全 文 ：文章编号:1001-4829(2011)01-0270-05
　　收稿日期:2010-07-30
　　基金项目:国家科技支撑计划项目 “温带球根花卉及热带花卉
产业化关键技术研究与示范(2007BAD45B01)”
作者简介:谈晓林(1985-), 女 ,在读硕士 ,主要从事百合育种
方面的研究 , ＊为通讯作者, plantbreed2004@yahoo.com.cn;
wjh0505@gmail.com。
百合不同离体授粉方法的杂交结实研究
谈晓林 1 , 崔光芬 2 , 郑思乡 3 , 王继华 2＊ , 刘飞虎 1＊
(1.云南大学生命科学学院 ,云南昆明　 650091;2.云南省农业科学院花卉研究所 ,云南 昆明　 650205;3.贵州省农业科学院园
艺研究所 ,贵州 贵阳　550006)
摘　要:为克服百合(Liliumssp.)杂交受精前障碍, 以 5个杂种系品种和 1个野生种为试材 , 采用离体柱头授粉 、离体切割花柱授
粉和离体子房授粉方法进行离体授粉杂交。结果显示 ,对于近缘杂交 ,离体柱头授粉的子房膨大率和结实率分别为 30 %和 15
%,离体切割花柱授粉的为 15%和 5%,离体子房授粉的为 25%和 5%;不同杂种系间杂交组合 3种授粉方法的子房膨大率和结
实率分别为 17%和 13%、 3%和 3%、10%和 3%。百合杂交组合类型对离体授粉杂交结实率有明显影响;近缘杂交或系内杂交
组合的子房膨大率和结实率高于远缘杂交(系间杂交)组合。在 3种离体授粉方法中以离体柱头授粉的效果最好 ,其余 2种方法
的效果基本相同。采用胚培救方法获得了部分杂交组合的幼苗 ,经 ISSR分子标记鉴定了杂种的真实性 ,表明通过离体授粉方法
可以获得百合远缘杂交的真实杂种。
关键词:百合;离体授粉;子房膨大;结实
中图分类号:S644.1　　　文献标识码:A
EffectsofDiferentinvitroPolinationMethodson
CapsuleFormationinLiliumHybridization
TANXiao-lin1 , CUIGuang-fen2 , ZHENGSi-xiang3 , WANGJi-hua2＊ , LIUFei-hu1＊
(1.SchoolofLifeScience, YunnanUniversity, YunnanKunming650091, China;2.FlowersResearchInstitute, YunnanAcademyofAgri-
culturalSciences, YunnanKunming650205, China;3.HorticulturalInstitute, GuizhouAcademyofAgriculturalSciences, GuizhouGuiyang
550006, China)
Abstract:Toovercomeincompatibilitycausedbypre-fertilizationbarriersinlilybreeding, cultivarsfromfiveseriesofLiliumhybridsandone
wildspeciesasexperimentalmaterials, diferentinvitropollinationmethodssuchasinvitrostigmaticpolination, invitrocut-stylepolination
andinvitroovarianpolinationwereusedtocarryoutthehybridization.Theresultsshowedthatinintraspecificcroses, percentagesofswol-
lenovariesandshapedcapsuleswere30%and15%forinvitrostigmaticpollination, 15% and5% forinvitrocut-stylepolination, 25
% and5%forinvitroovarianpolination.Ininterspecificcrosses, percentagesofswolenovariesandshapedcapsulesforthethreeinvitro
polinationmethodswere17%and13%, 3%and3%, 10%and3%, respectively.Hybridizationtypehadagreatefectoncapsule
formation;Percentagesofswolenovariesandshapedcapsulesbothwerehigherinintraspecificcrossesthanininterspecificcrosses.Invitro
stigmaticpolinationhadthebestefectforovercomingthepre-fertilizationbarrierinlilyhybridization;theothertwomethodsshowedlessand
sameefectiveness.Hybridseedlingsofsomecombinationswereobtainedbyvirtueofembryorescueandidentificationofthehybridswasac-
complishedwithISSRmarkers, whichverifiedthetruthtoobtainlilyhybridsofinterspecificcrossesusinginvitropolinationtechnique.
Keywords:Lilium;Invitropolination;Ovaryswel;Capsules
　　百合(Liliumssp.)具有食用 、药用和观赏等多
种用途 。百合切花是继世界五大鲜切花(月季 、香
石竹 、菊花 、唐菖蒲 、非洲菊)之后近年发展最快的
新秀 ,而育种工作的快速发展是百合商业市场的重
要推动力之一 [ 1] 。百合育种工作至今约有 100年的
历史 ,主要以荷兰 、美国 、日本为中心 ,如荷兰球根花
卉中心平均每年推出 3 ～ 5个百合新品种[ 2] 。中国
拥有世界百合属(LiliumL.)植物约 100个种中的
近 60多个种和变种 ,资源丰富 ,但育种工作起步晚 ,
发展相对缓慢 ,目前百合商品品种主要从荷兰进
口[ 3] 。
270
西　南　农　业　学　报
SouthwestChinaJournalofAgriculturalSciences　　　　　　　　　　　　　　
2011年 24卷 1期
Vol.24　　No.1
DOI :10.16213/j.cnki.scjas.2011.01.070
当前世界各国培育的百合新品种大部分是通过
远缘杂交育成的[ 5] ,在杂交过程中存在受精前 、后
障碍 ,即杂交不亲和 、杂种胚夭折和杂种不育等 。近
年来发展了一系列的方法和技术 ,如引导授粉 、蕾期
授粉 、切割花柱授粉 、子房授粉 、离体授粉和胚培养
技术等 ,以克服远缘杂交受精前 、后障碍。其中切割
花柱授粉是克服杂交受精前障碍的有力手段 [ 4] ;离
体授粉技术因其易调控试材生长及授粉环境 ,可得
到一个杂种种子或幼龄原胚 ,为采用胚培救技术克
服受精后障碍提供基础 ,近年来受到广泛关注 [ 6 ～ 8] 。
刘春等(2006)比较了百合非离体子房授粉和离体
子房授粉对花粉萌发 、生长及受精的影响 ,发现采用
离体授粉方式可提高杂交结实率 [ 9] 。本实验以多
种百合为试材 ,将离体授粉与切割花柱授粉 、子房授
粉等相结合 ,研究不同离体授粉方法对百合杂交结
实的影响 ,为克服百合远缘杂交受精前障碍提供技
术支撑 。
1　材料与方法
1.1　百合离体授粉
1.1.1　供试亲本　供试亲本一部分由云南省农业
科学院园艺所花卉研究中心提供 ,一部分购自云南
花卉市场 ,包括麝香百合杂种系的新铁炮百合(L),
东方百合杂种系的 Sorbonne(O1)和 Janna(O2);东
方百合 ×喇叭百合杂种系的 Robina(OT),麝香百合
×亚洲百合杂种系的 RoyalSunset(LA),以及野生
种兰州百合 L.davidivar.unicolor(W)。
1.1.2　杂交组合　杂交组合包括近缘 (同一杂种
系的品种间或明显有亲缘关系的亲本杂交如 O×O
及 OT×O)杂交组合和远缘(不同杂种系之间)杂交
组合;由于可取材料数量的限制 ,有些组合的授粉雌
蕊(外植体)数量较少 ,具体情况见表 1和表 2。
1.1.3　实验方法　①取材与接种。在超净工作台
上将开花前 1 ～ 2d的花苞先用 75 %的酒精浸泡 2
min,无菌水冲洗 ,再用 75 %的酒精浸泡 1min,无菌
水冲洗 。剥去花瓣 ,将雌蕊接种在无菌培养基上 ,花
药放置在垫有无菌滤纸的无菌瓶中 ,在培养架上培
养 ,待花药开裂获得花粉。 ②授粉方法和培养条件 。
雌蕊在培养基中培养 5 ～ 7d后 ,均授以当天开裂花
药的花粉。授粉方法包括离体柱头授粉 、离体切割
花柱授粉(在距子房顶部 0.2 ～ 0.3 cm处将花柱及
柱头切除)、离体子房授粉(将花柱及柱头全部切
除)。接种培养基为 MS+0.02 mg/LNAA+酸水解
酪蛋白 500 mg/L+白糖 6 %+琼脂 0.7 %。授粉
前后的材料和授粉前的花药均放置在温度(22±2)
℃、光照长度 13 h/d、光照强度为 1800 ～ 2000 lx条
件下培养 。授粉后 30 d观察统计子房膨大数和蒴
果数(子房壁变黄 ,内含带种翅的种子)。③杂种胚
挽救培养 。授粉后 40 ～ 50 d,从膨大蒴果中取出幼
小种子 ,在 80×体式显微镜下剥离出胚接种在 MS
+0.1 mg6-BA /L培养基上培养。培养基中添加
500 mg/L酸水解酪蛋白 、6 %蔗糖 、0.7 %琼脂 , pH
值为 5.8;置于温度(22 ±2)℃、光照长度 13 h/d、
光照强度 1800 ～ 2000lx条件下培养。
1.2　百合杂交后代 ISSR鉴定
1.2.1　供试材料及 DNA提取　麝香百合杂种系新
铁炮百合 Liliumformolongi(母本 L)、东方百合杂种
系索邦 Sorbonne(父本 O1),以及它们的离体授粉杂
交 F1株系幼苗;亲本和 F1株系分别取 0.05 ～ 0.1 g
叶片采用改良的 CTAB法[ 10]提取 DNA。
1.2.2　ISSR-PCR扩增　20μlPCR扩增反应体系:
25 ngDNA模板 , 2 μl10×Bufer, 1 UTaqDNA酶 ,
2.0 mmol/LMg2+ , 0.3 mmol/LdNTPs, 0.5 μmol/L
引物 。经筛选使用的引物序列为 5′-(AG)8CG-3′。
PCR扩增反应程序为:94 ℃预变性 5 min, 94 ℃变
性 40s, 52℃退火复性 45s, 72℃延伸 90s,共 37个
循环 ,最后 72 ℃延伸 9 min。 8 μlPCR产物用 1.2
%琼脂糖凝胶在 1×TAE缓冲液和 80V电压下电泳
80min,并以 DL2000DNALadderMarker为分子量参
照物 ,在紫外灯下观察谱带并摄影 。
2　结果与分析
2.1　不同离体授粉方法对百合近缘杂交结实的影
响
亲缘关系较近的杂交组合类型包括 OT×O1 ,
O2 ×OT, O1 ×O2(前面为母本 ,后面为父本 ,下同)。
不同离体授粉方法的子房膨大率和结实率 ,离体柱
头授粉的分别为 30 %和 15 %,离体切割花柱授粉
的分别为 15%和 5 %,离体子房授粉的分别为 25
%和 5 %;杂交组合类型 OT×O1的膨大率和结实
率分别为 27%和 7 %, O1 ×OT的分别为 27 %和
0, O1 ×O2的分别为 20 %和 13 %。胚挽救培养获
得幼苗的情况与蒴果膨大密切相关[ 11] (表 1)。
2711期 　　　　　　谈晓林等:百合不同离体授粉方法的杂交结实研究
表 1　3种离体授粉方法对百合近缘杂交结实的影响
Table1　CapsuleproductionofdifferentinvitropolinationmethodsinhybridizationofOrientalhybridrelatives
杂交类型
Hybridization
type
离体柱头授粉
Invitrostigmaticpolination
离体切割花柱授粉
Invitrocut-stylepolination
离体子房授粉
Invitroovarianpolination
授粉数
Explants
膨大数
Swels
蒴果数
Capsules
出苗种子数
Seedlings
授粉数
Explants
膨大数
Swels
蒴果数
Capsules
出苗种子数
Seedlings
授粉数
Explants
膨大数
Swells
蒴果数
Capsules
出苗种子数
Seedlings
OT×O
1 5 1 0 0 5 2 1 0 5 1 0 0
O1 ×OT 5 1 0 0 5 1 0 0 5 2 0 0
O1 ×O2 10 4 3 8 10 0 0 0 10 2 1 1
合计 20 6 3 8 20 3 1 0 20 5 1 1
　　注:OT———东方百合×喇叭百合杂种系的 Robina;O1———东方百合杂种系的Sorbonne;O2———东方百合杂种系的 Janna。
表 2　3种离体授粉方法对百合远缘杂交结实的影响
Table2　Capsuleproductionofdiferentinvitropolinationmethodsinhybridizationofdiferenttypesoflilies
杂交类型
Hybridization
type
离体柱头授粉
Invitrostigmaticpolination
离体切割花柱授粉
Invitrocut-stylepolination
离体子房授粉
Invitroovarianpolination
授粉数
Explants
膨大数
Swels
蒴果数
Capsules
出苗种子数
Seedlings
授粉数
Explants
膨大数
Swels
蒴果数
Capsules
出苗种子数
Seedlings
授粉数
Explants
膨大数
Swells
蒴果数
Capsules
出苗种子数
Seedlings
O
1
×LA 1 0 0 0 1 0 0 0 1 0 0 0
W×LA 1 0 0 0 1 0 0 0 1 0 0 0
LA×W 1 1 1 0 1 1 1 0 1 1 1 0
O1 ×W 8 0 0 0 8 0 0 0 8 0 0 0
L×OT 2 0 0 0 2 0 0 0 2 0 0 0
OT×L 1 0 0 0 1 0 0 0 1 0 0 0
O1 ×L 4 0 0 0 4 0 0 0 4 0 0 0
L×O1 11 4 3 43 11 0 0 0 11 1 0 21
L×W 1 0 0 0 1 0 0 0 1 1 0 0
合计 30 5 4 43 30 1 1 0 30 3 1 21
　　注:O1———东方百合杂种系的Sorbonne;LA———麝香百合 ×亚洲百合杂种系的 RoyalSunset;W———野生种兰州百合 L.davidivar.unicol-or;L———麝香百合杂种系的新铁炮百合;OT———东方百合 ×喇叭百合杂种系的 Robina。
2.2　不同离体授粉方法对百合远缘杂交结实的影
响
远缘(不同杂种系间)杂交组合类型包括 O1 ×
LA、W×LA、LA×W、O1 ×W、L×OT、OT×L、O1 ×
L、L×O1及 L×W。从表 2看出 ,离体柱头授粉的
子房膨大率和结实率分别为 17 %和 13 %,离体切
割花柱授粉的分别为 3 %和 3 %,离体子房授粉的
分别为 10%和 3 %。对于这 9个远缘杂交组合类
型 ,综合 3种离体授粉方法的杂交效果 ,其中 6个组
合的子房膨大率和结实率均为 0, L×W的 3个授粉
后的子房有 1个膨大但未形成蒴果 , LA×W的 3个
授粉后的子房均膨大并形成蒴果 , L×O1的子房膨
大率和结实率达到 15 %和 9 %。但如果从特定类
型组合与特定授粉方法配合的杂交效果来看 , L×
O1组合配合离体柱头授粉的子房膨大率和结实率
达到了 36%和 27%。除个别例外(如离体子房授
粉的 L×O1组合),胚挽救培养获得幼苗的情况与
蒴果膨大密切相关[ 11] 。
2.3　杂交后代 ISSR鉴定
从扩增产物的凝胶电泳图谱可以看出 ,供试材
料的扩增条带大小在 500bp至略大于 2000bp的范
围内 。杂种 F1株系 2 ～ 5在大于 2000 bp处与父本
6有共同条带(粗箭头),而在大于 1000小于 2000
bp处与母本 1有共同条带(细箭头)[ 12 ～ 13] (图 1)。
M:DL2000DNA分子量标准;1:母本(麝香百合杂种系的新铁炮百
合);2 ～ 5:杂种 F1 株系;6:父本(东方百合杂种系的 Sorbonne)M:
DL2000DNAmarker;1:FemaleparentLilium×formolongi;2-5:F1
lines;6:MaleparentSorbonne
图 1　亲本及杂种 F
1
的 ISSR标记电泳图谱
Fig.1　ISSR-PCRamplificationpaternsoftheF1 linesandtheirpar-
ents
272 西　南　农　业　学　报　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　23卷
3　讨　论
本试验中离体切割花柱授粉和离体子房授
粉的膨大率和结实率均低于离体柱头授粉 。原
因可能是:①切割花柱或切除花柱后 ,缺少柱头
粘液粘附花粉及对花粉管的萌发和生长的保护
和营养作用 ,花粉管在尚未成熟时就进入子房 ,
花粉管穿透珠孔的能力低 [ 1 4 ～ 15] ;②授粉量太低 ,
通过多次授粉增大授粉量可能使效果有所改
善 [ 16 ～ 1 7] 。离体子房授粉的膨大率高于离体切割
花柱授粉 ,其原因可能是前者全部切除花柱后有
更大的授粉面积 。此外 ,由于不同开花时期的花
柱对花粉管穿透珠孔的效率有所影响 [ 1 8] , 这也
许是造成离体柱头授粉的不同雌蕊其子房膨大
情况出现差异的原因 。
运用 3种离体授粉方法杂交 , 近缘杂交组合
O1 ×O2的结实率明显高于 OT×O1和 O1 ×OT,
这从一定程度上反映了百合同一杂种系内的杂
交比非同一杂种系内(尽管有明显的亲缘关系如
OT×O1)的杂交更具亲和性 。在实验中发现子
房膨大不一定能形成有种子的蒴果 ,如杂交组合
L×W、O3 ×OT和 OT×O8(资料未列出)等 ,但其
子房壁生长良好 ,通过解剖发现里面的胚珠白色
干瘪 ,这可能是由于外源激素 NAA的刺激引起
的假膨大 ,受精并未成功 ,其具体原因及机理还
有待进一步的研究 。
在实验后期笔者采用胚培救方法克服杂交
受精后障碍 ,即将胚珠或胚剥出进行组织培养 ,
在 2 ～ 3个月后获得了部分杂交组合的杂种苗 。
而对于部分杂交组合如 LA×W,虽然获得大量种
子 ,但仅有 1粒种子萌发 ,且到后期夭折 ,这表明
此杂交组合的受精后障碍非常严重 ,幼胚发育中
途停止且幼苗成活性差 ,这也是今后研究的主要
课题之一 。将离体授粉和胚培救系统地结合起
来以形成一整套技术 ,可望在克服百合杂交受精
前 、后障碍方面获得更好的效果 。
在实验中发现 ,不管是百合近缘杂交还是远
缘杂交 ,离体柱头授粉的子房膨大率和结实率均
为最高;离体子房授粉和离体切割花柱授粉的结
实率相同 ,但前者的膨大率较高 。这一实验结果
与陈琼等 [ 19] 在非离体条件下得出的结果类似 ,
即切割花柱授粉的结实率比常规柱头授粉的显
著下降 。但同时有人认为离体切割花柱授粉和
离体子房授粉的膨大率及结实率均要高于离体
柱头授粉 [ 8, 20] ,这是否与笔者所采用的杂交组合种
类及授粉数量有关系还有待进一步的实验论证。
笔者将离体授粉杂交实验结果与非离体授粉杂
交组合进行比较 ,发现杂交组合 O1 ×O2、O1 ×L、O1
×W在非离体授粉情况下得到了种子 ,通过离体授
粉却未得到种子;L×O1 、OT×O1通过离体授粉获
得了种子 ,在非离体授粉情况下未得到种子;O1 ×
OT在非离体授粉和离体授粉情况下均未得到种子 ,
但在离体授粉情况下得到了膨大子房;L×W在非
离体授粉情况下得到种子 ,通过离体授粉只得到膨
大子房。这些观察结果表明离体授粉可能并不是所
有百合杂交组合克服受精前障碍的最佳方法 。
通过 ISSR分子标记鉴定了杂交组合 L×O1杂
种幼苗的真实性 ,实验结果显示杂交后代均与双亲
有共有带 ,这表明杂交后代是真实的 。同时发现杂
交后代与父本的共有带多于母本 ,这是否暗示其遗
传性状更偏向于父本。本试验结果证明通过离体授
粉方法结合胚培救可以获得百合远缘杂交的真实杂
交后代。
参考文献:
[ 1]程金水.园林植物遗传育种学 [ M] .北京:中国林业出版社 ,
2000.309-311.
[ 2]夏宜平 , 高晓辰 , 郑慧俊.百合种球酝酿国产化 [ J] .中国花卉
园艺 , 2003(33):11-13.
[ 3]吴学尉 , 丁仁展 , 屈云慧 , 等.现代百合品种发展趋势 [ J].北
方园艺 , 2007(2):51-52.
[ 4] LiTH, NimiY.Acomparisonofseedsetsinselfintraspecificand
intersperspecificpolinationofLiliumspeciesbystigmaticandcut
stylepolinationmethods[ J] .JournaloftheJapaneseSocietyfor
HorticultureScience, 1995, 64(1):149-159.
[ 5]瞿素萍 ,虞　泓 ,吴学尉 ,等.亚洲百合种内杂交后代的多态性
及其分离 [ J] .西南农业学报 , 2009, 22(2):444-448.
[ 6] vanTuylJM, vandeSandeK, DiënR, etal.Overcominginterspe-
cificcrossingbariersinLiliumbyovaryandembryoculture[ J].
ActaHorticulturae, 1990, 266:317-322.
[ 7] DalviV.A,罗高玲 ,罗瑞鸿 ,等.木豆胞质雄性不育系柱头活力
研究 [ J] .西南农业学报 , 2010, 23(2):480-482.
[ 8]李林玉 ,杨丽英 ,王　馨 ,等.灯盏花的繁育系统与访花昆虫初
步研究 [ J] .西南农业学报 , 2009, 22(2):454-458.
[ 9]刘　春 , 穆　鼎 , 明　军 , 等.百合种间杂交受精前障碍的研究
[ J] .园艺学报 , 2006, 33(3):653-656.
[ 10]邹喻苹 , 葛　颂 , 王晓东.系统与进化植物学中的分子标记
[ M] .北京:科学出版社 , 2001.9-29.
[ 11]王少平 ,林紫玉 ,杜绪明.胚拯救技术及百合的胚培养研究进展
[ J] .广东农业科学 , 2009(6):169-171.
[ 12]宋晓兵 ,彭埃天 ,刘景梅 , 等.ISSR分子标记及其在中国南方果
树上的应用 [ J] .广东农业科学 , 2009(7):199-201.
[ 13]卓书斌 ,黄小凤 ,王峥峰 , 等.粤引大脆蜜青枣的 ISSR分子标记
鉴定分析 [ J] .广东农业科学 , 2008(10):9-10.
[ 14] vanTuylJM, vanDienMP, vanCreijMGM, etal.BinoRJ.
Applicationofinvitropolination, ovaryculture, ovulecultureand
2731期 　　　　　　谈晓林等:百合不同离体授粉方法的杂交结实研究
embryorescueforovercomingincongruitybarriersininterspecificLili-
umcroses[ J] .PlantScience, 1991, 74:115-126.
[ 15] SanchezAM, BoschM, BotsM, etal.Pistilfactorscontroling
polination[ J] .ThePlantCell, 2004, 16:98-106.
[ 16]罗建让 , 张延龙, 张林华.克服百合自交及杂交障碍方法的初
步研究 [ J] .西北农业学报 , 2007, 16(4):260-263.
[ 17]张红梅 ,刘光华 ,魏团仁 , 等.香料烟F1代杂交制种的主要影响
因素研究 [ J] .广东农业科学, 2008(11):11-13.
[ 18] WilemseMTM, PlyushchTA, ReindersMC.Invitromicropylar
penetrationofthepolentubeintheovuleofGasteriaverrucosa
(Mil.)H.DuvalandLiliumlongiflorumThunb-conditions, atrac-
tionandapplication[ J] .PlantScience, 1995, 108(2):201-
208.
[ 19]陈　琼 , 穆　鼎 , 义鸣放 , 等.不同授粉方法对克服百合杂交
受精前障碍的作用 [ J].中国农业大学学报 , 2007, 12(4):35-
40.
[ 20]刘　妍 , 郑思乡 , 关文灵 , 等.L×OT和 OT×L的新型百合离
体授粉杂交研究初报 [ J].西部林业科学 , 2009, 38(1):105-
108.
(责任编辑　王家银)
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