全 文 ：应用RAPD标记对百合杂交种真实性鉴定的研究
孙晓梅 1,崔文山 1,杨宏光 1,年玉欣 1,王亚斌 1,罗凤霞 2*
(1沈阳农业大学 林学院,沈阳110161;2北京市农林科学院 蔬菜研究中心,北京100089)
摘要:应用RAPD标记对百合杂交种真实性进行了鉴定。研究表明:采用RAPD分子标记对百合杂交种进行早期鉴定是一种快速
有效的方法。在本试验中杂种既具有相加性带型、单亲本带型,又具有融合双亲的特异带,并出现了新的带型。这样可以通过多个
引物的应用,对杂交种进行早期鉴定。
关键词:RAPD标记;百合;杂交种;鉴定
中图分类号:S682.2 文献标识码:A 文章编号:1000-1700(2006)01-0093-03
StudiesontheIdentificationofLilyHybridsAccordingtoRAPDMarkers
SUNXiao-mei1,CUIWen-shan1,YANGHong-guang1,NIANYu-xin1,
WANGYa-bin1,LUOFeng-xia2*
(1.ShenyangAgriculturalUniversity,Shenyang110161,China;2.BeijingAcademyofAgriculturalandForestSciences,Beijing122000,China)
Abstract: Inthispaper, RAPDmarkerswereinvestigatedtoidentifylilyhybrids. TheresultsshowedthatRAPDmolecular
markerwasahastyandefectivemethodforearlystageidentificationofhybrid.Thehybridhasnotonlyadditivebanding,solo-
parentbanding,butalsoextraordinarybandingwhichisthefusionofitsparents,andanewbandingappearinginthepaterns.
Soearlystageidentificationofhybridisfeasiblewhenmanyprimesareapplied.
Keywords:RAPD;lily;hybrids;identification
在育种工作中常采用形态学、细胞学和同工酶等方法鉴定杂交种,近年来随着分子生物学技术的进步,多
采用分子标记手段对杂交种进行鉴定,此法速度快,准确性高。赵祥云等(1995)研究了用RAPD标记评价百合
品种间遗传关系,结果每个品种都得到了各自独特的带谱[1]。另外,张克中等(2003)利用RAPD标记进行了辐射
百合雄性不育突变体的早期筛选。Persson(1998)和Wen(1999,2001)等用RAPD标记分析了星叶百合和麝香百
合居群内和居群间的遗传变异。Muisers等(1995)从278个RAPD标记中找到1个与百合花的寿命基因紧密连
锁的RAPD标记。荷兰的植物育种与繁殖中心开发了RAPD分子标记系统,找到了与镰刀菌抗性基因连锁的
RAPD分子标记,并构建百合的遗传图谱(Tuyl,1996)。1993年Lee(1993)应用RAPD技术对百合进行分类,根据
15个多态性的标记,对韩国的百合进行了分组。沈阳农业大学林学院园林系于1998年开始进行了百合杂交育
种工作,对授粉方法和百合幼胚培养的培养基成份进行了详细的研究。本研究在此基础上采用RAPD标记对
百合杂交种的真实性鉴定进行了研究。
1 材料与方法
1.1 试验材料
亚洲百合俄维农(Avignon)为母本,麝香百合雪皇后(SnowGueen)为父本的杂交种。
1.2 试验方法
1.2.1供试材料的总DNA提取 采用改良CTAB法提取总DNA。
1.2.2样品DNA的有无和分子量大小的检测 用 0.8%的琼脂糖凝胶电泳检测样品 DNA的有无和分子量的
大小:上样量为2μL;Marker:λ-HindⅢ;浓度:加样3μL。
沈阳农业大学学报,2006-02,37(1):93-95
JournalofShenyangAgriculturalUniversity,2006-02,37(1):93-95
收稿日期:2005-04-07
作者简介:孙晓梅(1970-),女,沈阳农业大学副教授,博士,从事园林植物遗传育种教学和科研工作。*通讯作者Corespondingauthor:罗凤霞
(1958-),女,北京市农林科学院研究员,硕士,从事花卉育种研究。
1.2.3样品 DNA的浓度和纯度的检测 用紫外/可见分光光度计检测 DNA的浓度和纯度:取 5μL样品,加
1995μL重蒸馏水,分别测260nm和280nm处的吸光度。根据下式计算样品DNA的含量:
浓度(μg·μL-1)=A260×50×稀释倍数/1000
式中:50为校正系数,根据平均碱基组成的DNA的摩尔吸光系数而定。
根据公式:纯度=A260/A280计算样品DNA的纯度,如果比值在1.7与2.0之间,则样品被认为是纯的。
1.2.4供试材料的RAPD扩增
1.2.4.1供试材料的 RAPD引物筛选 供
试引物为上海生物工程公司生产的 S1~
S20共20个碱基随机引物。用单引物进行
PCR扩增筛选引物的方法,根据扩增产物
在1.5%琼脂糖电泳条件下条带有无、条带
多少、可重复性,确定扩增效果较好的 12
个引物为扩增引物(其序列见表1)。
1.2.4.2PCR扩增反应条件 PCR反应体
系为20μL体系。10×扩增缓冲液(含MgCl2)2.0μL,25mM4dNTP混合液1.6μL,TaqDNA聚合酶0.2μL,DNA模
板1.0μL,引物1.6μL,灭菌重蒸水13.6μL。PCR反应在PCR热循环仪上进行,PCR反应程序为:
94℃ 30s
94℃ 30s→ 40℃ 2min 45个循环→72℃ 7min→4℃保存
72℃ 3min
1.2.4.3电泳分离 电泳凝胶是含有EB的1.5%的琼脂糖,电泳缓冲液为1×TBE,电压为140V,电泳结束后,在
WD-9403C型紫外透射反射仪下检测扩增谱带效果,用Canon-PC1044型数码相机拍照记录电泳结果并进行
谱带分析。
2 结果与分析
2.1 样品DNA分子量检测
检测结果表明:从百合中提取到了DNA,分子量大约为23000bp,并且可以看出,供试DNA样品中含有杂
蛋白(因为点样孔处发亮)。
2.2 样品DNA纯度及浓度检测
表2 样品DNA纯度及浓度的检测结果
Table2 DNApurityandconcentrationofthesamples
序号 品种编号 杂种来源 纯度 浓度/μg·μL-1
Sequence Code Sourceofhybrids A280 A260 Purity Concentration
07 Z-07 俄维农×雪皇后Avignon×SnowQueon 0.024 0.038 1.566 0.758
从表2可以看出,从百合杂交种中提取出来的DNA样品,其A260/A280均在1.5~2.0之间,说明样品DNA的
纯度均很高,可以用于RAPD分析;同时,样品DNA的浓度也很高,DNA含量在0.4~0.8μg·μL-1,用TE缓冲液
稀释10倍后,用于RAPD分析。
2.3 采用RAPD标记进行杂交种真实性鉴定
鉴定结果表明(图1~3):1,2,3,5号引物谱带部分同母本,且与亲本有共有带;4号引物有3条共有带,且
在2000bp处有特异谱带;6号引物部分同母本,在3000bp处有特异带;7,18,19号引物部分同父本,部分同母
本,与亲本有共有带,且19号引物在1100处有特异带;8,16,17号引物同母本,与亲本有共有谱带。此杂交种
具有相加性带型和新的特异带。
}
表1供试的随机引物及序列
Table1Random primersemployedintheexperimentandtheirsequences
引物 序列(5′-3′) 引物 序列(5′-3′)
Primers Sequences Primers Sequences
S1 GTGACGTAGG S7 CCGCGTCTTG
S2 GGGTAACGCC S8 GAGCGCCTTG
S3 GATGACCGCC S16 CAAGGGCAGA
S4 AAAGCTGCGG S17 GGCAGGCTGT
S5 GTCGCCGTCA S18 CACCCCTGAG
S6 TGAGCGGACA S19 CAGGCCCTTC
·94· 沈 阳 农 业 大 学 学 报 第37卷
1F 1Z07 1M 2F 2Z07 2M 3F 3Z07 3M 4F 4Z07 4M
图1 用引物1~4号对杂交种Z-07的鉴定结果
Figure1 ResultsofhybridZ-07identifiedwithprimer1~4
5F 5Z07 5M 6F 6Z07 6M 7F 7Z07 7M 8F 8Z07 8M
图2 用引物5~8号对杂交种Z-07的鉴定结果
Figure2 ResultsofhybridZ-07identifiedwithprimer5~8
16F 16Z07 16M 17F 17Z07 17M 18F 18Z07 18M 19F 19Z07 19M
图3 用引物16~19号对杂交种Z-07的鉴定结果
Figure3 ResultsofhybridZ-07identifiedwithprimer16~19
3 讨论
杨利平(1997,1998)通过对百合种子重量、种子发芽率、发芽势、幼苗形态及染色体比较,杂种与亲本差异
明显。发现杂种的特征介于亲本之间,染色体观察也显示出杂种染色体中具有双亲染色体的一些特有形态。黄
济明(1982,1983,1985)在百合的杂交种鉴定中,运用形态学、细胞学和同工酶方法对百合杂交种的真实性进行
了鉴定。但上述方法需要时间较长,并且容易受环境因素影响。
本研究表明,采用RAPD标记对百合杂交种的真实性鉴定是快速、有效的。可以看出,杂种既具有相加性
带型、单亲本带型又具有融合双亲的特异带,并出现了新的带型。这样可以通过多个引物的应用,对杂交种进
行早期鉴定,来决定是否有价值继续研究。但是,RAPD技术也存在一定的不稳定性,随机性较高,建议在实际
工作中利用形态学和细胞学方法对杂种进行辅助鉴定,可靠性更大。
参考文献:
[1]赵祥云,陈新露,方 海,等.用RAPD标记评价品种间的遗传关系[J].北京农学院学报,1995,10(2):58-63.
[2]LEEW B.AnapplicationofrandomamplifiedpolymorphicDNA(RAPD)tosystematicsofsomespeciesofLiliuminKorea[J].
KoreanJournalofPlantTaxonomy,1993,23(2):35-42.
[3]WENCS,HSIAOJY.AltitudinalGeneticdiferentiationandDiversityofTaiwanLily(Liliumlongiflorumvar.Formosanum;
Liliaceae)usingRAPDmarkersandmorphologicalcharacters[J].InternationalJournalofPlantSciences,2001,162(2):287-301.
bp
100
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[责任编辑 王 娟]
第1期 孙晓梅等:应用RAPD标记对百合杂交种真实性鉴定的研究 ·95·