全 文 ：文章编号:1001-4829(2007)06-1296-03
　　收稿日期:2007-03-21
　　基金项目:云南省自然科学基金(2003C0028Q)
作者简介:柴卫淑(1979-),女 ,河南安阳人 ,硕士 , ＊为通讯作
者。
利用 ARP-PCR法早期鉴定百合远缘杂种
柴卫淑 1 ,屈云慧 2＊ ,谭学林1 ,熊　丽2
(1.云南农业大学生物技术与应用学院 ,云南昆明　650201;2.云南省农业科学院花卉研究所 ,云南 昆明　650205)
摘　要:以不同杂种系的百合品种进行远缘杂交培育杂种。杂种采用 Anchoredrandomprimer-polymerasechainreaction(ARP-PCR)
鉴定 ,首次报道了利用 ARP-PCR技术早期鉴定百合杂种。即利用已经在百合染色体上锚定的引物 ,扩增亲本和杂种的 DNA,鉴定
杂种。实验结果表明:ARP-PCR技术中锚定引物的长度是 15bp,退火温度 54℃,只扩增出材料的主带型 ,可重复性高 ,可靠性好。
关键词:ARP-PCR;百合;远缘杂种;早期鉴定
中图分类号:S644.1　　　文献标识码:A
ARP-PCRidentificationofhybridsderieved
frominterspecifichybridizationinLilium
CHAIWei-shu1 , QUYun-hui2＊ , TANXue-lin1 , XIONGLi2
(1.FacultyofAgronomyandBiotechnology, YunnanAgriculturalUniversity, YunnanKunming650201, China;2.FlowerInstituteYunnanA-
cademyofAgriculturalSciences, YunnanKunming650205, China)
Abstract:InterspecificcrossesweremadetoproducehybridsinLilium.Anchoredrandomprimer-polymerasechainreaction(ARP-PCR)i-
dentifiedthehybrids.DNAofthehybridsandtheirparentswasextractedandamplifiedwithARP-PCRtoidentifyhybrids.Theresultsshowed
thatARP-PCRwasreproductiveandreliabletechniqueforLiliumhybrididentification, whichcouldbethefirstreportofhybrididentification
inLiliumwithPCRmarkers.IntheARP-PCR, asingleprimerof15bpwasusedinthePCRreaction, withannealingtemperatureat54℃.
Keywords:ARP-PCR;Lilium;interspecifichybridization;Forepartidentification
　　百合是百合科(Liliaceae)百合属(Lilium)植物
的总称 [ 1] 。百合花形优美 ,高贵典雅 ,观赏价值很
高 ,是世界重要的鲜切花品种之一。随着百合类植
物在国际花卉贸易份额的不断提高 ,促进了新品种
的选育和推广。种内杂交育种与种间杂交育种是百
合育种最重要的途径 ,可以人为地将有利的遗传性
状进行自由组合 ,在田间得到表现后 ,获得新品种 。
但是百合杂交常有明显的不亲和性 ,杂种胚早期败
育 [ 2] 。鉴于育种中杂种胚和胚乳的不亲和导致的
杂种胚败育 ,可采用胚挽救技术来解决 [ 3 ～ 4] 。但在
培养过程中 ,外植体携带的母体组织也可能诱导成
苗 ,所以必须进行杂种鉴定 [ 5 ～ 6] 。
由于植物生长在不同环境 ,不同发育阶段 ,所携
带的 DNA是稳定的 ,所以分子标记技术成为杂种鉴
定 、分析性状连锁的常用技术手段 [ 7 ～ 9] 。 Abe在研
究亚洲百合杂种系花色素苷形成的基因分析中 ,利
用 17个 10 bp, 37个 15 bp, 14个 20 bp的随机引
物 , 33个 ISSR引物 ,绘制出遗传图谱 [ 10] 。这些引物
在百合染色体上得到锚定 ,有确切位点 ,可以作为百
合 RAPD分析的基础。
本试验通过 ARP-PCR鉴定百合远缘杂种苗的
真实性。即采用 Abe(2002)已经锚定的百合随机引
物对杂种及亲本的 DNA进行扩增 ,以在幼苗阶段判
别胚培后代的杂种真实性 ,为百合杂种的早期鉴定
提供参考 ,为早日育出百合新品种提供技术支持 。
1　材料与方法
1.1　供试材料
通过子房切片培养方法挽救杂种胚 ,获得杂种
苗。亲本取自云南省农科院花卉研究所球根花卉研
究中心 ,杂种苗取自该所百合幼胚培养课题组。 ①
1296
西　南　农　业　学　报
SouthwestChinaJournalofAgriculturalSciences　　　　　　　　　　　　　　
2007年 20卷 6期
Vol.20　　No.6
DOI :10.16213/j.cnki.scjas.2007.06.037
表 1　引物序列
Table1　Primersequence
引物 Primer 序列 Sequence
P1 TGRCCAACCCGGCA
P2 AGCCTGTCGTACGTG
P3 GCAGATGGCACGGAG
P4 ATAGCGGCGTGCCAG
P5 GGCGCAATTCATGGC
P6 CTTCGCTCGAACGCG
P7 CACCCGTAGCGTGAG
P8 GCCTGCCTGCTGACG
P9 GACACGGCCCGATAG
P10 ACGGGGTTTACCGCT
东方百合 “tom”,亚洲百合 “quito”;tom×quito授精
后 32d子房切片培养获得的再生植株 。②东方百
合杂种系 “tom”;亚洲百合杂种系 “polyanna”;tom
×polyanna授精 28d后子房切片培养获得的再生
植株。 ③东方百合杂种系 “sobonne”;亚洲百合杂种
系 “nawana”;sobonne×nawana授精 34 d子房切片
培养获得的再生植株 。
1.2　方法
1.2.1　百合 DNA提取　参照酚提取法 [ 11]提取百
合 DNA。剪 1 ～ 4 g百合的新鲜叶片 ,在液氮中磨
碎 ,提取 DNA混合物后加入 RNase,再加入 NaAc和
乙醇 。振荡混匀 ,析出 DNA。加适量 TE溶解 ,保
存 。对所提取的 DNA进行琼脂糖凝胶电泳 ,检测
DNA浓度和质量。
1.2.2　PCR扩增及电泳检测 　参照顾红雅 [ 12] ,
PCR反应液总体积 25 μl, 1 mmol/L引物 、 0.4
mmol/LdNTP、 2 mmol/LMgCl2 、1 UTaq酶 、 10 ×
bufer和 50 ng模板 DNA。
引物参照 Abe等发表序列 [ 10] (表 1)。Taq酶 、
dNTP及引物购自上海生工生物工程公司 ,利用亚洲
百合 quito和东方百合 sobonne对所有引物扩增 。
PCR扩增仪为 PTC-100 ,反应程序自行设计:93 ℃
预变性 3 min,然后 94℃变性 1.5 min, 54 ℃退火 1
min, 72 ℃延伸 2min, 40个循环后 72℃ 5min,最后
4 ℃保存。琼脂糖凝胶电泳分析 PCR扩增产物 , 40
V电压 1.5 h,紫外灯下照相显示带型。
图 1　DNA经 1 %琼脂糖电泳检测
Fig.1　DNAexaminedby1% agar
图 2　筛选引物的扩增产物经 2 %琼脂电泳检测
Fig.2　Theamplifiedproductofprimerexaminedby2%agar
2　结果与分析
2.1　百合 DNA的提取质量
所提取的 DNA经 1 %琼脂糖凝胶电压检测 ,可
见 DNA带型清晰而整齐 , 每条带的亮度与标准
λDNAR的亮度相比 , DNA浓度符合实验要求 。如
图 1。
2.2　引物的筛选
10个引物对亚洲百合杂种系的 quito和东方百
合杂种系的 sobonne扩增 ,扩增带型如图 2。
　　从图 2可见 , P2扩增的带数最多 , sobonne扩增
出 6条带 , quito扩增出 7条带 。 P2引物在百合第
7、16、22染色体上 。P1以及 P8-P10的扩增带型中 ,
quito与 sobonne的扩增带型均为 1条带 ,而且大小
基本相同 。引物 AGCCTGTCGTACGTG(P2)多态性
较好 ,因此用来对所有测试百合样本进行扩增。
2.3　百合亲本及杂种的 PCR扩增产物
百合亲本及杂种扩增带型如图 3(A.材料 1;B.
材料 2;C.材料 3)。
　　杂种的带型如果同时有父本和母本的带 ,则确
定为真杂种。如果仅有母本的带 ,则是子房壁组织
发育而来的幼苗[ 8, 13] 。图 3-A中 ,杂种 2有母本 tom
750 bp的 1条带 ,大于 250 bp的 1条带 ,父本 quito
小于 250bp的 1条带 。杂种 3有母本 tom750bp的
1条带 ,父本 quito250 bp左右的 1条带 ,可以确定
杂种 2和 3杂种为真杂种 。图 3-B中 , 杂种 6
有母本 tom2 50 ～ 5 00bp之间的 1条带 , 父本 pol
M.marker;1.tom;2.tom×quito培养 8 d萌发;3.tom ×quito培养 12
d萌发;4.quito5.tom;6.tom×polyanna;7.polyanna;8.nawana;9
nawana×sobonne;10.sobonne
图 3　百合杂种的分子鉴定
Fig.3　MolecularidentificationofhybridinLilium
12976期 　　　　　　柴卫淑等:利用 ARP-PCR法早期鉴定百合远缘杂种
yanna750 bp左右的 1条带 , 500 bp的 1条带 ,确定
是真杂种 。图 3-C中 ,杂种 9有母本 sobonne2000
bp的 1条带 , 750 bp的 1条带 ,父本 nawana500 bp
左右的 1条带 ,确定为真杂种。
3　讨　论
　　植物的 DNA在不同时期 、不同环境中均是稳定
的 ,杂种鉴定中常采用分子鉴定 。史永忠等(1998)
在鉴定柑桔体细胞杂种时建立了柑桔 RAPD技术体
系 ,引物长度 10 bp,退火温度 36 ℃[ 8] 。栾雨时等
(1998)采用 RAPD技术鉴定番茄杂种 ,引物长度
10bp,退火温度 36 ℃[ 9] 。国内百合育种中 ,杂种采
用分子技术鉴定的尚未见报道 。
据 Obata等采用 RAPD技术做百合杂种鉴定 ,
引物 TGGTATCAGAGCC的多态性最好[ 14] 。该引物
为 13个碱基 。PCR反应中 ,退火温度是 50 ℃。本
试验中 ,采用的是 anchoredrandomprimer,在百合染
色体上已经定位 。而且引物较长 ,多态性好的引物
AGCCTGTCGTACGTG为 15个碱基 , PCR反应程序
中退火温度更高 ,为 54 ℃。扩增中只出现了主带
型 ,受操作过程的影响小 ,重复性好。
图 3中 1和 5均是 tomde带型 ,带型相似 。说
明采用 ARP-PCR进行杂种鉴定 ,可重复性高 ,可靠
性好。
东方百合杂种系的 tom、sobonne的扩增带型
中 , tom与 sobonne在 750、1000 bp处各有相同的 1
条带 ,说明 2个百合材料亲缘关系较近。东方百合
杂种系的 tom、sobonne与亚洲百合杂种系的 pol
yanna在 750bp处有相同的带。说明百合通过近百
年的人工杂交育种 ,品种间 、杂种系间的遗传关系已
日趋接近。此结果与赵祥云[ 15]的研究结果一致。
本研究为今后充分利用国内百合资源 ,远缘杂
交以及杂种鉴定 ,培育百合新品种提供技术参考 。
该方法在国内尚属首次报道。
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(责任编辑　谢晓慧)
1298 西　南　农　业　学　报　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　20卷