全 文 ：文章编号:1001-4829(2010)06-1914-03
　　收稿日期:2010-04-29
　　基金项目:云南省自然科学基金资助项目(2007C121M);国家科
技支撑计划项目(2007BAD45B01、2007BAD45B04)
作者简介:杨秀梅(1977-), 女 ,助理研究员 , 主要从事花卉质
量控制与标准化研究 , ＊为通讯作者。
百合枯萎病病原鉴定与 ITS序列分析
杨秀梅 ,王继华 ,王丽花 ,吴学尉 ,彭绿春 ,瞿素萍＊
(云南省农业科学院花卉研究所 农业部花卉质检中心 ,云南 昆明　650205)
摘　要:对从百合枯萎病病株上分离得到的病原菌进行形态特征 、致病性以及核糖体 DNA-ITS序列分析。结果表明 ,该菌在 PDA
培养基上气生菌丝白色绒毛状 ,小型分生孢子卵圆形或椭圆形 ,大型分生孢子镰刀形。克隆分析菌株的核糖体 DNA-ITS区域序
列 ,分离菌与 GenBank中尖孢镰刀菌的 ITS序列同源性最高达 99.8%,仅有 1个碱基的差异 ,进一步证实嵩明百合种植基地百合
枯萎病的病原菌为尖孢镰刀菌(Fusariumoxysporum)。
关键词:百合;枯萎病;rDNA-ITS序列;鉴定
中图分类号:S435.672　　　文献标识码:A
IdentificationandITSSequenceAnalysisofPathogenofLilyWilt
YANGXiu-mei, WANGJi-hua, WANGLi-hua, WUXue-wei, PENGLv-chun, QUSu-ping＊
(SupervisionandTestingCentreforFlowerofAgricultureMinistry, FlowerResearchInstitute, YunnanAcademyofAgriculturalSciences,
YunnanKunming650205, China)
Abstract:Pathogenisolateswhichcausedlilywiltwereidentifiedbymorphologicalcharacteristics, pathogenicityandthesequenceofriboso-
malDNA-ITS.Theresultsshowedthatoftheisolatedfungusonpotatodextroseagar(PDA)mediadevelopedwhitemycelium.Theshapeof
microconidiaandmacroconidiawereovalandsickles-shaped, respectively.TheribosomalDNA-ITSsequenceofisolateFol-2showedase-
quenceidentityof99.8%withFusariumoxysporumpublishedinGenBank.TheresultsindicatedthattheseisolatescausinglilywiltinSong-
mingwereFusariumoxysporum.
Keywords:Lily;Wilt;rDNAinternaltranscribedspacer(ITS)sequence;Identification
　　百合枯萎病也称百合根腐病 、茎腐病 ,是影响百
合切花生产的重要病害之一。近年来 ,随着百合栽
培面积的不断扩大 ,百合枯萎病日趋严重 。病原菌
主要从百合肉质根或鳞茎盘基部的伤口侵入 ,造成
肉质根和盘基变褐腐烂 ,并逐渐向上发展 ,鳞片出现
褐色凹陷病斑 ,后期鳞片从盘基散开而剥落 。由病
鳞茎长出的植株明显矮化 ,叶片由上而下黄化 ,后枯
萎而死 [ 1] 。
引起百合枯萎病的病原菌主要有尖孢镰刀菌
(Fusariumoxysporum)、串珠镰刀菌(F.rnoniliforme)
和茄腐皮镰刀菌(F.solani)。李诚等报道兰州百合
枯萎病病原为尖孢镰刀菌(F.oxysporum)、串珠镰刀
菌(F.rnoniliforme)和茄腐皮镰刀菌(F.solani),主
要致病菌是尖孢镰刀菌(F.oxysporum)[ 2] 。潘其云
等报道了龙牙百合 、江西百合和甘肃百合枯萎病的
主要致病菌都为尖孢镰刀菌 (F.oxysporum)[ 3 ～ 5] 。
国外对百合枯萎病的病原也进行了相关研究 。 Lof-
ler等的研究表明 ,尖孢镰刀菌 (F.oxysporum)为荷
兰百合枯萎病的主要病原菌 [ 6] 。Ana等首次报道引
起西班牙百合枯萎病的病原为尖孢镰刀菌(F.oxys-
porum)和再育镰刀菌(F.proliferatum)[ 7] 。目前 ,百
合枯萎病是云南切花百合种植地的主要病害之一 ,
但是引起该病的病原一直未见报道。本研究以传统
的形态学特征为基础 ,对百合枯萎病菌的 rDNA-ITS
序列进行分析和比对 ,从分子生物学水平上明确嵩
明百合种植基地百合枯萎病的病原菌类型 ,为该病
的防治和抗性品种选育研究提供理论依据。
1914
西　南　农　业　学　报
SouthwestChinaJournalofAgriculturalSciences　　　　　　　　　　　　　　
2010年 23卷 6期
Vol.23　　No.6
DOI :10.16213/j.cnki.scjas.2010.06.074
1　材料与方法
1.1　病原菌的分离和纯化
从云南省昆明市嵩明县的百合种植基地采集症
状典型的百合枯萎病病株 ,采用常规的组织分离法
和琼胶平板稀释法进行分离纯化 ,获得的菌株于斜
面培养基上低温(4 ℃)保存。
1.2　病原菌形态特征观察
供试菌株接种在 PDA平板培养基上 , 25 ℃下
培养 3d,用孔径 5 mm的打孔器在菌落边缘打取菌
丝块 ,接种在 PDA平板中央 ,每处理 3次重复 ,置 25
℃恒温箱中培养 5d,观察菌落形态 ,测量菌落直径 ,
计算生长速率。
1.3　致病性测定
以病原菌的孢子悬浮液作为接种体 ,采用灌根
接种法接种盆栽百合幼苗植株 。接种后用塑料袋罩
好 ,置于 25 ℃光照培养中保湿 48h。保湿结束后取
掉塑料袋 ,将植株移至温室正常生长 , 7 d后观察植
株的发病情况。以灭菌水为对照 ,每处理接种 5株 ,
3次重复 。
1.4　病原菌 rDNA-ITS的扩增与序列分析
1.4.1　病原菌总 DNA的提取　取 0.1 g菌丝体用
液氮研磨成粉状 ,加入 500 μlCTAB提取缓冲液(2
% CTAB, 20 mmol/LEDTA, 1.4 mol/LNaCl, 100
mmol/LTris-C1),转入 1.5 mL离心管中 ,迅速混匀
后 65 ℃水浴 1 h。水浴结束后取出冷却至室温 ,加
入 5mol/L的乙酸钾 240μl,冰浴 1h。 10 000r/min
离心 10min,将上清倒入另一离心管 ,加入等体积氯
仿 -异戊醇 ,混匀后 6000 r/min离心 10 min。重复
上一步 ,吸取上清 ,加入等体积异丙醇 ,混匀后 -20
℃静置 ,沉淀 30 ～ 60min。 10 000r/min离心 10min
弃上清 ,离心出的沉淀加入 75%乙醇 300 μl洗涤 ,
7000r/min离心 5 min,重复 2次 ,再用 100 %乙醇
洗 1次 , 7000 r/min离心 5 min。控干沉淀 ,加入 40
～ 80 μlddH2O溶解 DNA,于 -20 ℃保存备用。
1.4.2　rDNA-ITS的扩增与序列测定　采用真菌核
糖体基因内转录间隔区(ITS)通用引物 ITS1(5′-
TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3′)和 ITS4 (5′-TC-
CTCCGCTTATTGATATGC-3′)扩增病原菌的 ITS、5.
8SrDNA。 25μl的 PCR反应体系中 ,包含 10×PCR
bufer2.5μl、2.5 mmol/LdNTP2.5μl、20 pmol/μl
的 ITS1和 ITS4引物各 0.5 μl、5 U/Taq酶 0.5 μl、
模板 DNA20 ng,最后加 ddH2O补足至 25μl。扩增
反应程序为:94 ℃预变性 4 min;94 ℃变性 30 s、56
℃退火 50 s、72 ℃延伸 1 min, 35个循环;最后 72℃
延伸 10min。PCR产物经 1.5%琼脂糖凝胶电泳检
测以后 ,委托大连宝生物工程有限公司进行纯化和
序列测定 。
1.4.3　病原菌 rDNA-ITS　序列同源性比较 将菌株
Fol-1的 rDNAITS序列提交至 NCBI网站 ,用 BLAST
软件与 GenBank中已知种属的 rDNA进行序列比对
和同源性分析 。
2　结果与分析
2.1　病原菌的分离纯化和致病性测定
从云南省昆明市嵩明县的百合种植基地采集百
合枯萎病病株 ,于 PDA平板培养基上分离纯化后获
得 5个百合镰刀菌纯培养菌株 ,编号分别为 Fol-1 ～
Fol-5。将纯化后的菌株重新接种至健康的百合幼
苗 , 7d后植株下部叶片即出现变黄 、萎蔫症状 , 15 d
后叶片由下至上逐渐黄化 、枯萎 ,最后整株枯萎死
亡。当空气湿度较高时 ,部分植株茎基部腐烂 、溢
缩 ,病部产生白色菌丝(图 1)。采集病株进行病原
菌分离 ,再次获得与原分离菌一致的病原菌 ,根据柯
赫氏法则 ,证明接种菌即为百合枯萎病病原菌。
2.2　病原菌的形态特征
分离得到的菌株形态特征基本一致 ,在 PDA培
养基上气生菌丝白色绒毛状 ,小型分生孢子数量多 ,
卵圆形或椭圆形 , 0 ～ 1隔 ,大小为 4.3 ～ 10.7 μm ×
1.4 ～ 3.5 μm。大型分生孢子月牙形 ,稍弯曲 , 3 ～ 5
a:对照植株;b:叶部症状;c:茎基部症状 a:Control;b:Thesymptomsonleaves;c:Thesymptomonstembase
图 1　百合枯萎病症状
Fig.1　Symptomsoflilywilt
19156期 　　　　　　杨秀梅等:百合枯萎病病原鉴定与ITS序列分析
:小型分生孢子和大型分生孢子;b:厚垣孢子;c:产孢细胞;a:Microconidiaandmacroconidia;b:Chlamydospore;c:Conidiogenousspore
图 2　尖孢镰刀菌的形态特征
Fig.2　MorphologyofFusariumoxysporum
图 3　菌株 Fol-2ITS-PCR扩增产物
Fig.3　ElectrophoresisofPCRproductofFol-2
隔 ,大小为 14.2 ～ 43.6μm ×2.0 ～ 4.5μm;厚垣孢
子球形 ,直径 8 ～ 15 μm,间生或顶生(图 2)。在 25
℃、黑暗条件下 ,菌株在 PDA培养基上的平均生长
速度为 10.2 mm/d。根据形态学鉴定结果 ,初步判
断分离得到的病原菌为尖孢镰刀菌。
2.3　病原菌 rDNA-ITS序列分析
为进一步确定分离得到的病原菌是否为尖孢镰
刀菌 ,从分离到的菌株中随机抽取菌株 Fol-2 ,克隆
并分析了该菌的 rDNA-ITS序列。菌株 Fol-2的 PCR
扩增产物经 1.5%琼脂糖凝胶电泳检测 ,得到 1个
大小约 520bp的片段(图 3)。经测序 ,该序列全长
为 510bp(GenBank登录号:GU371875)。将 Fol-2
菌株的核糖体 DNA-ITS基因在 GenBank中进行同
源性比较 ,发现与其同源性最高的 100个 ITS序列
菌株全部为镰刀菌属菌 , Fol-2与它们的同源性为
98 % ～ 99 %。菌株 Fol-2核糖体 DNA-ITS序列与
尖孢镰刀菌(GQ121299、EF611088、GU126688)的同
源性为 99.8 %、99.6%、99.4 %,分别有 1、2、3个碱
基的差异。结合培养性状等形态学特征和 ITS区域的
DNA序列分析 ,证明所分离到的菌株为尖孢镰刀菌。
3　讨　论
　　镰刀菌的分类鉴定是一项十分复杂的工作 ,传
统的鉴定方法主要以形态特征和生理生化指标作为
病原真菌分类鉴定的主要依据 ,但此方法受多种外
界因素的影响 ,具有很大的不确定性 ,特别是培养物
不典型或不产孢时 ,使得鉴定工作更加困难 [ 8] 。因
此 ,根据 DNA水平的差异进行真菌的鉴定或系统发
育的研究越来越得到重视。人们发现 ITS区具有丰
富变异特点 ,常常将这一可变区作为真菌菌种和分
离物鉴定的可靠依据之一 ,现已广泛应用于镰刀菌
(Fusarium)、疫霉菌(Phytophthora)等病原真菌的分
类鉴定[ 9] 。
本研究采用真菌核糖体基因转录间隔区(ITS)
通用引物 , PCR扩增百合枯萎病菌核糖体基因的
ITS区域 ,获得了百合枯萎病菌的 ITS全长 。通过与
GenBank核酸序列数据库中其它镰刀菌的 ITS序列
比较 ,结合形态学鉴定方法 ,首次确定嵩明地区百合
枯萎病的病原为尖孢镰刀菌 ,为该病的防治和抗病
品种选育研究提供了理论依据。
参考文献:
[ 1]丁　丁 , 吕长平 , 刘　飞 , 等.百合枯萎病研究进展 [ J] .江苏
农业科学 , 2009(3):128-130.
[ 2]李　诚 , 李俊杰 , 薛春胜 , 等.百合枯萎病病原菌鉴定 [ J].植
物病理学报 , 1996, 26(2):192-193.
[ 3]潘其云 , 朱明德 , 邓建玲.百合镰刀菌枯萎病的发生与防治 [ J].
上海农业科技 , 2004(3):103-104.
[ 4]邹一平 , 周　蓉 , 杨士杰 , 等.镰刀菌与根螨在食用百合鳞茎上
的协同侵染及防治 [ J].江苏农业科学 , 2006(6):135-138.
[ 5]梁巧兰 , 徐秉良 , 刘艳梅.观赏百合根腐病病原鉴定及药剂筛
选 [ J] .甘肃农业大学学报 , 2004, 39(1):25-28.
[ 6] HJMLofler, ThPStraathof, JRMouris, etal.Durabilityofresist-
anceinlilytobasalrot:evaluationofvirulenceandaggressivenessa-
mongisolatesofFusariumoxysporumf.sp.Lili[ J] .EuropeanJour-
nalofPlantPathology, 1995, 101:261-271.
[ 7] AnaMariaPrados-Ligero.FirstreportofFusariumoxysporumf.sp.
liliandF.proliferatumafectingLiliumcropsinSpain[ J].Tropi-
calPlantPathology, 2008, 33(3):9.
[ 8]郑雪芳 , 蓝江林 , 曹　宜 , 等.瓜类作物枯萎病病原菌的分类鉴
定及其 ITS序列差异性分析 [ J] .中国农业科学 , 2008, 41(12):
4077-4084.
[ 9]马荣群 , 黄　粤 , 宋正旭 , 等.辣椒炭疽病 3病原核糖体基因
ITS区的序列测定及分析 [ J] .西南农业学报 , 2007, 20(6):1234
-1236.
(责任编辑　王家银)
1916 西　南　农　业　学　报　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　23卷