全 文 ：分子植物育种，2014年，第 12卷，第 1期，第 138-143页
Molecular Plant Breeding, 2014, Vol.12, No.1, 138-143
研究报告
Research Report
异源三倍体为父本的百合杂交后代倍性调查及 FISH分析
房磊 杨斌 张伟娜 辛昊阳 高婷婷 施季森 郭佳 席梦利 *
南京林业大学林木遗传与生物技术省部共建教育部重点实验室,南京, 210037
*通讯作者, ximenglinjfu@126.com
摘 要 本研究通过调查异源三倍体为父本的百合杂交后代倍性及其追踪染色体来源，来探讨异源三倍体
的遗传规律。采用核型分析方法，对以雄性不育的二倍体亚洲百合 GHC-01为母本，以 Longiflorum×Asiatic
系列的异源三倍体百合‘Ceb Dazzle’为父本杂交获得的 30个杂交后代及其父母本进行了染色体数目的统
计，同时利用 45S rDNA荧光原位杂交技术，对父母本以及 4个杂交后代进行了 45S rDNA荧光原位杂交分
析。核型分析结果表明，GHC-01和‘Ceb Dazzle’的染色体数目分别为 24 (2n=2x=24)和 36 (2n=3x=36)，30个
杂交后代中染色体数目为 24、25、26、35、36的分别有 13、10、4、2、1个基因型的杂交后代；荧光原位杂交结果
表明，GHC-01和‘Ceb Dazzle’分别有 11个和 14个 45S rDNA荧光原位杂交位点，4个所研究的杂交后代中
均有不同数目的典型父本染色体。基于倍性统计和荧光原位杂交结果，对杂交后代的早期鉴定以及异源三倍
体在育种中的作用进行了讨论。
关键词 百合,异源三倍体,倍性统计,荧光原位杂交
The Ploidy Level Investigation and FISH Analysis of the Progenies from
Allotriploid Lilium as Male
Fang Lei Yang Bin Zhang Weina Xin Haoyang Gao Tingting Shi Jisen Guo Jia Xi Mengli *
Key Laboratory of Forest Genetics and Biotechnology Ministry of Education, Nanjing Forestry University, Nanjing, 210037
* Corresponding author, ximenglinjfu@126.com
DOI: 10.13271/j.mpb.012.000138
Abstract In order to explore the genetic rule of allotriploid, we studied the ploidy level and the origin of the pro-
genies’chromosome from cross using allotriploid Lilium as male. The chromosome number of the parents and the
thirty progenies from cross between the male-sterile Asiatic hybrid Lilium GHC-01 (♀) and the Longiflorum×
Asiatic hybrid Lilium‘Ceb Dazzle’(♂) were studied by karyotype analysis. Meanwhile, four progenies and their
parents were also analyzed by 45S rDNA fluorescence in situ hybridization (FISH). The karyotype analysis of
result indicated that the chromosome number of GHC-01 and‘Ceb Dazzle’was 24 (2n=2x=24) and 36 (2n=3x=
36) respectively. The progeny number of which had 24, 25, 26, 35and 36 chromosomes were 13, 10, 4, 2 and 1
respectively in all the thirty progenies. The fluorescence in situ hybridization of result showed that the number of
the 45S rDNA sites about GHC-01 and‘Ceb Dazzle’were 11 and 14 respectively. There were different numbers
of typical chromosome contributed by male in the four progenies. Based on the result of the ploidy level statistics
and FISH, the early identification of hybrid and the perspective of allotriploid as male in the polyploidy breeding
program of Lilium were discussed.
Keywords Lilium, Allotriploid, Ploidy level statistics, Fluorescence in situ hybridization
收稿日期：2013-04-26 接受日期：2013-07-24 网络出版日期：2013-07-30
URL: http://5th.sophiapublisher.com/abstract-1618-mpbopa
基金项目：本研究由国家林业局 948项目(2013-4-34)和江苏省农业科技自主创新资金项目(CX(12)2018)共同资助
百合(Lilium)为多年生草本球根花卉(汪发瓒和
唐进, 1980)，以其花朵硕大、色彩丰富、花姿优美，成
为世界上重要的球根类切花之一。百合属共有 80余
种，依其生物学特性分为 7组，即：Lilium、Martagon、
Pseudolirium、Archelirion、Sinomartagon、Leucolirion 和
Oxypetala，而广泛应用于鲜切花和园林绿化的东方
百合、亚洲百合和麝香百合这 3大杂种系分别来源
于 Sinomartagon、Leucolirion 和 Archelirion 的组内种
间杂交。为了研究百合的遗传规律和培育出观赏价
值较高的百合新品种，国内外专家学者一直致力于
百合杂交育种方面的实践研究工作。
三倍体或者异源三倍体由于亲本基因组在减数
分裂期间进行不规则的染色体配对导致其败育(封
紫等, 2012; Asano, 1982; Barba-gonzalez et al., 2004;
Lim et al., 2000; Zhou et al., 2011)，而很少被应用于
杂交育种中。然而，异源三倍体百合能产生可育的非
整倍体和整倍体(x, 2x和 3x)配子(封紫等, 2012)，从
而产生大量倍性不一的杂交后代个体。已有的报道
显示，异源三倍体百合作为母本，是理想的育种材料
而应用于杂交育种中(雷家军和梁印, 2012; Zhou,
2007; Xie, 2012; Lim et al., 2003)。
虽然，以异源三倍体为母本在百合杂交育种中
得到了广泛的研究和应用，然而，对于其作为父本的
可行性以及杂交 F1代的倍性却很少得到关注。为了
弥补对异源三倍体研究的不足，本研究利用异源三
倍体‘达诺’(‘Ceb Dazzle’)做父本，二倍体亚洲百合
做母本进行杂交，通过胚培养获得 30个 F1代杂交后
代，并对其所有 F1代杂交后代的倍性进行了统计以
及 4个杂交后代进行了 FISH分析，以此探索异源三
倍体在百合杂交育种中的遗传规律，旨在为异源三
倍体在百合育种中的应用提供一定的细胞学依据。
1结果与分析
通过对母本 GHC-01和父本‘Ceb Dazzle’的
染色体数目的观察和统计，确定 GHC-01的染色
体数目为 2n=2x=24，‘Ceb Dazzle’的染色体数目为
2n=3x=36。
由图 1可知，30个杂交 F1代中染色体数目为 24
条的有 13个杂交后代，染色体数目为 25条的有 10
个杂交后代，染色体数目为 26条的有 4个杂交后
代，染色体数目为 35和 36条的分别只有 2个和 1
个后代。图 1中，杂交后代 GHCD-17、GHCD-11、
GHCD-12、GHCD-07、GHCD-10的染色体数目分别
为 24、25、26、35和 36。
由图 2可知，母本 GHC-01有 11个 45S rDNA
荧光原位杂交位点，父本‘Ceb Dazzle’有 14 个荧
光原位杂交位点，杂交 F1代中，GHCD-04有 11个
荧光原位杂交位点，GHCD-11有 11个荧光原位杂
交位点，GHCD-15有 12 个荧光原位杂交位点，
GHCD-22有 11个荧光原位杂交位点，其中除 GH-
CD-04的染色体数目为 24 外，GHCD-11、GH-
CD-15、GHCD-22的染色体数目都为 25。结合图 3
图 1父母本及 5个 F1代个体的有丝分裂中期染色体形态图
注: A:母本(2n=2x=24); B:父本(2n=3x=36); C: GHCD-17 (2n=2x=24); D: GHCD-11 (2n=2x+1=25); E: GHCD-12 (2n=2x+2=26);
F: GHCD-07 (2n=3x-1=35); G: GHCD-10 (2n=3x=36)
Figure 1 Metaphase chromosome images of the parents and five F1 hybrids
Note: A: Female (2n=2x=24); B: Male (2n=3x=36); C: GHCD-17 (2n=2x=24); D: GHCD-11 (2n=2x+1=25); E: GHCD-12 (2n=2x+
2=26); F: GHCD-07 (2n=3x-1=35); G: GHCD-10 (2n=3x=36)
异源三倍体为父本的百合杂交后代倍性调查及 FISH分析
The Ploidy Level Investigation and FISH Analysis of The Progenies from Allotriploid Lilium as Male 139
分子植物育种
Molecular Plant Breeding
图 2 45S rDNA在父母本和 4个杂交后代有丝分裂中期染色体上的原位杂交结果
注:图中数字标出了 45S rDNA所在的位点和染色体; A:父本; B:母本; C: GHCD-04; D: GHCD-11; E: GHCD-15; F: GHCD-22
Figure 2 In situ hybridization with 45S rDNA as probe on metaphase chromosomes of the parents and four F1 hybrids
Note: The numbers indicated which chromosomes have 45 S rDNA sites; A: Male; B: Female; C: GHCD-04; D: GHCD-11; E:
GHCD-15; F: GHCD-22
可知，杂交 F1代中，GHCD-04有 5条典型的父本染
色体，它们分别为 1、2、4、5、6 号染色体(染色体按
照断臂由长到短排列) (Lim et al., 2001)，有 5 条典
型的母本染色体，它们分别为 1、2、4、8、11 号染色
体；GHCD-11有 6条典型的父本染色体，它们的分
别为 1、2、4、5、6、11号染色体，有 4条典型的母本染
色体，它们分别为 1、2、8、11号染色体；GHCD-15有
6条典型的父本染色体，它们的分别为 1、2、4、5、6、
11号染色体，有 6条典型的母本染色体，它们分别为
1、2、4、5、8、11 号染色体；GHCD-22有 5 条典型的
父本染色体，它们的分别 1、2、4、8、11号染色体，有
6条典型的母本染色体，它们分别为 1、2、4、5、8、11
号染色体。
2讨论
百合的细胞学研究不是孤立的体系，应该与传
统的杂交育种以及现代育种方法紧密结合(王斐和
胡风荣, 2012)。以往对百合的细胞学研究多局限于核
型分析，虽然百合染色体间在长度上有一定差异，但
对于区分一些十分相似以及在追踪染色体的来源方
面，具有很大的局限性(王斐和胡风荣, 2012)。以 rD-
NA或特异性串联重复序列为探针的荧光原位杂交
技术很好的弥补了核型分析在区分相似度高的染色
体以及追踪染色体来源方面的不足，将核型分析方
法与荧光原位杂交技术的有效结合，可以对杂交后
代进行更加准确的早期杂种鉴定(Zhou et al., 2011)，
而早期的杂种鉴定在育种工作中具有非常重要的意
义。本文中利用核型分析，对父母本以及 30个杂交
后代进行了倍性统计，单纯从核型分析的结果，我们
很难确定子代中具有 24条染色体的后代是否为真
实的杂种后代，但结合 45S rDNA荧光原位杂交的结
果，我们可以清楚的通过是否具有典型的父本染色
体，来判断这些具有 24条染色体的基因型个体是否
为真实的杂种后代，同时也可以对这些具有荧光位
点的特征染色体的来源进行一定的追踪。
近年来，由于对百合研究的进一步深入，不少育
种工作者开始以三倍体为母本进行杂交育种，并获
得了一定量的杂交 F1代个体，从而证明了异源三倍
体作为母本培育百合新品种的可行性(Zhou, 2007;
Xie, 2012)。然而，对于采用异源三倍体为父本进行杂
交育种的可行性以及杂交后代的遗传学研究的报道
却很少关注。周朝鸿(1997)利用淡黄花百合、通江百
合、百合等三种百合的珠芽为外植体，经愈伤组织获
得再生植株，通过统计再生植株的染色体数目，获得
了非整倍体变异范围，即 2n:22(2x-2)、23(2x-1)、25
(2x+1)、26(2x+2)。然而，本研究中发现 35条染色体
140
的杂交后代，得出 2n=3x-1=35，对其非整倍体的变
化范围进行了一定的补充。
普遍认同植物染色体数目的变化很大程度上会
引起其形态、生理以及生态特征的变化(Zhou, 2007)，
通过研究杂交后代的染色体数目的变化，可以推测
以异源三倍体为父本的杂交后代的染色体可以产
生一定的数目或倍性变化，利用其产生的多种非整
倍体或整倍体可育配子，进行倍性育种或基因渗入
育种，将有潜力的目标性状引入到栽培品种中
(Humphreys and Thomas, 1993; Humphreys et al., 1995;
Morgan et al., 2001)，提高百合栽培品种的观赏价值，增
强其抗病、抗逆性等，所以，可以推测异源三倍体有望
成为未来育种工作中一类非常有潜力的种质资源。
3材料和方法
3.1实验材料
30 个 GHC-01 (♀)בCeb Dazzle’(♂)杂交后
代以及 GHC-01和‘Ceb Dazzle’均来自于南京林业
大学林木遗传与生物技术省部共建教育部重点实
验室的百合试管苗。其中二倍体亚洲百合 GHC-01
源自‘Golden Horn’בHigh Class’的杂交后代，且
表现为典型的雄性不育株，‘Ceb Dazzle’为异源三
倍体百合。
图 3 GHC-01בCeb Dazzle’亲本及杂交后代的 45S rDNA荧光原位杂交核型图
Figure 3 The ideograms of fluorescence in situ hybridization of GHC-01בCeb Dazzle’progenies and their parents
异源三倍体为父本的百合杂交后代倍性调查及 FISH分析
The Ploidy Level Investigation and FISH Analysis of the Progenies from Allotriploid Lilium as Male 141
分子植物育种
Molecular Plant Breeding
表 1单张制片杂交液组成
Table 1 Composition of hybridization mixture for each slide
成分
Component
10% DFA
20×SSC
50% DS
DNA Probe
ssDNA
加 ddH2O至终体积
Add ddH2O to final volume
含量
Content
12 μL
3 μL
6 μL
0.16 μg
10 μg
30 μL
3.2实验方法
3.2.1染色体制片及倍性观察
染色体制片方法以及染色体数目的确定参考房
磊等(2013)描述的方法。
3.2.2染色体的预处理
将载有低倍镜(10x)下找到的分散良好分裂相
的载玻片置于 37℃烘箱中烘干，然后用 RNase A
(100 μg/mL)在 37℃酶解 60 min，接着用 2×SSC润洗
3次，每次 5 min，用 HCl (10 mmol/L)润洗 2 min，用
胃蛋白酶(5 μg/L) 37℃处理 10 min，然后用无菌水冲
洗 2 min，再用 2×SSC润洗 3次，每次 5 min，随后用
新鲜配制的 4%多聚甲醛固定 10 min，最后用 70%、
90%和 100%乙醇逐级脱水各 3 min。
3.2.3杂交液的制备及荧光原位杂交
制备杂交液混合体积为 30 μL/染色体制片，其
成分见表 1。将配置好的杂交液于 70℃变性 10 min，
冰浴 10 min以上，将冰浴后的杂交液加在预处理好
的目标载玻片上，盖上盖玻片，并在 80℃变性 5 min，
最终置于湿润的容器内，避光杂交 14~18 h。
3.2.4信号的洗脱及杂交信号的检测
用 2×SSC对带有杂交信号的载玻片润洗 3次，
每次 5 min，接着用 0.1×SSC在 42℃洗脱 2次，每次
15 min，用 2×SSC 润洗 3 次，每次 5 min，用 1×PBS
润洗 5 min，然后用 PI (100 ng/mL)对带有杂交信号
的载玻片进行染色 5 min，用 1×PBS冲洗干净，然后
用 Vectashield封片胶封片，最后镜检并拍照。
作者贡献
房磊和杨斌是本研究的实验设计和实验研究的
执行人；房磊完成数据分析，论文初稿的写作和修
改；张维娜、辛昊阳、高婷婷和郭佳参与实验，实验结
果的分析；席梦利是项目的构思者，席梦利和施季森
指导实验，数据分析，论文写作与修改。全体作者都
阅读并同意最终的文本。
致谢
本研究由国家林业局 948 项目(2013-4-34)和
江苏省农业科技自主创新资金项目(CX(12)2018)
共同资助。
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