全 文 ：收稿日期：2014-11-10
基金项目：北京市园林绿化局计划项目（YLHH201500102）；北京市教委科技提升计划项目(PXM2013-014207-000079;PXM2014-014207-000081)
作者简介：冯丽媛(1989-)，女，硕士研究生，从事园林植物资源与育种研究，E-mail:fengliyuan0808@126.com；* 通讯作者：王文和(1964-)，男，博士，
教授，从事园林植物资源与育种研究，E-mail:wwhals@163.com
利用 SRAP分子标记技术对混合授粉后的
百合 F1代父本鉴定
冯丽媛，何祥凤，王文和 *，赵祥云，王树栋，张 克
（北京农学院 园林学院，北京 102206）
摘 要：在百合(Lilium)杂交育种中，常采用多个父本混合花粉与一个母本杂交的方法来提高育种效率，为此，研究明确快速父本鉴
定方法极为重要。 采用 SRAP 分子标记技术对亚洲百合 Red Latin 为母本，亚洲百合 Matrix 和野生种山丹为父本混合授粉后百合
杂交 Fl代进行父本鉴定。 引物筛选共获得 4 对条带清晰、 多态性高的引物 （Me1Em4，Me5Em9，Me7Em2 和 Me7Em7） 用于后续
SRAP 分子标记分析。 采用聚丙烯酰胺凝胶电泳技术， 对 11 个 F1 后代单株和 3 个亲本材料的 SRAP 分子标记结果表明：用
Me1Em4 引物在 11 个 F1后代单株里检测出 3 条父本特征条带， 可以确定 8 个后代的父本是 Matrix，2 个后代的父本是山丹；用
Me5Em9 引物检测出 2 条父本特征条带，可以确定 3 个后代的父本是 Matrix，1 个后代是山丹；用 Me7Em2 引物检测出 2 条父本特
征条带，可以确定 5 个后代的父本是 Matrix，2 个后代是山丹；用 Me7Em7 引物检测出 2 条父本特征条带，可以确定 3 个后代的父
本是 Matrix。 综合分子标记鉴定结果，确定 9 个株系是 Red Latin×Matrix 后代，2 个株系是 Red Latin×山丹的后代，同时表明 SRAP
分子标记技术可以用于混合授粉后代父本的鉴定。
关键词：百合；SRAP；混合授粉；父本特征带
中图分类号：S682.2.65 文献标识码： A 文章编号：1000-1700（2015）02-0230-04
Identification of Paternal Parent of the F1 Progenies in Lily Genus
from a Mixed-pollen Cross Using SRAP
FENG Li-yuan, HE Xiang-feng, WANG Wen-he, ZHAO Xiang-yun, WANG Shu-dong, ZHANG Ke
(College of Landscape Architecture, Beijing University of Agriculture，Beijing 102206, China）
Abstract： In the hybridization Breeding of Lilium, often using multiple male and a female mixed pollen hybridization methods to
improve breeding efficiency, therefore, studying clearly paternal quick identification method is extremely important. Genetic
relationship among 11 Fl progenies from the cross combination of Red Latin×(Matrix+Lilium pumilum DC) using a mixed-pollen
cross and their parents were studied using sequence-related amplified polymorphism (SRAP) with 4 primer combinations (Me1Em 4,
Me5Em9, Me7Em2, Me7Em7), in order to identify their real fathers. Our results showed that Me1Em 4 primer pair identified 3
paternal characteristic bands, indicating 8 progenies from Matrix and 2 progenies from Lilium pumilum DC; Me5Em9 primer pair
identified 2 paternal characteristic bands, indicating 3 progenies from Matrix and 1 progenies from Liliumpumilum DC; Me7Em2
primer pair identified 2 paternal characteristic bands, indicating 5 progenies from Matrix and 2 progenies from Lilium pumilum DC;
Me7Em7 primer pair identified 2 paternal characteristic bands, indicating 3 progenies from Matrix. From the above results, we
concluded that 9 hybrids from Red Latin×Matrix were identified， and 2 from Red Latin×Lilium pumilum DC. All results obtained
in this paper indicated that SRAP molecular markers were efficient in identifying paternal parent of progenies from a mixed-
pollen cross.
Key words： Lily; SRAP; mixed-pollen cross; paternal characteristic band
百合是单子叶植物亚纲，百合科(Liliaceae)，百合属(Lilium)多年生草本球根花卉 [1]，是人们喜爱的世界五大
切花之一[2]。百合种类繁多，品种多样，花朵绚丽多姿。这些美丽的百合品种，除了少部分优良野生资源外，大部
沈阳农业大学学报，2015，46(2)：230-233
Journal of Shenyang Agricultural University
冯丽媛，何祥凤，王文和，等 .利用 SRAP 分子标记技术对混合授粉后的百合 F1 代父本鉴定 [J]. 沈阳农业大学学报，2015，46（2）：
230-233.
http：//www.syauxb.com
DOI:10.3969/j.issn.1000-1700.2015.02.017
冯丽媛等：利用 SRAP分子标记技术对混合授粉后的百合 F1代父本鉴定第 2期 - -
分通过杂交选育而成。 然而，不同百合种群间的杂交亲和性不同，有些种群间杂交较为困难[3]，因此，在杂交育
种中常采用多个父本混合花粉与一个母本杂交，这样就需要鉴别杂交后代的父本，为此，研究明确快速父本鉴
定方法极为重要。 现代分子标记技术已经成功运用于植物杂种后代的遗传分析， 前人应用 ISSR 标记技术、
DALP标记技术和 RAPD 分子标记技术对百合进行遗传研究 [4-6]。分子标记技术也运用于多父本后代的鉴定，如
利用 AFLP分子标记技术将混合授粉后的茶树的 4个父本通过聚类分析完全分开[5]，应用 SSR标记技术对冬枣自
然授粉实生苗 1728 株和灵宝大枣自然授粉 530株实生苗进行父本鉴定[6]。 利用相关序列扩增多态性(Sequence—
related amplified polymorphism，SRAP）分子标记技术鉴定百合杂交 F1代的亲本类型 [7]，分析研究百合部分种及
品种遗传结构 [8]，分析野生百合的遗传关系[9]。 但利用 SRAP分子标记技术特点，对混合花粉授粉百合杂交后 F1
代进行真实父本确定在国内外尚未见报道，类似工作已见于其他植物的育种中，如茶树[5]，华山松[10]等。 百合杂交
育种中，混合花粉授粉法可以提高百合杂交的可孕性，相应提高选种效率。 但混合花粉授粉杂交后代有多个父
本，确切父本还需要进一步鉴定。 百合新品种国际登录和新品种审定等也都需要明确其亲本来源和遗传背景，
因而对百合混合授粉获得的后代进行父本鉴定十分必要。 同时，鉴定结果可以对百合远缘杂交的亲和性进行
判断，并为百合育种提供可行办法。
1 材料与方法
1.1 材料
2012~2014 年试验在北京农学院园林植物试验基地进行。 供试百合 Red Latin（母本）和 Matrix（父本）为亚
洲百合，种球通过西诺（北京）花卉种业有限公司从荷兰引进，周径为 14~16cm；供试百合山丹（Lilium pumilum
DC）为华北地区野生百合。
供试新型快速植物基因组 DNA 提取试剂盒购自北京百泰克生物技术有限公司；Taq DNA 酶 MIX 购自日
本 Takara公司。 试验采用的凝胶成像仪为美国 Vilber Lourmat 公司生产。
1.2 方法
在 2012年 6 月 1日，开花前对母本 Red Latin进行去雄、套袋，6 月 6 日，开花当天等量混合 Matrix 和山丹
新鲜花粉对母本 Red Latin 进行常规授粉，授粉后继续套袋。 授粉 8 周后取膨大的果实，在无菌条件下进行胚
抢救，使用培养基配方为 1/2MS+蔗糖 60g·L-1+琼脂 4.8g·L-1，获得杂交后代组培苗并进行编号。 对后代组培苗
进行 4 次继代培养，再诱导鳞茎膨大和生根后，将其经过低温（5~12℃）休眠 12 周，将组培苗移栽到日光温室，
使用栽培基质为进口草炭∶蛭石 （v/v）=1∶1。 采样取植株上部刚刚展开的叶片， 采样株系编号为 1-7，1-12，1-
13，1-14，1-15，1-16，1-17，1-18，1-19，1-20和 1-21，共 11个百合杂交 F1代。
1.2.1 DNA 提取 采用 DNA 提取试剂盒（离心柱型）对百合叶片的 DNA 进行提取。 1.2%琼脂糖凝胶电泳检
测提取 DNA的质量[11]。利用 Nano Drop（美国 Thermo Scientific）测定样品 DNA 的浓度。用灭菌的 ddH2O将样品
DNA浓度稀释至 50 ng·μL-1，置于-20℃冰箱中保存备用。
1.2.2 SRAP反应体系及引物筛选 使用孙宇明等[11]报道的对亚洲百合及野生种山丹具有特异扩增条带的 10对引
物组合（表 1），并以本研究中杂交百合父母本 Red
Latin、Matrix 和山丹的 DNA 为模板进行 SRAP 引
物筛选。 SRAP反应体系及程序参考孙宇明等[15]的
方法。 反应体系为： 上下游引物 （10 μmol·L-1）各
2μL，Taq DNA酶MIX 25μL，模板 DNA（50 ng·μL-1）
2μL，加 ddH2O补足到 50μL。 反应程序为: 94 ℃预
变性 5 min； 94 ℃变性 1 min，35 ℃退火 1 min，
72 ℃延伸 1 min 30 s，5 个循环； 94 ℃变性 1 min，
55 ℃退火 1 min，72 ℃延伸 1 min 20 s，35 个循环；
最后 72 ℃延伸 10 min。扩增结束后，SRAP产物经
2%的琼脂糖胶电泳检测。 初步选取琼脂糖胶电泳
上多态性好的引物组合，对其扩增产物进行 8%聚
表 1 10 对 SRAP引物组合
Table 1 10 primer combinations used for SRAP analysis
组合
Combinations
Me1Em4
Me2Em5
Me3Em2
Me3Em7
Me3Em8
Me4Em4
Me5Em8
Me5Em9
Me7Em2
Me7Em7
正向引物
Forward primers
5-TGAGTCCAAACCGGATA-3
5-TGAGTCCAAACCGGAGC-3
5-TGAGTCCAAACCGGAAT-3
5-TGAGTCCAAACCGGAAT-3
5-TGAGTCCAAACCGGAAT-3
5-TGAGTCCAAACCGGACC-3
5-TGAGTCCAAACCGGAAG-3
5-TGAGTCCAAACCGGAAG-3
5-TGAGTCCAAACCGGTCC-3
5-TGAGTCCAAACCGGTCC-3
反向引物
Reverse primers
5-GACTGCGTACGAATTTGA-3
5-GACTGCGTACGAATTAAC-3
5-GACTGCGTACGAATTTGC-3
5-GACTGCGTACGAATTGAA-3
5-GACTGCGTACGAATTCTG-3
5-GACTGCGTACGAATTTGA-3
5-GACTGCGTACGAATTCTG-3
5-GACTGCGTACGAATTCGA-3
5-GACTGCGTACGAATTTGC-3
5-GACTGCGTACGAATTGAA-3
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第 46卷沈 阳 农 业 大 学 学 报- -
丙烯酰胺凝胶电泳及银染[13]。 采用凝胶成像仪拍照并保存。
2 结果与分析
2.1 引物筛选
通过琼脂糖凝胶电泳法检测 10 对引物组合对 14 个样品的 DNA 扩增，进行引物筛选，选出父本特征条带
清晰、 稳定且有高度区分度的引物组合对混合授粉后的杂交组合后代进行鉴定。 选出 Me1Em 4，Me5Em9，
Me7Em2和 Me7Em7共 4对引物组合，运用聚丙烯酰胺凝胶电泳法，对 11 个百合杂交后代进行鉴定。
2.2 SRAP分析
用引物组合 Me1Em4 进行鉴定的结果表明： 得到 3 条 Matrix 父本特征条带， 其大小分别为 500~600bp，
400~500bp和 300~400bp，得到 1 条山丹父本特征条带，其大小为 100~200bp（图 1）。 此引物鉴定出 Red Latin×
Matrix 的后代为 1-7，1-14，1-15，1-16，1-18，1-19，1-20 和 1-21 共 8 株，Red Latin×山丹的后代为 1-13 和 1-
17共 2株。
M.100bp LadderⅡ;♀.Red Latin；♂1. Matrix；♂2.山丹；→.♂1 特征带；荩.♂2 特征带;1.1-7；2.1-12；3.1-13；4.1-14；5.1-15；
6.1-16；7.1-17；8.1-18；9.1-19；10.1-20；11.1-21
M.100bp LadderⅡ;♀.Red Latin;♂1.Matrix;♂2.LI lium pumilum; Paternal characteristic band of♂1; Paternal characteristic band of ♂2;
1.1-7; 2.1-12; 3.1-13,;4.1-14; 5.1-15; 6.1-16; 7.1-17; 8.1-18;9.1-19; 10.1-20; 11.1-21
图 1 引物组合 Me1Em4 对亲本和 F1代扩增的电泳图谱
Figure 1 Amplification result of the parents and F1 hybrids by the primer combinations of Me1Em4
9
600bp
500bp
400bp
300bp
200bp
100bp
M 2 1 2 3 4 5 6 7 8 10 111♀ ♂ ♂
用引物组合 Me5Em9 进行鉴定的结果表明：得到 1 条 Matrix 父本特征条带，其大小为 600~700bp，得到 1
条山丹父本特征条带，其大小为 100~200bp。 此引物鉴定出 Red Latin×Matrix 的后代为 1-7，1-15 和 1-16 共 3
株，Red Latin×山丹的后代为 1-17共 1 株。
用引物组合 Me7Em2 进行鉴定的结果表明：得到 1 条 Matrix 父本特征条带，其大小为 200~300bp，得到 1
条山丹父本特征条带，其大小为 100~200bp。 此引物鉴定出 Red Latin×Matrix 的后代为 1-15，1-16，1-18，1-19
和 1-20共 5株，Red Latin×山丹的后代为 1-13 和 1-17共 2株。
用引物组合 Me7Em7 进行鉴定的结果表明：得到 2 条 Matrix 父本特征条带，其大小分别为 300~400bp 和
100~200bp。 此引物鉴定出 Red Latin×Matrix的后代为 1-12，1-14和 1-15共 3 株 。
综合分子标记鉴定结果， 确定编号为 1-7，1-12，1-14，1-15，1-16，1-18，1-19，1-20，1-21 的 9 个株系是
Red Latin×Matrix的后代，占后代总数的 81.82%；编号为 1-13,1-17 的 2 个株系的是 Red Latin×山丹的后代，占
后代总数的 18.18%。
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冯丽媛等：利用 SRAP分子标记技术对混合授粉后的百合 F1代父本鉴定第 2期 - -
3 讨论
杂交所用的花粉是亚洲百合品种 Matrix和野生百合山丹新鲜等量混合花粉，二者基因型差异大，筛选出 2
个父本都有特异性条带的引物有一定难度，在 10 对引物中只有 4 对（Me1Em4，Me5Em9，Me7Em2 和 Me7Em7）
可以检测到父本的特征条带，这 4对引物通用性相对较好，可以确定父本真实性。
本试验选取的杂交组合后代全部鉴定出了确切的父本，可见 SRAP 分子标记技术是混合授粉后百合 F1代
父本鉴定有效手段。SRAP是一种基于 PCR的标记系统，通过独特的双引物设计对基因开放阅读框的特定区域
进行扩增，上游引物长 17 bp，对外显子区域进行特异扩增。 下游引物长 18 bp，对内含子区域、启动子区域进行
特异扩增。因不同个体以及物种的内含子、启动子与间隔区长度不同而产生多态性。 SRAP分子标记具有高效、
产率高、简便、高共显性、易测序、重复性好、便于克隆目标片段的特点[12]。 在运用 SRAP标记鉴定混合授粉后杂
交后代的父本来源时，关键之处是找到作为父本材料的特异性条带，本试验中引物组合 Me1Em4 鉴定结果图
中就明确显示有 2条 Matrix父本特征条带和 1条山丹父本特征条带。综合分析，Me1Em4，Me5Em9，Me7Em2三
组引物鉴定出 11 个后代株系中有 2 株父本是山丹。 同理，从 4 对引物组合鉴定结果综合分析，确定其余 9 个
株系的父本为 Matrix。 此研究表明对于混合授粉百合 F1代父本的鉴定，很难用 1对引物对所有的 F1代进行准
确区分，必须筛选多对引物、并对不同引物标记的结果进行综合分析、相互验证才能获得可靠的结果。 尤其当
后代群体数量多时更是如此。 此结果在季杨（2009）进行多花黑麦草品种间杂交及其杂种后代 SRAP 遗传分析
时也得到了验证[13]。
本试验杂交组合的后代中， 父本来自野生百合山丹的后代只有 2 株， 占后代总数 18.18%。 而另一父本
Matrix 的后代占 81.82%，这也表明两个父本材料的花粉在母本 Red Latin 的雌蕊柱头上授粉、受精竞争的过程
中山丹处于劣势。 这是由于山丹属于原生种，和亚洲百合 Red Latin杂交属于远缘杂交，亲和性差，获得后代几
率小。 Matrix和 Red Latin同属于亚洲百合杂种系，杂交属于近缘杂交，杂交易于成功。 运用多父本混合授粉法
进行新品种培育可大大提高育种效率，尤其对百合这类多年生球根、母本种质资源又珍贵、单株花朵数量少的
花卉采取混合授粉育种意义更大。 然而，后期选育出的杂种后代的父本来源不明确，从遗传育种到新品种的推
广等则必须确定杂种后代的真实父本，因此对混合授粉后杂交 F1代的父本鉴定十分必要。
本研究利用 SRAP分子标记技术对 Red Latin为母本，Matrix和山丹为父本混合授粉后百合杂种 Fl代进行
了父本鉴定，验证了 SRAP 分子标记技术在百合杂种 Fl代父本鉴定中应用的可行性和效率，为今后对更多材
料花粉混合授粉后获得的百合后代进行父本确定提供科学依据，从而促进百合育种的进程。
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[责任编辑 马迎杰]
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