｔ　ｏｆ　ＭａＭＹＢ１；
Ｃ．Ｆｕｌ　ｌｅｎｇｔｈ　ＰＣＲ　ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ　ｐｒｏｄｕｃｔ　ｏｆ　ＭａＭＹＢ１；Ｍ．ＤＮＡ　Ｍａｒｋｅｒ　Ｔｒａｎｓ　Ｐｌｕｓ　２０００
图２　ＭａＭＹＢ１蛋白部分序列与其他已知 ＭＹＢ序列的比对
参比 ＭＹＢ蛋白对应的基因序列ＧｅｎＢａｎｋ登录号：拟南芥ＡｔＰＡＰ１和ＡｔＰＡＰ２分别为ＡＦ３２５１２３和ＡＦ３２５１２４，矮牵牛ＡＮ２为ＡＦ１４６７０２，
金鱼草ＡｍＲＯＳＥＡ１和ＡｍＲＯＳＥＡ２分别为ＤＱ２７５５２９和ＤＱ２７５５３０，玉米ＺｍＣ１为 Ｍ３７１５３，文心兰ＯｇＭＹＢ１为ＡＢＳ５８５０１，
蝴蝶兰ＰｓＵＭＹＢ６为ＦＪ０３９８６０；黑色区域代表氨基酸同源性为１００％；灰色区域代表氨基酸同源性为７５％；三角形示色氨酸残基；
Ｒ２、Ｒ３为典型的 ＭＹＢ结构域；下划线处为与ＢＨＬＨ结合的结构域［Ｄ／Ｅ］Ｌｘ２［Ｒ／Ｋ］ｘ３Ｌｘ６Ｌｘ３Ｒ；方框中为ＫＰＲＰＲ［Ｓ／Ｔ］［Ｆ／Ｌ］结构域
Ｆｉｇ．２　Ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ　ｏｆ　ＭａＭＹＢ１ｗｉｔｈ　ｏｔｈｅｒ　Ｒ２Ｒ３－ＭＹＢ　ｐｒｏｔｅｉｎｓ
Ｔｈｅ　ａｂｏｖｅ　ｐｒｏｔｅｉｎｓ　ｉｎｃｌｕｄｅ　ＡｔＰＡＰ１（ＡＦ３２５１２３）ａｎｄ　ＡｔＰＡＰ２（ＡＦ３２５１２４）ｉｎ　Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ　ｔｈａｌｉａｎａ，ＡＮ２（ＡＦ１４６７０２）ｉｎ　Ｐｅｔｕｎｉａ　ｈｙｂｒｉｄ，
ＡｍＲＯＳＥＡ１（ＤＱ２７５５２９）ａｎｄ　ＡｍＲＯＳＥＡ２（ＤＱ２７５５３０）ｉｎ　Ａｎｔｉｒｒｈｉｎｕｍ　ｍａｊｕｓ，ＺｍＣ１（Ｍ３７１５３）ｉｎ　Ｚｅａ　ｍａｙｓ，ＯｇＭＹＢ１（ＡＢＳ５８５０１）
ｉｎ　Ｏｎｃｉｄｉｕｍ　ｈｙｂｒｉｄｕｍ，ａｎｄ　ＰｓＵＭＹＢ６（ＦＪ０３９８６０）ｉｎ　Ｐｈａｌａｅｎｏｐｓｉｓ　ａｐｈｒｏｄｉｔｅ．Ｔｒｙｐｔｏｐｈａｎ　ｒｅｓｉｄｕｅｓ　ａｒｅ　ｉｎｄｉｃａｔｅｄ　ｂｙ　ｔｒｉａｎｇｌｅｓ；
ｉｄｅｎｔｉｃａｌ　ｒｅｓｉｄｕｅｓ　ａｒｅ　ｉｎ　ｂｌａｃｋ，ｃｏｎｓｅｒｖｅｄ　ｒｅｓｉｄｕｅｓ　ａｒｅ　ｉｎ　ｇｒａｙ；Ｒ２ａｎｄ　Ｒ３ａｒｅ　ｔｙｐｉｃａｌ　ＭＹＢ　ｄｏｍａｉｎ　ｓｔｒｕｃｔｕｒｅｓ．
Ｔｈｅ　ｂＨＬＨ　ｂｉｎｄｉｎｇ　ｍｏｔｉｆ［Ｄ／Ｅ］Ｌｘ２［Ｒ／Ｋ］ｘ３Ｌｘ６Ｌｘ３Ｒｉｓ　ｕｎｄｅｒｌｉｎｅｄ　ａｎｄ　ＫＰＲＰＲ［Ｓ／Ｔ］［Ｆ／Ｌ］ｍｏｔｉｆ　ｉｓ　ｉｎ　ｂｏｘ
９５１第１１期 姜　玲，等：葡萄风信子ＭａＭＹＢ１基因的克隆及表达分析
图３　ＭａＭＹＢ１与 其他 ＭＹＢ蛋白的系统分析
参比蛋白基因在ＧｅｎＢａｎｋ的登录号：金鱼草ＰＨＡＮ、ＶＥＮＯＳＡ、ＲＯＳＥＡ１、ＲＯＳＥＡ２和 ＭＹＢ３０５分别为ＡＪ００５５８６、
ＤＱ２７５５３１、ＤＱ２７５５２９、ＤＱ２７５５３０和ＪＱ０９５８，拟南芥ＡＳ１、ＭＹＢ２、ＴＴ２、ＧＬ１、ＷＥＲ、ＭＹＢ２４、ＰＡＰ１和
ＰＡＰ２分别为Ｏ８０９３１、Ｄ１４７１２、ＡＪ２９９４５２、Ｍ７９４４８、ＡＦ１２６３９９、ＡＡＭ６３６７４、ＡＦ３２５１２３和ＡＦ３２５１２４，
大麦ＧＡＭＹＢ为Ｘ８７６９０，玉米ＲＳ２、Ｐ１、Ｃ１和ＰＬ分别为ＡＦ１４３４４７、Ｕ５７００２、
Ｍ３７１５３和 ＡＦ０１５２６８，葡萄 ＭＹＢＡ１－１为ＡＢ０７３０１０，矮牵牛ＡＮ２为ＡＦ１４６７０２
Ｆｉｇ．３　Ｐｈｙｌｏｇｅｎｅｔｉｃ　ｔｒｅｅ　ｏｆ　ＭａＭＹＢ１ａｎｄ　ＭＹＢ　ｐｒｏｔｅｉｎｓ　ｆｒｏｍ　ｏｔｈｅｒ　ｐｌａｎｔｓ
Ｔｈｅ　ｇｅｎｅｓ　ａｎｄ　ｔｈｅｉｒ　Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ　ｎｕｍｂｅｒｓ　ｉｎ　ｔｈｅ　ＧｅｎＢａｎｋ　ｄａｔａｂａｓｅ　ａｒｅ：ＰＨＡＮ（ＡＪ００５５８６），ＶＥＮＯＳＡ（ＤＱ２７５５３１），ＲＯＳＥＡ１
（ＤＱ２７５５２９），ＲＯＳＥＡ２（ＤＱ２７５５３０）ａｎｄ　ＭＹＢ３０５（ＪＱ０９５８）ｉｎ　Ａｎｔｉｒｒｈｉｎｕｍ　ｍａｊｕｓ，ＡＳ１（Ｏ８０９３１），ＭＹＢ２（Ｄ１４７１２），ＴＴ２（ＡＪ２９９４５２），
ＧＬ１（Ｍ７９４４８），ＷＥＲ（ＡＦ１２６３９９），ＭＹＢ２４（ＡＡＭ６３６７４），ＰＡＰ１（ＡＦ３２５１２３）ａｎｄ　ＰＡＰ２（ＡＦ３２５１２４）ｉｎ　Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ　ｔｈａｌｉａｎａ，
ＧＡＭＹＢ（Ｘ８７６９０）ｉｎ　Ｈｏｒｄｅｕｍ　ｖｕｌｇａｒｅ，ＲＳ２（ＡＦ１４３４４７），Ｐ１（Ｕ５７００２），Ｃ１（Ｍ３７１５３）ａｎｄ　ＰＬ（ＡＦ０１５２６８）ｉｎ　Ｚｅａ　ｍａｙｓ，
ＭＹＢＡ１－１（ＡＢ０７３０１０）ｉｎ　ｇｒａｐｅ（Ｖｉｔｉｓ　ｖｉｎｉｆｅｒａ），ａｎｄ　ＡＮ２（ＡＦ１４６７０２）ｉｎ　Ｐｅｔｕｎｉａ　ｈｙｂｒｉｄ
２．３　ＭａＭＹＢ１的转录激活活性分析
将筛选的转化子在一缺培养基和三缺培养基上
培养，结果（图４）显示，阴性对照只能在一缺培养基
（ＳＤ／－Ｔｒｐ）上生长，不能在三缺培养基（ＳＤ／－Ｔｒｐ－
Ｈｉｓ－Ａｄｅ）上生长，说明其无转录激活活性；而ｐＧ－
ＢＫＴ７－ＭａＭＹＢ１转化子同阳性对照在一缺和三缺
培养基上都能生长，并能使转化子在 Ｘ－α－ｇａｌ存在
的情况下显色变蓝。此结果证明，ＭａＭＹＢ１转录因
子具有转录激活活性。
２．４　ＭａＭＹＢ１在葡萄风信子中的组织表达谱
利用实时定量ＰＣＲ对ＭａＭＹＢ１在不同组织中
的表达情况进行分析，结果（图５）表明，在葡萄风信
子根、茎、叶以及花组织中都检测到 ＭａＭＹＢ１的表
达，其中以花中的表达量较高。ＭａＭＹＢ１的表达量
随花发育过程的推进呈现先升高后降低的变化趋
势，在刚开始着色（Ｓ２）表达量最高；从Ｓ１到Ｓ２期，
ＭａＭＹＢ１的表达量显著增加，Ｓ２期表达量约是Ｓ１
期表达量的９倍。可见ＭａＭＹＢ１在花组织中高表
达，且在花的不同发育时期表达量差异显著，推测该
基因可能在花中起调控作用。
３　讨　论
转录因子也称反式作用因子，是能够与基因启
动子区域中的顺式作用元件发生特异性作用的
ＤＮＡ结合蛋白，它们之间以及与其他相关蛋白之间
的相互作用可激活或抑制某些基因的转录［１６］。其
中Ｒ２Ｒ３－ＭＹＢ型转录因子作为 ＭＹＢ蛋白最大的
一类，主要参与植物花青苷的代谢调节［１７］。
０６１ 西北农林科技大学学报（自然科学版） 第４２卷
图４　ＭａＭＹＢ１的转录激活活性分析
Ａ．ｐＧＢＫＴ７－ＧＡＬ４（阳性对照）；Ｂ．ｐＧＢＫＴ７－ＭａＭＹＢ１；
Ｃ．ｐＧＢＫＴ７空载体（阴性对照）
Ｆｉｇ．４　Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎａｌ　ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ　ａｓｓａｙ　ｏｆ　ｔｈｅ　ＭａＭＹＢ１
ｐｒｏｔｅｉｎ　ｂｙ　ｙｅａｓｔ　ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ　ｓｙｓｔｅｍ
Ａ．ｐＧＢＫＴ７－ＧＡＬ４（ｐｏｓｉｔｉｖｅ　ｃｏｎｔｒｏｌ）；Ｂ．ｐＧＢＫＴ７－ＭａＭＹＢ１；
Ｃ．ｐＧＢＫＴ７（ｎｅｇａｔｉｖｅ　ｃｏｎｔｒｏｌ）
图５　ＭａＭＹＢ１在不同组织和花发育时期中的表达特性
Ｒ．根；Ｓ．茎；Ｌ．叶；Ｓ１．未着色花；Ｓ２．刚开始着色花；
Ｓ３．完全着色未开放花；Ｓ４．完全着色开放花
Ｆｉｇ．５　ＭａＭＹＢ１ｇｅｎｅ　ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ　ｉｎ　ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ　ｔｉｓｓｕｅｓ
ａｎｄ　ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ　ｆｌｏｗｅｒ　ｓｔａｇｅｓ
Ｒ．Ｒｏｏｔ；Ｓ．Ｓｔｅｍ；Ｌ．Ｌｅａｆ；Ｓ１．Ｕｎｐｉｇｍｅｎｔｅｄ　ｆｌｏｗｅｒ；
Ｓ２．Ｓｌｉｇｈｔｌｙ　ｐｉｇｍｅｎｔｅｄ　ｆｌｏｗｅｒ；Ｓ３．Ｊｕｓｔ　ｂｅｆｏｒｅ　ａｎｔｈｅｓｉｓ　ｆｌｏｗｅｒ；
Ｓ４．Ｆｕｌｙ　ｏｐｅｎｅｄ　ｆｌｏｗｅｒ
　　本研究结果表明，ＭａＭＹＢ１基因与已知的
Ｒ２Ｒ３－ＭＹＢ有很高的同源性。此外，有报道指示，
调节花色素生物合成的 Ｒ２Ｒ３－ＭＹＢ转录因子与
ＢＨＬＨ转录因子密切相关［１８－１９］，如玉米的 ＺｍＣ１
和ＢＨＬＨ［２０］，矮牵牛的 ＡＮ２ＭＹＢ与 ＡＮ１／ＪＡＦ１３
ＢＨＬＨｓ［２１］，以及金鱼草的 ＲＯＳＥＡ１、ＲＯＳＥＡ２与
ＶＥＮＯＳＡ　ＭＹＢｓ等［２２］。这些 ＭＹＢ转录因子都需
要与ＢＨＬＨ形成二聚体的形式来发挥其调节功能。
而ＭａＭＹＢ１基因的Ｒ３结构域内也存在着１个与
ＢＨＬＨ蛋白结合的结构域，由此可推断，ＭａＭＹＢ１
在起调控功能的时候，可能需要与ＢＨＬＨ 蛋白结
合，才能更好地起到转录调节的作用，但该转录因子
是否与花色素的合成调控有关，还有待进一步研究。
此外，学者们在对Ｒ２Ｒ３－ＭＹＢ结构的研究中发
现，在Ｒ２Ｒ３区域外存在１个与调节花色素相关的
结构域ＫＰＲＰＲ［Ｓ／Ｔ］［Ｆ／Ｌ］［２，２３］。但是从单子叶植
物中克隆到的 Ｒ２Ｒ３－ＭＹＢ转录因子，如文心兰的
ＯｇＭＹＢ１［２４］、蝴蝶兰的 ＰｓＵＭＹＢ６［２５］以及玉米的
ＺｍＣ１都未发现该结构域，表明在单子叶和双子叶
植物中，与色素调节相关的 ＭＹＢ转录因子存在着
一定的差异［２６］。本研究结果显示，在 ＭａＭＹＢ１氨
基酸序列中未发现ＫＰＲＰＲ［Ｓ／Ｔ］结构域。
调节类黄酮合成的Ｒ２Ｒ３－ＭＹＢ转录因子有不
同的亚族，如矮牵牛的ＡＮ２、拟南芥的ＰＡＰ１、ＰＡＰ２
和ＴＴ２，它们在花、果实、种子和内果皮的花色素和
原花色素的生物合成中起着重要作用。玉米的
ＺｍＣ１、Ｐ１ 以 及 拟 南 芥 的 ＭＹＢ１１、ＭＹＢ１２ 和
ＭＹＢ１１１基因有着相似的功能，它们与幼苗和内果
皮的黄酮醇和鞣红物质的合成有关［９］。本研究结果
表明，ＭａＭＹＢ１与玉米Ｐ１和拟南芥 ＭＹＢ１２的关
系较近，说明 ＭａＭＹＢ１对类黄酮的合成可能有调
节作用。
实时定量ＰＣＲ分析结果表明，ＭａＭＹＢ１基因
在花中的表达量高于其他组织，且在花发育过程中
表达量有显著变化，因此可以推测，ＭａＭＹＢ１主要
在花中发挥表达调控功能。
根据本研究结果，笔者推测 ＭａＭＹＢ１基因可
能在葡萄风信子的花中发挥调控功能，且有可能与
类黄酮的合成相关。下一步的研究是构建该基因的
表达载体，通过转化模式植物，进一步探究其在生物
体中的调控功能。
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ｌａｔｏｒ　ｆｏｒ　ｔｈｅ　ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ　ｏｆ　ｒｅｄ　ｃｏｌｏｒａｔｉｏｎ　ｉｎ　ａｐｐｌｅ　ｓｋｉｎ［Ｊ］．
Ｐｌａｎｔ　ａｎｄ　Ｃｅｌ　Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ，２００７，４８：９５８－９７０．
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［９］　Ｎａｋａｔｓｕｋａ　Ｔ，Ｈａｒｕｔａ　Ｋ　Ｓ，Ｐｉｔａｋｓｕｔｈｅｅｐｏｎｇ　Ｃ，ｅｔ　ａｌ．Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａ－
ｔｉｏｎ　ａｎｄ　ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ　ｏｆ　Ｒ２Ｒ３－ＭＹＢ　ａｎｄ　ｂＨＬＨ　ｔｒａｎｓｃｒｉｐ－
ｔｉｏｎ　ｆａｃｔｏｒｓ　ｒｅｇｕｌａｔｉｎｇ　ａｎｔｈｏｃｙａｎｉｎ　ｂｉｏｓｙｎｔｈｅｓｉｓ　ｉｎ　ｇｅｎｔｉａｎ
ｆｌｏｗｅｒｓ［Ｊ］．Ｐｌａｎｔ　ａｎｄ　Ｃｅｌ　Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ，２００８，４９：１８１８－１８２９．
［１０］　Ｙａｍａｇｉｓｈｉ　Ｍ，Ｓｈｉｍｏｙａｍａｄａ　Ｙ，Ｎａｋａｔｓｕｋａ　Ｔ，ｅｔ　ａｌ．Ｔｗｏ　Ｒ２Ｒ３－
ＭＹＢ　ｇｅｎｅｓ，ｈｏｍｏｌｏｇｓ　ｏｆ　ｐｅｔｕｎｉａ　ＡＮ２，ｒｅｇｕｌａｔｅ　ａｎｔｈｏｃｙａｎｉｎ　ｂｉｏ－
ｓｙｎｔｈｅｓｅｓ　ｉｎ　ｆｌｏｗｅｒ　ｔｅｐａｌｓ，ｔｅｐａｌ　ｓｐｏｔｓ　ａｎｄ　ｌｅａｖｅｓ　ｏｆ　ａｓｉａｔｉｃ　ｈｙｂｒｉｄ
Ｌｉｌｙ［Ｊ］．Ｐｌａｎｔ　ａｎｄ　Ｃｅｌ　Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ，２０１０，５１：４６３－４７４．
［１１］　Ｇｒｏｔｅｗｏｌｄ　Ｅ，Ｓａｉｎｚ　Ｍ　Ｂ，Ｔａｇｌｉａｎｉ　Ｌ，ｅｔ　ａｌ．Ｉｄｅｎｔｉｆｌｃａｔｉｏｎ　ｏｆ　ｔｈｅ
ｒｅｓｉｄｕｅｓ　ｉｎ　ｔｈｅ　Ｍｙｂ　ｄｏｍａｉｎ　ｏｆ　ｍａｉｚｅ　Ｃ１ｔｈａｔ　ｓｐｅｃｉｆｙ　ｔｈｅ　ｉｎｔｅｒ－
ａｃｔｉｏｎ　ｗｉｔｈ　ｔｈｅ　ｂＨＬＨ　ｃｏｆａｃｔｏｒ　Ｒ ［Ｊ］．Ｐｒｏｃ　Ｎａｔｌ　Ａｃａｄ　Ｓｃｉ
ＵＳＡ，２０００，９７：１３５７９－１３５８４．
［１２］　Ｂａｕｄｒｙ　Ａ，Ｈｅｉｍ　Ｍ　Ａ，Ｄｕｂｒｅｕｃｑ　Ｂ，ｅｔ　ａｌ．ＴＴ２，ＴＴ８，ａｎｄ
ＴＴＧ１ｓｙｎｅｒｇｉｓｔｉｃａｌｙ　ｓｐｅｃｉｆｙ　ｔｈｅ　ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ　ｏｆ　ＢＡＮＹＵＬＳ
ａｎｄ　ｐｒｏａｎｔｈｏｃｙａｎｉｄｉｎ　ｂｉｏｓｙｎｔｈｅｓｉｓ　ｉｎ　Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ　ｔｈａｌｉａｎａ
［Ｊ］．Ｐｌａｎｔ　Ｊ，２００４，３９：３６６－３８０．
［１３］　Ｚｉｍｍｅｒｍａｎｎ　Ｉ　Ｍ，Ｈｅｉｍ　Ｍ　Ａ，Ｗｅｉｓｓｈａａｒ　Ｂ，ｅｔ　ａｌ．Ｃｏｍｐｒｅｈｅｎ－
ｓｉｖｅ　ｉｄｅｎｔｉｆｌｃａｔｉｏｎ　ｏｆ　Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ　ｔｈａｌｉａｎａ　ＭＹＢ　ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ
ｆａｃｔｏｒｓ　ｉｎｔｅｒａｃｔｉｎｇ　ｗｉｔｈ　Ｒ／Ｂ－ｌｉｋｅ　ｂＨＬＨ　ｐｒｏｔｅｉｎｓ［Ｊ］．Ｐｌａｎｔ　Ｊ，
２００４，４０：２２－３４．
［１４］　Ｄｕｂｏｓ　Ｃ，Ｓｔｒａｃｋｅ　Ｒ，Ｇｒｏｔｅｗｏｌｄ　Ｅ，ｅｔ　ａｌ．ＭＹＢ　ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ
ｆａｃｔｏｒｓ　ｉｎ　Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ［Ｊ］．Ｔｒｅｎｄｓ　Ｐｌａｎｔ　Ｓｃｉ，２０１０，１５：５７３－
５８１．
［１５］　Ｈｉｃｈｒｉ　Ｉ，Ｂａｒｒｉｅｕ　Ｆ，Ｂｏｇｓ　Ｊ，ｅｔ　ａｌ．Ｒｅｃｅｎｔ　ａｄｖａｎｃｅｓ　ｉｎ　ｔｈｅ　ｔｒａｎ－
ｓｃｒｉｐｔｉｏｎａｌ　ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ　ｏｆ　ｔｈｅ　ｆｌａｖｏｎｏｉｄ　ｂｉｏｓｙｎｔｈｅｔｉｃ　ｐａｔｈｗａｙ
［Ｊ］．Ｊ　Ｅｘｐ　Ｂｏｔ，２０１１，６２：２４６５－２４８３．
［１６］　张椿雨，龙　艳，冯　吉，等．植物基因在转录水平上的调控及
其生物学意义 ［Ｊ］．遗传，２００７，２９（７）：７９３－７９９．
Ｚｈａｎｇ　Ｃ　Ｙ，Ｌｏｎｇ　Ｙ，Ｆｅｎｇ　Ｊ，ｅｔ　ａｌ．Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎａｌ　ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ
ｏｆ　ｐｌａｎｔ　ｇｅｎｅｓ　ａｎｄ　ｉｔｓ　ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｃｅ　ｉｎ　ｂｉｏｌｏｇｙ［Ｊ］．Ｈｅｒｅｄｉｔｅｓ
（Ｂｅｉｊｉｎｇ），２００７，２９（７）：７９３－７９９．（ｉｎ　Ｃｈｉｎｅｓｅ）
［１７］　许志茹，李春雷，崔国新，等．植物花青素合成中的 ＭＹＢ蛋白
［Ｊ］．植物生理学通讯，２００８，４４（３）：５９７－６０４．
Ｘｕ　Ｚ　Ｒ，Ｌｉ　Ｃ　Ｌ，Ｃｕｉ　Ｇ　Ｘ，ｅｔ　ａｌ．ＭＹＢ　ｐｒｏｔｅｉｎ　ｏｆ　ａｎｔｈｏｃｙａｎｉｎ
ｂｉｏｓｙｎｔｈｅｓｉｓ　ｉｎ　ｐｌａｎｔ［Ｊ］．Ｐｌａｎｔ　Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ　Ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎｓ，
２００８，４４（３）：５９７－６０４．（ｉｎ　Ｃｈｉｎｅｓｅ）
［１８］　Ｍｏｌ　Ｊ　Ｊ，Ｓｃｈａｆｅｒ　Ｅ，Ｗｅｉｓｓ　Ｄ．Ｓｉｇｎａｌ　ｐｅｒｃｅｐｔｉｏｎ，ｔｒａｎｓｄｕｃｔｉｏｎ，
ａｎｄ　ｇｅｎｅ　ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ　ｉｎｖｏｌｖｅｄ　ｉｎ　ａｎｔｈｏｃｙａｎｉｎ　ｂｉｏ－ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ
［Ｊ］．Ｃｒｉｔ　Ｒｅｖ　Ｐｌａｎｔ　Ｓｃｉ，１９９６，１５：５２５－５５７．
［１９］　Ｗｉｎｋｅｌ－Ｓｈｉｒｌｅｙ　Ｂ．Ｆｌａｖｏｎｏｉｄ　ｂｉｏｓｙｎｔｈｅｓｉｓ：Ａ　ｃｏｌｏｕｒｆｕｌ　ｍｏｄｅｌ
ｆｏｒ　ｇｅｎｅｔｉｃｓ，ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，ｃｅｌ　ｂｉｏｌｏｇｙ，ａｎｄ　ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ
［Ｊ］．Ｐｌａｎｔ　Ｐｈｙｓｉｏｌ，２００１，１２６：４８５－４９３．
［２０］　Ｇｏｆｆ　Ｓ　Ａ，Ｃｏｎｅ　Ｋ　Ｃ，Ｃｈａｎｄｌｅｒ　Ｖ　Ｌ．Ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ　ａｎａｌｙｓｉｓ　ｏｆ　ｔｈｅ
ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎａｌ　ａｃｔｉｖａｔｏｒ　ｅｎｃｏｄｅｄ　ｂｙ　ｔｈｅ　ｍａｉｚｅ　Ｂ　ｇｅｎｅ：Ｅｖｉ－
ｄｅｎｃｅ　ｆｏｒ　ａ　ｄｉｒｅｃｔ　ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ　ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎ　ｂｅｔｗｅｅｎ　ｔｗｏ　ｃｌａｓｓｅｓ　ｏｆ
ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ　ｐｒｏｔｅｉｎｓ［Ｊ］．Ｇｅｎｅｓ　Ｄｅｖ，１９９２，６：８６４－８７５．
［２１］　Ｇｏｏｄｒｉｃｈ　Ｊ，Ｃａｒｐｅｎｔｅｒ　Ｒ，Ｃｏｅｎ　Ｅ　Ｓ．Ａ　ｃｏｍｍｏｎ　ｇｅｎｅ　ｒｅｇｕｌａｔｅｓ
ｐｉｇｍｅｎｔａｔｉｏｎ　ｐａｔｔｅｒｎ　ｉｎ　ｄｉｖｅｒｓｅ　ｐｌａｎｔ　ｓｐｅｃｉｅｓ［Ｊ］．Ｃｅｌ，１９９２，
６８：９５５－９６４．
［２２］　Ｍｏｌ　Ｊ，Ｇｒｏｔｅｗｏｌｄ　Ｅ，Ｋｏｅｓ　Ｒ．Ｈｏｗ　ｇｅｎｅｓ　ｐａｉｎｔ　ｆｌｏｗｅｒｓ　ａｎｄ
ｓｅｅｄｓ［Ｊ］．Ｔｒｅｎｄｓ　Ｐｌａｎｔ　Ｓｃｉ，１９９８，３：２１２－２１７．
［２３］　Ｐｅｅｌ　Ｇ　Ｊ，Ｐａｎｇ　Ｙ，Ｍｏｄｏｌｏ　Ｌ　Ｖ，ｅｔ　ａｌ．Ｔｈｅ　ＬＡＰ１ＭＹＢ　ｔｒａｎ－
ｓｃｒｉｐｔｉｏｎ　ｆａｃｔｏｒ　ｏｒｃｈｅｓｔｒａｔｅｓ　ａｎｔｈｏｃｙａｎｉｄｉｎ　ｂｉｏｓｙｎｔｈｅｓｉｓ　ａｎｄ
ｇｌｙｃｏｓｙｌａｔｉｏｎ　ｉｎ　Ｍｅｄｉｃａｇｏ［Ｊ］．Ｐｌａｎｔ　Ｊ，２００９，５９：１３６－１４９．
［２４］　Ｃｈｉｏｕ　Ｃ　Ｙ，Ｙｅｈ　Ｋ　Ｗ．Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌ　ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ　ｏｆ　ＭＹＢ　ｇｅｎｅ
（ＯｇＭＹＢ１）ｄｅｔｅｒｍｉｎｅｓ　ｃｏｌｏｒ　ｐａｔｔｅｒｎｉｎｇ　ｉｎ　ｆｌｏｒａｌ　ｔｉｓｓｕｅ　ｏｆ　Ｏｎ－
ｃｉｄｉｕｍ　Ｇｏｗｅｒ　Ｒａｍｓｅｙ［Ｊ］．Ｐｌａｎｔ　Ｍｏｌ　Ｂｉｏｌ，２００８，６６：３７９－３８８．
［２５］　Ｍａ　Ｈ，Ｐｏｏｌｅｒ　Ｍ，Ｇｒｉｅｓｂａｃｈ　Ｒ．Ａｎｔｈｏｃｙａｎｉｎ　ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ／ｓｔｒｕｃ－
ｔｕｒａｌ　ｇｅｎｅ　ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ　ｉｎ　Ｐｈａｌａｅｎｏｐｓｉｓ［Ｊ］．Ｊ　Ａｍ　Ｓｏｃ　Ｈｏｒｔｉｃ
Ｓｃｉ，２００９，１３４：８８－９６．
［２６］　Ａｌｂｅｒｔ　Ｎ　Ｗ，Ａｒａｔｈｏｏｎ　Ｓ，Ｃｏｌｅｔｔｅ　Ｖ　Ｅ，ｅｔ　ａｌ．Ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ　ｏｆ　ａｎ－
ｔｈｏｃｙａｎｉｎ　ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ　ｉｎ　Ｃｙｍｂｉｄｉｕｍ　ｏｒｃｈｉｄｓ：Ｖａｒｉａｂｉｌｉｔｙ　ｂｅ－
ｔｗｅｅｎ　ｋｎｏｗｎ　ｒｅｇｕｌａｔｏｒｓ［Ｊ］．Ｐｌａｎｔ　Ｃｅｌ，Ｔｉｓｓｕｅ　ａｎｄ　Ｏｒｇａｎ
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２６１ 西北农林科技大学学报（自然科学版） 第４２卷