全 文 ：百合未授粉成熟雌蕊转录组测序研究
蔡晓昂 1，崔金腾 1，贾月慧 2，张克中 1
（1北京农学院园林学院，北京 102206；2北京农学院植科学院，北京 102206）
摘 要：本研究旨在大量发掘百合雌蕊特异表达基因，为研究百合杂交障碍的分子机制提供依据。利用
Illumina高通量测序平台，进行百合未授粉成熟雌蕊转录组测序和数据组装，并对获得的Unigene进行
功能注释、分类和代谢通路分析。“干柱头”雌蕊LoP1和“湿柱头”雌蕊LoP2分别获得40792条和39708
条Unigene。2个样品的Unigene通过序列拼接，去冗余处理，以及同源转录本聚类，得到 44175条
All-Unigene。基于NR、NT、Swiss-Prot、GO、KEGG和COG等 6个数据库进行相似性比对（E值≤10-5），
依次分别有 30343、21647、21281、19274、12964和 22227个基因被注释。KEGG分析中，19274条All-
Unigene被注释到128个代谢通路上。基因分析显示，百合未授粉成熟雌蕊已为授粉受精做好了物质、
能量、信号转导以及抗病原等准备工作。
关键词：百合；未授粉成熟雌蕊；转录组；高通量测序
中图分类号： 文献标志码：A 论文编号：2014-0361
Studies on the Transcriptome Sequencing of Lilium’s Mature Unpollinated Pistils
Cai Xiaoang1, Cui Jinteng1, Jia Yuehui2, Zhang Kezhong1
(1College of Landscape Architecture, Beijing University of Agriculture, Beijing 102206;
2College of Plant Science, Beijing University of Agriculture, Beijing 102206)
Abstract: The purpose of this study was to explore massive lilium’s pistil specially expressed genes and offer
supports for explaining the molecular mechanism of lilium’s cross barriers. Based on the Illumina high-
through sequencing platform, the transcriptome sequencing of Lilium’s mature unpollinated pistils was
conducted, the dates were assembled and the metabolism pathways were analyzed. 40792 and 39708 Unigene
were disclosed in the“dry stigma”pistils LoP1 and the“wet stigma”pistils LoP2 respectively. A total of
44175 All-Unigene were generated by means of assembling sequence, removing the redundancy and clustering
homologous transcripts between the two samples. 30343, 21647, 21281, 19274, 12964 and 22227 Unigene
were respectively matched to the NR, NT, Swiss-Prot, GO, KEGG and COG databases via similarity alignment
(E- value≤10- 5). By KEGG analysis, 19274 All- Unigene were annotated in the 128 metabolism pathways.
Based on the genes analysis, it was indicated that something such as substance, energy, signal transduction and
pathogen resistance had been ready for pollination and fertilization process in the mature unpollinated pistils.
Key words: Lilium; mature unpollinated pistils; transcriptome; high-through sequencing
基金项目：北京市自然科学基金项目“百合卷瓣组特异种质参与的杂交育种中花粉管定向生长与胚抢救研究”(6122004)；北京市教委科技创新平台
项目“农业综合服务基地建设—特色花卉”(PXM2013-014207-000051)；北京市教委科技提升计划项目“延庆四季花海景观植物新品种创制与产业化”
(PXM2014-014207-000081)；北京市教委科技创新平台项目“农业综合试验站与教授工作站建设”(PXM2014-014207-000018)。
第一作者简介：蔡晓昂，女，1988年出生，河北唐山人，硕士，主要从事花卉栽培与育种研究。通信地址：102206北京市昌平区回龙观镇北农路7号北
京农学院园林学院，Tel：010-80796937，E-mail：sunshinetocai@163.com。
通讯作者：张克中，男，1968年出生，湖北应城人，教授，博士，主要从事花卉育种与产业化研究。通信地址：102206北京市昌平区回龙观镇北农路7
号北京农学院园林学院，Tel：010-80796937，E-mail：zkzzxd@vip.sina.com。
收稿日期：2014-02-18，修回日期：2014-04-30。
中国农学通报 2014,30(22):148-154
Chinese Agricultural Science Bulletin
0 引言
百合是深受人们喜爱的鲜切花之一，被誉为“球根
花卉之王”。但目前的品种主要以组（系）内杂种为主，
例如东方百合系 (Oriental hybrids)是具叶柄组组
(Section archelirion)组内野生种反复杂交或东方百合
杂种系内品种之间杂交形成的，亚洲百合 (Asiatic
Hybrids)是卷瓣组(Section Sinomartagon)组内野生种
反复杂交或亚洲百合杂种系内品种之间杂交形成的[1]。
国外百合育种学家采用离体授粉、离体花柱嫁接、离体
胚珠培养、离体胚抢救等离体整合技术[2]，获得了一些
组系间杂种，例如OA杂种（为东方百合与亚洲百合的
系间杂种）、OT杂种（为东方百合与喇叭百合系间杂
种）[3]；由于杂种优势的体现，这些组系间杂种观赏性
状更佳、抗逆性更强，因而更具商业价值。但是由于组
系间亲缘关系较远，杂交技术较复杂，杂种胚成苗率较
低，从总体上来说目前全世界育成的组系间杂种还是
较少。
近年来，生殖生物学认为，在杂交育种中，花粉管
从柱头到花柱、从花柱到子房胎座、从胎座到珠柄、从
珠柄到珠孔、从珠孔进入胚囊，最后发生双受精，是一
个定向生长过程，此过程与雌蕊组织中特异表达基因
的精确调控有关[4]。在一些模式植物中，人们采用一
些新技术高通量挖掘在雌蕊中特异中表达的基因，以
期逐渐了解植物的生殖机理。例如Swanson采用基因
芯片技术及抑制消减技术在拟南芥中获得了一些在柱
头中特异表达的、可能促进授粉的侯选基因[5]。Li[6]采
用基因芯片技术分离出548条在水稻乳突细胞中特异
表达或优势表达的基因。Quiapim采用 cDNA文库技
术，发掘了一些在烟草湿柱头中特异表达的基因，并比
较了与干柱头特异表达基因的差异[7]。Abiko进行了
单个卵细胞和精细胞的蛋白组分析，获得 102个和 77
个分别在卵细胞和精细胞中优势表达的蛋白 [8]。目
前，还未见采用现代技术高通量挖掘百合雌蕊中特异
表达基因的报道。本试验拟以未出现柱头分泌液和出
现大量柱头分泌液的东方百合雌蕊为材料，进行转录
组测序，拟获得东方百合雌蕊特异表达基因，以期为研
究百合组系间杂交障碍形成机制奠定基础。
1 材料与方法
1.1 试验时间、地点
本试验 2013年于北京农学院研究生实验楼B座
和深圳华大公司进行。
1.2 试验材料
试验材料为北京农学院东大地3号棚栽培东方百
合(Lilium oriental)品种 Justina，取材阶段为花瓣已经
显色但尚未分泌柱头分泌液的雌蕊(LoP1)数个和已分
泌大量柱头分泌液的雌蕊(LoP2)数个。在同一时间取
上述材料，用锡箔纸包好，迅速放于液氮中速冻并转移
至-80℃冰箱中储存备用。
1.3 RNA提取
取上述LoP1样品2个放入研钵中，在研钵中加入
液氮研磨成粉末，采用Trizol法（PlantRNAzol试剂）提
取总RNA，送由深圳华大基因公司完成RNA质量检测
和测序工作。LoP2样品RNA提取方法同LoP1样品。
1.4 cDNA文库的构建
分别对LoP1、LoP2 2个样品进行 cDNA文库的构
建。方法是：利用 Invitrogen的Oligo (dT) 25磁珠对
mRNA进行富集，加入破碎缓冲液将mRNA打断成短
片段，并以此产物为模板合成 cDNA的第1条链和第2
条链，然后将其按照QIAquick PCR Purification Kit说
明书进行纯化，并将其溶于EB缓冲液中，经过更进一
步的末端修复、加polyA和连接测序接头等操作，得到
的连接产物用QIAquick Gel Extraction Kit试剂盒进行
纯化回收，进行片段大小选择后进行PCR扩增，并再
次用QIAquick Gel Extraction Kit进行切胶纯化回收。
1.5 文库检测与高通量测序
构建好的文库用Agilent 2100 Bio analyzer和ABI
Step One Plus Real-Time PCR System质检合格后，使
用 IlluminaHiSeq™ 2000进行测序。
1.6 数据拼接和功能注释
对下机的 reads进行过滤，将剩余的高质量数据用
Velvet和Oases软件组装分别得到LoP1、LoP2 2个样品
的Unigene，因为同一物种做了2个样品测序，不同样品
组装得到的Unigene也需要通过序列聚类软件做进一
步序列拼接，去冗余处理，以及同源转录本聚类，得到
尽可能长的非冗余Unigene，在本研究中将其定义为
All-Unigene。接着先用BLAST系列软件在NR（NCBI
非冗余蛋白数据库）、Swiss-Prot和COG数据库中分别
比对 All-Unigene序列，进行功能注释和分类；再在
InterProScan4.8与数据库 InterPro进行比对的基础上，
对 All- Unigene进行 GO功能注释和分类，然后用
WEGO软件对GO注释结果分类作图。最后，将All-
Unigene与KEGG数据库进行比对，分析其参与的代谢
通路。All-Unigene与公共数据库比对结果如表1所示。
2 结果与分析
2.1 测序结果和组装
测序后LoP1和LoP2分别得到4.64 G和4.60 G的
数据，获得60639554和64627208条 raw reads。经过去
除含 adaptor的 reads、去除N的比例大于 5%的 reads、
蔡晓昂等：百合未授粉成熟雌蕊转录组测序研究 ··149
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去除低质量 reads等过滤措施，分别得到 51591766条
和51139648条clean reads（表2）。
对测序得到的高质量数据进行组装，LoP1和
LoP2 2个样品分别得到 85651条和 101323条序列重
叠群(contig)，N50分别为793 bp和744 bp，平均长度分
别为 380 bp和 345 bp，其中长度大于 500 bp的分别有
16496条和17099条（表3）。其Contig长度均以小片段
为主，这些Contig通过进一步组装，LoP1和LoP2 2个
样品分别得到 40792条和 39708条Unigene，N50分别
为 1089 bp 和 1166 bp，平均长度分别为 725 bp 和
771 bp，长度大于 2000 bp的分别有 1903条和 2315条
（图1）。2个样品组装得到的Unigene通过序列聚类软
件做进一步序列拼接，去冗余处理，以及同源转录本聚
类，得到 44175条All-Unigene，N50长度是 1262 bp，平
均长度是 805 bp，其中长度大于 2000 bp的有 3134条
（表 3）。这些结果说明测序和组装的质量良好，可以
对其进行基因功能注释和分类。
比对的数据库
NR
NT
Swiss-Prot
KEGG
COG
GO
All
44157All-Unigene
比对上的条数
30343
21647
21282
19274
12964
22227
31097
比对上的百分比/%
68.7
49.0
48.2
43.6
29.4
50.3
70.4
表1 All-Unigene与公共数据库比对结果
表2 原始测序数据产量
样品
LoP1
LoP2
初读数据
60639554
64627208
过滤后数据
51591766
51139648
总核苷酸量
4643258940
4602568320
GC含量/%
51.71
50.92
Q20百分比/%
97.54
97.52
表3 Contig和Unigene的组装质量
项目
数量
核苷酸数
N50长度
平均长度
Contig数(＞500 bp)
Unigene数(＞2000 bp)
Contig
LoP1
85651
32539802
793
380
16496
—
LoP2
101323
34927302
744
345
17099
—
Unigene
LoP1
40792
29558203
1089
725
—
1903
LoP2
39708
30623938
1166
771
—
2315
All-Unigene
44175
35556373
1262
805
—
3134
2.2 功能注释
将经过组装得到的 44175条All-Unigene比对到
NR数据库（E值≤10-5），有3239条(61.2%)与葡萄（Vitis
vinifera，7302条，24.1%）、粳稻（Oryza sativa Japonica
Group，2665条，8.8%）、碧桃（Prunus persica，1911条，
6.3%）、二穗短柄草（Brachypodium distachyon，1834
条，6.0%）、蓖麻（Ricinus communis，1660条，5.5%）、高
粱（Sorghum bicolor，1632条，5.4%）、玉米（Zea mays，
1554条，5.1%）的序列同源（图 3），有 51.5%序列比对
后的相似度在60%以上（图4）。有21282条(48.2%)比
对到了Swiss-Prot数据库（表1）。
2.3 功能分类
2.3.1 COG功能分类 将 44175条All-Unigene比对到
COG数据库，12964条(29.4%)能够比对到同源序列。
其功能涉及COG数据库中的 25大功能分类（图 5）。
其中排名前10位的分别为：一般性功能预测（5148条，
39.7%），转录（4490条，34.7%），复制、重组和修复
（3182条，24.5%），翻译后修饰、蛋白翻转、分子伴侣
（3089条，23.8%），未知功能（2879条，22.2%），信号转
导机制（2847条，22.0%），细胞壁/膜/包膜生物合成
（2423条，18.7%），翻译、核糖体结构和生物合成（2218
条，17.1%），碳水化合物转运和代谢（2049条，15.8%），
细胞内运输、分泌和膜泡运输（1484条，11.4%）。
2.3.2 GO功能分类 将 44175条 All-Unigene比对到
GO数据库，22227条(50.3%）All-Unigene能比对到GO
数据库，共被比对到 3个功能大类、55个功能小类中。
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1：100~200 nt；2：200~300 nt；3：300~400 nt；4：400~500 nt；5：500~600 nt；6：600~700 nt；7：700~800 nt；8：800~900 nt；9：900~1000 nt；
10：1000~1100 nt；11：1100~1200 nt；12：1200~1300 nt；13：1300~1400 nt；14：1400~1500 nt；15：1500~1600 nt；16：1600~1700 nt；
17：1700~1800 nt；18：1800~1900 nt；19：1900~2000 nt；20：2000~2100 nt；21：2100~2200 nt；22：2200~2300 nt；23：2300~2400 nt；
24：2400~2500 nt；25：2500~2600 nt；26：2600~2700 nt；27：2700~2800 nt；28：2800~2900 nt；29：2900~3000 nt；30：＞3000 nt
图1 Contig长度分布图
横坐标同图1
图2 Unigene长度分布图
图3 物种分布图 图4 相似度分布图
蔡晓昂等：百合未授粉成熟雌蕊转录组测序研究 ··151
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根据生物学过程可分为22类，其中排在前7位的有细
胞过程（13167 条，59.2%）、代谢过程（12460 条，
56.1%）、单有机体过程（9073条，40.8%）、应激响应
（6278条，28.2%）、生物调节（4849条，21.8%）、生物过
程调控（4435 条，20.0%）及发育过程（3820 条，
17.2%）。根据细胞组分可分为17类，其中排在前6位
的有细胞（16874条，75.9%）、细胞部件（16873条，
75.9%）、细胞器（14142 条，63.6%）、膜（6906 条，
31.1%）、细胞器部件（4165条，18.7%）及大分子复合体
（2505，11.3%）。按分子功能分类，可分为 16类，其中
排在前 5位的有催化活性（10655条，47.9%）、结合
（9923条，44.6%）、转运活性（1455条，6.5%）、结构分子
活性（555条，2.5%）及核酸结合转录因子活性（349条，
1.6%）（图6）。
A：细胞外结构；B：核结构；C：细胞骨架；D：细胞迁移；E：氨基酸转运和代谢；F：脂类转运和代谢；G：功能未知；H：辅酶转运和代谢；
I：无机离子转运和代谢；J：碳水化合物转运和代谢；K：转录；L：细胞内运输、分泌和膜泡运输；M：细胞壁/膜/包膜生物合成；
N：翻译、核糖体结构和生物合成；O：翻译后修饰、蛋白翻转、分子伴侣；P：核苷酸转运和代谢；Q：信号转导机制；R：一般性功能预测；
S：次生代谢物生物合成、转运和代谢；T：细胞周期控制、细胞分裂和染色体分区；U：复制、重组和修复；V：防御系统；
W：能量产生和转化；Y：染色质结构和动力学；Z：RNA加工和修饰
图5 All-Unigene COG功能分类图
A：生物学过程，B：细胞组分，C：分子功能；
A1：生物附着，A2：生物调节，A3：细胞组件组织或生物起源，A4：细胞过程，A5：发育过程，A6：胞内定位的建立，A7：生长，A8：免疫过程，
A9：胞内定位，A10：运动，A11：代谢过程，A12：多有机体的过程，A13：多细胞有机体的过程，A14：负调控生物过程，A15：正调控生物过程，
A16：生物过程的调控，A17：生殖，A18：生殖过程，A19：应激响应，A20：韵律过程，A21：信号发送，A22：单有机体过程；
B1：细胞，B2：细胞内定位，B3：细胞部分，B4：细胞外基质，B5：细胞外基质部分，B6：胞外区，B7：胞外区部分，B8：大分子复合体，
B9：膜，B10：膜部分，B11：膜封闭腔，B12：核，B13：细胞器，B14：细胞器部分，B15：共质体，B16：病毒体，B17：病毒体部分；
C1：抗氧化活性，C2：结合，C3：催化活性，C4：通道调节活动，C5：电子传递活性，C6：酶调节活性，C7：金属伴侣活性，
C8：分子转导活性，C9：核酸结合转录因子活性，C10：营养库活性，C11：蛋白质结合转录因子活性，C12：蛋白标签protein tag，
C13：受体活性，C14：结构分子活性，C15：翻译调节活性，C16：转运活性
图6 All-Unigene GO功能分类图
··152
2.4 代谢通路分析
将 44175条All-Unigene进行KEGG代谢通路分
析，有 19274条（43.6%）能够在KEGG上被注释，这些
All-Unigene共被注释到 128个代谢通路上，被注释的
基因数量排行前 10位的有：代谢途径（5678条，
29.46%）、内吞作用（2243条，11.64%）、甘油磷脂代谢
（2151条，11.16%）、醚脂类代谢（2038条，10.6%）、次生
代谢产物的生物合成（1844条，9.57%）、RNA运输（956
条，4.96%）、淀粉和蔗糖代谢（913条，4.74%）、植物荷
尔蒙信号转导（833条，4.32%）、植物病原菌互作（780
条，4.05%）、剪接体（756条，3.92%）。这涉及了包含碳
水化合物、氨基酸、能量、脂肪酸等物质的代谢和遗传
信息加工过程，几乎囊括了生命活动的各方面，进一步
说明通过百合雌蕊转录组测序获得的信息量较大，覆
盖面较广，能够对百合雌蕊中多种信息加工途径和代
谢途径从分子水平上进行分析。
表4 被注释的基因数量排行前10代谢通路
代谢通路
代谢途径
内吞作用
甘油磷脂代谢
醚脂类代谢
次生代谢产物的生物合成
RNA运输R
淀粉和蔗糖代谢
植物激素信号转导
植物病原菌互作
剪接体
被注释的基因数(19274)
5678 (29.46%)
2243 (11.64%)
2151 (11.16%)
2038 (10.57%)
1844 (9.57%)
956 (4.96%)
913 (4.74%)
833 (4.32%)
780 (4.05%)
756 (3.92%)
代谢通路号
ko01100
ko04144
ko00564
ko00565
ko01110
ko03013
ko00500
ko04075
ko04626
ko03040
注：小括号内表示注释到该途径的基因占被注释基因总数的百分比。
3 结论与讨论
本研究以花蕾显色但未出现柱头分泌液的百合
“干柱头”雌蕊，以及出现大量分泌液“湿柱头”雌蕊，作
为百合雌蕊转录组测序的材料。2个样品的Unigene
通过序列拼接，去冗余处理，以及同源转录本聚类，得
到44175条All-Unigene（平均长度805 bp）。基于NR、
NT、Swiss-Prot、GO、KEGG和COG等 6数据库进行相
似性比对（E 值≤10- 5）依次分别有 30343、21647、
21281、19274、12964、22227个基因被注释。KEGG分
析中，19274条 All-Unigene被注释到 128个代谢通
路。基因分析结果表明，百合未授粉成熟雌蕊已为授
粉受精做好了物质、能量、信号转导以及抗病原等准备
工作。
由代谢通路分析可知，这段时期各类代谢较为旺
盛。其中内吞作用旺盛，表明大量的大分子物质（例如
蛋白质、脂类）通过内吞作用进入胞内[9]，为细胞营养
及细胞器构建提供材料。授粉前，成熟的百合花柱道
引导组织细胞中含有丰富的细胞器[10]。本研究中甘油
磷脂代谢、醚脂类代谢以及淀粉和蔗糖代谢旺盛，暗示
其为柱头及花柱道分泌液供给脂质、碳水化合物营养
以及信号物质[10]。上述 3类物质代谢旺盛，暗示雌蕊
分泌液营养和信号物质、为花粉萌发和伸长做好了准
备。本研究中次生代谢物合成旺盛，表明雌蕊可能为
授粉提供诱惑剂（气味、颜色、味道）和防御剂等方面的
准备[11]。前人研究表明生长素能促进H+分泌和纤维素
酶合成，从而促进柱头和花柱道细胞壁松驰、有利于花
粉管进入与伸长[12-13]，在水稻中发现授粉前柱头中与生
长素相关基因(OsSAURs)表达显著上调[14]，本研究中发
现植物激素信号转导较为活跃，暗示雌蕊内源激素活
跃、信号转导旺盛，为授粉、花粉管与雌蕊互作，做好准
备。授粉前，雌蕊大量的营养物质（例如柱头分泌液）
暴露在环境中，增加了遭受病原物侵害的风险。为了
保证生殖过程的健康进行，植物进化出相应的病原物
防御系统[15]。本研究发现植物病原菌互作的代谢通路
较为活跃，可能也与防御生殖过程的病原物侵害有关。
总之，通过授粉前百合雌蕊的转录组测序，发现大
量基因表达，主要为授粉受精进行物质、能量、信号转
导、抗病原等准备。为了更深入确定与雌蕊中授粉受
精相关基因，比较了出现大量分泌液“湿柱头”和未出
现分泌液的“干柱头”的转绿组差异，发现了4688个上
调和2425个下调基因，后续笔者将就基因差异表达与
雌蕊授粉受精关系进行深入研究。
蔡晓昂等：百合未授粉成熟雌蕊转录组测序研究 ··153
中国农学通报 http://www.casb.org.cn
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