全 文 ：百合幼胚离体培养基的筛选
孙晓梅 , 罗凤霞 , 王亚斌 , 董胜君 , 郭 蕊
(沈阳农业大学, 辽宁沈阳 110161)
摘要:以切花百合品种间杂交获得的胚龄为 30～ 50d的幼胚作为外植体 , 进行离体培养基的筛选 。结果表明:基本培养基对萌
发率 、成苗率 、生长势的影响从好到差顺序为 MS>N6>SH>LS>Monnie r>DCR>改良 White;碳源种类对萌发的影响从好到差
顺序蔗糖 、甘露醇 、白糖、葡萄糖 、果糖 , 胚的成活情况与渗透压密切相关;生长素(NAA)不同浓度对幼胚成活的影响从好到
差顺序为 0.001>0.01>0.1>1>0 , 细胞分裂素(6-BA)不同浓度对幼胚成活的影响从好到差顺序为 0.001>0.01>0.1>1>
0。采用正交试验设计对幼胚萌发率及生长情况进行分析得出最优组合培养基为:糖 60g ·L -1+6-BA0.1mg ·L -1+NAA0.001
mg ·L -1+CH和 VB 6 , 基本培养基为MS附加琼脂 10g· L-1 , pH值为 5.0的培养基 。
关键词:百合;幼胚;离体培养
中图分类号:S682.2 +9 文献标识码:A 文章编号:1000-1700(2002)01-0022-05
Screening of Media for the Immature Embryo in Vitro Culture of Lilium
SUN Xiao-mei , LUO Feng-xia , WANG Ya-bin , DONG Sheng-jun , GUO Rui(Shenyang Agricultura l University , Shenyang 110161 , China)
Abstract:The immature embryoes were used as the explants which were 30 ～ 50d after interspecific hybridization to screen in vitro
culture media.The result indicated that the influence of the basic media on germination rate , seedling rate , growth potential was
MS>N6>SH>LS>Monnier>DCR>Improved White.The effect of carbon sources on germination ranked from good to bad as su-
crose , mannitol , white sugar , dextrose , fructose.The survival of embryoes had a closely relation with osmotic pressure.The effect of
NAA concentration on immature embryo survival was 0.001>0.01>0.1>1>0;the effect of BA was 0.001>0.01>0.1>1>0.
Based on the analysis of the immature embryo germination rate and growth in an orthogonal experiment , the best medium was sugar
60g ·L-1 , BA0.1mg ·L -1 , NAA0.001mg ·L-1 , basic medium MS with agar 10g· L-1 added CH and VB 6 , pH5.0.
Key words:Lilium;immature embryo;in vitro culture
在百合杂交育种工作中 , 常有杂种胚发育不良或中途败育现象 , 并导致种子不能发芽 , 其原因可能由于
胚和胚乳的不亲和 , 使杂种胚早期败育所致 。差异大的种间杂交 , 胚和胚乳的发育都是异常的 , 胚呈球形 ,
有胚乳或无或少 , 呈液态 。为防止杂交胚与母体胚乳间的不亲和性 , 克服受精后的障碍 , 可以利用胚培养技
术分离发育不良的胚 , 把即将败育前的种胚进行培养 , 促使胚继续发育至成熟 , 使杂交育种获得成功 。对败
育胚进行早期离体培养 , 在遗传上和育种上均有重要意义 。未成熟的幼胚 , 其离体培养技术难度较大 , 越早
期的胚 , 培养越困难 , 这是离体胚培养的技术关键。沈阳农业大学园林系于 1998年至 2001年进行了切花百
合的远缘杂交育种工作 , 并对百合幼胚离体培养的培养基成份进行了研究 。
1 试验材料与方法
1.1 材料
供试材料为百合品种间杂交获得的胚龄为 30～ 50d的种胚 。
1.2 培养基
(1)将幼胚接种在 MS 、 LS 、 SH、 改良 White、 改良 N6、 Monnier、 DCR共 7种培养基上 , 附加 NAA
0.05mg ·L-1 , 琼脂 10g· L-1, 白糖 30g· L-1 , pH值为 5.0。进行不同基本培养基对幼胚萌发及成苗影响的
试验 。(2)在 MS附加 NAA0.01mg ·L-1培养基上以蔗糖 、 果糖 、 葡萄糖 、甘露醇 、 白糖为碳源培养幼胚(胚
龄为 50d), 碳源浓度均采用 30g·L -1 , pH值为 5.0 , 将胚龄为 30 , 35 , 40 , 45 , 50 , 60d的杂交胚 , 接种到
不同碳源浓度的培养基中(MS+NAA0.01mg ·L-1, pH=5.0), 进行不同碳源及浓度对幼胚萌发和成苗的影响
试验 。(3)把幼胚接种在 pH值为 5.0 , 白糖 30g ·L-1的 MS培养基中 , 附加浓度为 0.001 , 0.01 , 0.1 , 1 , 0
mg ·L-1的生长素(NAA);把幼胚接种在 pH值为 5.0 , 白糖 30g ·L -1的 MS培养基中 , 附加浓度为 0.001 ,
0.01 , 0.1 , 1 , 0mg ·L-1的细胞分裂素(6-BA)测定激素种类和浓度对幼胚萌发及成苗的影响 。(4)采用
收稿日期:2001-09-04
作者简介:孙晓梅 (1970-), 女 , 沈阳农业大学林学院讲师 , 硕士 , 从事园林植物良种繁育研究。
沈阳农业大学学报 , 2002-02 , 33(1):22-26
Journal of Shenyang Agricultural University , 2002-02 , 33(1):22-26
○研究报告 RESEARCH REPORT
L16(45)正交试验设计 , 对幼胚萌发率及生长情况进行综合考虑打分 , 最后以校正打分值为试验指标 。试验因
素及水平排列为 A(白糖浓度 g·L -1)、 B(BA浓度 mg ·L -1)、 C(NAA浓度 mg·L -1)、 D(氨基酸种类)、 E(维
生素种类)。A1=10 , A2=30 , A 3=60 , A 4=90;B1=0 , B2=0.001 , B3=0.1 , B4=1;C1=0.001 , C2=0.01 ,
C3=0.1 , C4=1;D 1为 CH , D2为 LH , D 3为酵母提取物 , D 4为谷氨酰胺;E1为 VB 1, E2为 VB3 , E3为 VB6 , E4
为泛酸钙。
1.3 培养条件
在组培室的培养室中进行光照培养 , 温度(23±3)℃, 日光灯每天光照 14h , 光强 1000 ～ 1200lx 。
1.4 苗长势的评价方法
将苗的生长势 、 叶色及分生情况进行综合考虑 , 把苗长势分为五级 , 从好到坏依次为 Ⅰ 、 Ⅱ 、 Ⅲ 、
Ⅳ、 Ⅴ 。
2 结果与分析
2.1 不同基本培养基对幼胚萌发及成苗的影响
将幼胚接种在 MS 、 LS 、 SH 、改良White 、改良 N6、 Monnier、 DCR共 7种培养基上 , 2个月后调查幼胚萌
发及成苗情况 , 结果见表 1。
表 1 幼胚在不同培养基上萌发及成苗比较
Table 1 The comparison of germinating and seedling from young embryo in different media
培养基 接种数 萌发数 萌发率 成苗数 成苗率 长势
Medium No.of inoculated No.of Germinating rate No.of seedling Seedling rate Condition of growth
explants germination (%) (%)
MS
LS
SH
改良White
改良 N6
Monnier
DCR
从表 1中可以看出 , 幼胚在各种附加相同浓度激素和碳源的培养基上均可萌发 , 但萌发率 、成苗率 、生
长势各不相同 。从好到差依次为 MS>N 6>SH>LS>Monnier>DCR>改良White 。其中 MS培养基的萌发率为
65%, 成苗率为 45%, 且苗叶色绿 、 生长势好 , 分析原因是由于培养基中含有很高量的氮 、钾 , 尤其硝酸
盐的用量很大 , 同时还含有一定数量的铵盐 , 这使得其营养丰富 , 能支持培养物快速生长 , 当久不转移时仍
可维持其生存。其次 , 比较好的培养基为改良 N 6 , 其萌发率和成苗率也较高 , 且苗分生好 , 再生小鳞茎数
目多;SH 、 LS 、 Monnier 3种培养基效果相似 、 长势一般。需要提出的是在 DCR培养基上 , 萌发率较高 , 但
均不成苗 , 且后期胚变白 、发褐 , 改良White培养基不适合幼胚萌发及成苗。
2.2 不同碳源及浓度对幼胚萌发及成苗的影响
2.2.1 不同碳源种类对幼胚萌发及成苗的影响 在 MS附加 NAA0.01mg ·L-1培养基上以蔗糖 、 果糖 、 葡萄
糖 、甘露醇 、白糖为碳源培养幼胚(胚龄为 50d), 2个月后调查幼胚的萌发及成苗情况 , 结果见表 2。
表 2 幼胚在不同碳源的培养基上萌发及成苗比较
Table 2 The comparison of germinating and seedling from young embryo in different carbon source media
碳源种类 接种数 萌发数 萌发率 苗生长势
Carbon source No.of inoculated explants No.of germination Germinating rate Condition of growth
(%)
蔗糖 Sucrose
葡萄糖 Dextrose
果糖 Fructose
甘露醇 Mannitol
白糖 White sugar
对照(无糖)Control
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Ⅰ级
Ⅲ级
Ⅲ级
Ⅴ级
Ⅱ级
Ⅳ级
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33.3
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90
0
Ⅰ级
Ⅲ级
Ⅲ级
Ⅱ级
Ⅰ级
从表 2中可以看出 , 碳源对于胚萌发起着重要的作用 , 在无碳源的培养基胚不能萌发成苗 。比较几种碳
源 , 其中从好到差顺序为蔗糖>甘露醇>白糖>葡萄糖>果糖>对照 。蔗糖为最好碳源 , 萌发及成苗率高 ,
且苗生长势好 , 分生多 , 白糖效果与蔗糖相差不大 。以前特别强调要用很纯净的糖 , 如分析纯蔗糖等 , 是因
为糖在培养基中加入量最大 , 最易带入大量杂质。从本试验结果可以看出采用市售的白糖代替化学纯或分析
纯的蔗糖 , 未见有显著影响。因此在以后的试验中 , 用白糖作碳源可降低培养基成本。
2.2.2 不同碳源不同浓度对幼胚萌发及成苗的影响 将胚龄为 30 , 35 , 40 , 45 , 50 , 60d的杂交胚 , 接种
到不同碳源浓度的培养基中(MS+NAA0.01mg ·L-1 , pH=5.0), 2个月后调查萌发及成苗情况 , 见表 3。
表 3 不同胚龄幼胚在不同碳源不同浓度的培养基上萌发及成苗比较
Table 3 The comparison of germinating and seedling from different age embryo in different carbon concentration media
碳源浓度 30 , 35 , 40d 45d 50d 60d
Carbon 萌发率 成苗率 萌发率 成苗率 萌发率 成苗率 萌发率 成苗率
concentration Germinating Seedling Germinating Seedling Germinating Seedling Germinating Seedling
rate rate rate rate rate rate rate rate
(g· L-1) (%) (%) (%) (%) (%) (%) (%) (%)
白糖 30 White sugar
白糖 60 White sugar
白糖 90 White sugar
白糖 120 White sugar
蔗糖 60 (0.175mol)Sucrose
蔗糖 30+甘露醇 20 (0.198mol)
Sucrose ＆ mannitol
蔗糖 90 (0.263mol)Sucrose
Sucrose
蔗糖 30+甘露醇 40 (0.308mol)
Sucros ＆ mannitol
从表 3中可以看出 , 胚龄为 30 ～ 40d的胚在不同碳源不同浓度的培养基上 , 均无萌发及成苗现象 , 可见
胚龄越小 , 对培养基要求越高 , 即使满足了所需要的渗透压 , 但仍需其他对胚萌发有效的营养条件同时存
在 , 才能萌发 , 可以考虑加入氨基酸及维生素类物质或加入天然提取物 , 或者对其进行胚乳看护培养 , 此研
究有待于进一步深入 。
胚龄为 45～ 60d的幼胚 , 其最适碳源浓度随胚龄不同而不同 , 胚龄越小 , 所需碳源浓度越大 , 即需要较
高渗透压;胚龄越大 , 所需碳源浓度越小 , 即需要较低渗透压。胚龄为 45d时 , 在含白糖 60g· L-1的培养
基上胚萌发率和成苗率最高;胚龄为 50d时 , 在含白糖 30g ·L -1的培养基上胚萌发率为 65%, 成苗率达
60%;当胚龄为 60d时 , 在含白糖 30g ·L -1的培养基上胚萌发率高达 70%, 成苗率达 68%。可以看出在适
应碳源浓度下 , 胚倾向于胚性生长 , 然后成苗 , 而在高渗透压的培养基上胚大多数形成不正常的茎 , 畸形
生长。
含蔗糖 60g ·L -1的培养基与含蔗糖 30g·L -1+甘露醇 20g ·L-1的培养基 , 胚的萌发率与成苗率相似 ,
分析原因是由于两种培养基含糖摩尔数相似 , 因此渗透压也相似 , 说明了胚的成活率与渗透压密切相关 。含
蔗糖 30g·L -1+甘露醇 40g ·L-1的培养基比含蔗糖 90g ·L -1的培养基萌发率与成苗率略低 , 也说明了胚的
成活与渗透压之间的关系 。
2.3 不同激素和浓度对幼胚萌发及成苗的影响
2.3.1 生长素浓度对幼胚萌发及成苗的影响 把幼胚接种在附加不同浓度生长素的培养基上 , 2个月后调
查萌发及成苗情况 。从表 4中可以看出 , 不同浓度 NAA的培养基上的胚萌发率均比对照有所提高 , 且苗长
势相差甚大 , 从好到差的顺序为 0.001>0.01>0.1>1>0。从苗生长势可以看出 , 幼胚萌发后 , 在
NAA0.01 ～ 0.001mg·L -1的培养基上成苗好 , 且 NAA0.001mg ·L -1培养基上的苗比 NAA0.01mg ·L -1培养基
上的苗长得壮;而 NAA0.1mg ·L -1的培养基胚萌发后长得小 , 不成苗;NAA1mg ·L -1的培养基 , 胚发白 ,
呈透明状块。可见 , 幼胚对 NAA浓度的反应是随浓度升高 , 地上部的正常生长受到抑制 , 而附加低浓度的
NAA可以有效地促进胚的萌发和生长。
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表 4 幼胚在附加不同浓度生长素的培养基上萌发及成苗比较
Table 4 The comparison of germinating and seedling from young embryo in different NAA concentration media
NAA浓度 接种数 萌发数 萌发率 苗生长势
NAA concentration No.of inoculated explants No.of germination Germinating rate Condition of growth
(mg ·L-1) (%)
10 -3 20 12 60 Ⅰ级
10
-2
20 12 60 Ⅱ级
10 -1 20 8 40 Ⅲ级
1 20 10 50 Ⅳ级
0(对照) 20 6 30 Ⅴ级
2.3.2 细胞分裂素浓度对幼胚萌发及成苗的影响 把幼胚接种在 pH值为 5.0 , 白糖 30g ·L-1的 MS培养基
上 , 并附加不同浓度的 6-BA , 2个月后调查萌发及生长情况 , 见表 5。
表 5 幼胚在附加不同浓度细胞分裂素的培养基上萌发及成苗比较
Table 5 The comparison of germinating and seedling from young embryo in different CK concentration media
BA浓度 接种数 萌发数 萌发率 苗生长势
BA concentration No.of inoculated explant No.of germination Germinating rate Condition of growth
(mg · L-1) (%)
10 -3 10 7 70 Ⅰ级
10 -2 10 6 60 Ⅱ级
10
-1
10 5 50 Ⅲ级
1 10 8 80 Ⅳ级
0(对照) 10 6 60 Ⅴ级
从表 5中可以看出 , 附加不同浓度 6-BA的培养基对胚的萌发效果与对照相比并不明显 , 但胚萌发
后 , 生长状况明显不同 , 从好到差 6-BA浓度顺序为 0.001>0.01>0.1>1>0。6-BA浓度越低 , 胚萌发后
成苗越好 , 产生的愈伤组织越少;而随 6-BA浓度的提高 , 胚萌发不成苗 , 而产生更多的愈伤组织 。因此
在以后的试验中 , 宜加入低浓度的细胞分裂素或不加 , 才使幼胚直接萌发成苗 。
2.4 综合因子
采用 L16(45)正交试验设计 , 2个月后调查幼胚萌发率及成苗情况 , 结果见表 6。
表 6 幼胚培养的实验设计及结果
Table 6 The design and result of culture experiment of young embryo
试验号 A B C D E 萌发率及生长情况打分值(p) X=(p+1)1/2
Code of experiment 1 2 3 4 5 Score of germinating and growth
1 1 1 1 1 1 8 3
2 1 2 2 2 2 7 2.83
3 1 3 3 3 3 1 1.44
4 1 4 4 4 4 0 0
5 2 1 2 3 4 3 2
6 2 2 1 4 3 13 3.74
7 2 3 4 1 2 1 1.41
8 2 4 3 2 1 0 0
9 3 1 3 4 2 5 2.45
10 3 2 4 3 1 0 0
11 3 3 1 2 4 16 4.12
12 3 4 2 1 3 20 4.58
13 4 1 4 2 3 0 0
14 4 2 3 1 4 1 1.41
15 4 3 2 4 1 10 3.32
16 4 4 1 3 2 5 2.45
K 1 7.24 7.45 3.33 10.40 6.32
K 2 7.15 7.98 12.73 6.95 9.14
K 3 11.15 10.26 5.27 5.86 9.73
K 4 7.18 7.03 1.41 9.51 7.53
k 1 1.81 1.86 3.33 2.60 1.58
k 2 1.79 2.00 3.18 1.74 2.29
k 3 2.79 2.57 1.32 1.47 2.43
k 4 1.80 1.76 0.35 2.38 1.89
R 1 0.81 2.98 1.13 0.85
T=32.72
·26· 沈 阳 农 业 大 学 学 报 第 33卷
○研究报告 RESEARCH REPORT
从表 6中可以看出 , 根据 k 值大小可以分别通过 A 、 B 、 C 、 D 、 E 5因素各水平的比较求得最优水平
组合 A3B 3C 1D 1E 3 , 因为 A因素以 A3为佳 , B 因素以 B 3为最佳 , C因素以 C 1为佳 , D 因素以 D 1为佳 , E
因素以 E 3为佳 。也就是糖 60g· L -1 , 6-BA0.1mg ·L -1 , NAA 0.001mg ·L -1 , 加入 CH和 VB 6的培养基
最佳。
极差 R 越大的因素对指标的影响愈显著 , 本试验中 C为主导因子 , 从极差值可以看出因素的主次关系
为 C-D-A-E-B(从主到次)。对表 6数据进行方差分析 , 结果见表 7。
表 7 幼胚培养的方差分析结果
Table 7 The result of variance analysis for young embryo culture
变差来源 平方和 自由度 均方 均方比 F值
Variance source Sum of squares of deviations Freedom Mean square Mean square rate F 0 .05 F 0 .01
A 2.94 3 0.98 1.88 9.28 29.5
B 1.56 3 0.52 1.00
C 25.33 3 8.44 16.23
D 3.40 3 1.13 2.17
E 1.80 3 0.60 1.15
e 1.56 3 0.52
总和 Total 36.59 18
从表 7可以看出 , A 、 B 、 D 、 E 对幼胚萌发及生长势均无显著影响 , 而 C因素对胚萌发及生长有显著
影响 , 与直观分析结论一致。
3 结论
百合幼胚可以采用离体培养的方法培养成活 , 但萌发率和成苗率随培养基的不同而不同。在基本培养基
中 , MS培养基对百合幼胚萌发和生长效果最好 。通过对各碳源的比较以及从经济角度考虑 , 市售白糖可作
为很好的碳源 , 且胚龄越小 , 所需碳源浓度越大;胚龄越大 , 所需碳源浓度越小 。激素对幼胚成活也有影
响 。一般要求生长素和细胞分裂素浓度较低 , 可有效促进胚萌发和生长。通过正交实验设计得出最佳组合培
养基为基本培养基为 MS附加琼脂 10g ·L -1 , pH值 5.0 , 并加入糖 60g ·L -1、 6-BA0.1mg ·L -1、 NAA0.001
mg ·L-1、 CH和 VB 6。
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[责任编辑 王 娟]