全 文 ：第 38卷　第 1期
2 0 0 7 年 1 月
海　洋　与　湖　沼
OCEANOLOGIA ET L IMNOLOGIA SIN ICA
Vo l. 38, No.1
Jan. , 2 0 0 7
假根羽藻 Cytb6 f蛋白复合体的分离与纯化*
李宾兴1　毛大璋1　高振泮 2　李良璧 1①　匡廷云 1①
(1. 中国科学院植物研究所光合作用与环境分子生理学重点实验室　北京　100093;
2.中国科学院海洋研究所实验海洋生物学重点实验室　青岛　266071)
　　*国家自然科学基金资助项目 , 39890390号和 30370347号。李宾兴 ,博士研究生 , E-m ail:lb inxing@yahoo. com
①通讯作者 , E-m ail:lb li@ns. ibcas. ac. cn, kuang ty@public. bta. ne.t cn
1) H auska G, 2003. The iso la tion of func tiona l cy to chrom e b6 f comp lex:from lucky encoun te r to rewa rding expe riences.
F rom:www. b io logie. uni-regensbu rg. de /Botanik /H auska /b6 f gov. pdf
收稿日期:2004-08-16,收修改稿日期:2006-06-04
提要　　改进了以往分离纯化 Cyt b6 f的方法 ,进行了海洋绿藻———假根羽藻 (Bryopsis corticu-
lans)Cy tb6 f蛋白复合体分离纯的研究。结果表明 ,该 Cy tb6 f制剂由 Cy t f、Cy t b6 、R ieske[ Fe-
s]蛋白和亚基 IV四种主要的多肽亚基以及少量的 Chl.a和类胡萝卜素组成。 4个多肽亚基
的表观分子量分别为 34.8、24.0、18.7及 16.7kD ,该 Cy tb6 f制剂的 Cy t b6 /f比值接近 2.0 ,其
纯度值为 9.9nmo lCy t f /mg,其催化电子传递的活性 (C10-PQH2→PC)为 73e /s。上述分析表
明 ,假根羽藻 Cy tb6 f在组成 、纯度和催化活性方面均与已报道的高等植物 、淡水绿藻和光合细
菌的 Cy t b6 f制剂相似 。
关键词　　海洋绿藻 ,假根羽藻 , Cytb6 f ,分离 ,纯化
中图分类号　　Q5
　　细胞色素 b6 /f蛋白复合体 (Cy t b6 f )作为质
体醌-质体蓝素氧化还原酶 ,在光合作用的电子传
递及能量转化过程中扮演着重要的角色 。它一
方面介导光系统 II(PSII)和光系统 I(PSI)之间的
线性电子传递和围绕 PSI的循环电子传递 ,另一
方面利用电子传递过程中释放出来的自由能将
质子从类囊体膜的外侧跨膜传递到类囊体膜的
内侧 ,形成跨膜的质子电化学梯度 ,为 ATP的合
成提供能量 (C ramer et al, 1987;Hope, 1993)。此
外 ,它还可以通过调控 LHC II激酶的磷酸化 ,在
调节 PS II和 PS I之间激发能分配中起作用 (A n-
derson, 1992)。
每个 Cyt b6 f单体分子由 4个大亚基(33 /34—
17kD):含有一个 c-型血红素的 Cy t f,含有两个 b-
型血红素的 Cy t b6 , Rieske[ Fe-s]蛋白 (含有一个
2Fe-2S原子簇)与亚基 IV和 4个小于 5kD的小
亚基组成。四个大亚基中 ,前三个亚基的色基均
为氧化还原中心 ,而亚基 IV则被视为 PQ的结合
蛋白(Li et al, 1991)。另外 ,它还含有约 1分子的
叶绿素 a和 1分子或低于 1分子的类胡萝卜素。
自 Hurt等 (1981)首次分离纯化出有活性的
Cy tb6 f以来 ,人们已从许多不同来源的植物中分
离纯化出了 Cy t b6 f制剂 ,例如 ,高等植物中的菠
菜和豌豆(Huang et al, 1994;Phillips et al, 1983),
淡水绿藻中的莱茵衣藻(Ch lamydomonas reinhardtii)
和斜生栅列藻(Scenedesmus obliquus)(Wynn et a l,
1988), 以及蓝细菌中的钝顶螺旋藻 (Spirulina
pla tensis)、项圈藻 (Anabaena variabilis)和集胞藻
(Synechocystis PCC6803)(Hauska, 2003)1)。迄今
为止 ,尚未见到有关海洋绿藻 Cy tb6 f的报道。假
根羽藻 (Bryopsis corticula)是管藻目的多核单细
胞海生绿藻 ,它生长在潮间带 ,细胞壁较薄 ,含有
较多藻胶 ,在我国东南沿海分布较广 , 是一种分
离 、纯化类囊体膜蛋白复合体的比较理想的实验
材料。因此 ,本研究中作者改进了以往分离纯化
Cy tb6 f的方法 (Yan et a l, 2001),成功地从假根羽
藻中分离纯化出了其类囊体膜的 Cyt b6 f提取物 ,
并对该提取物的组成和生物活性进行了鉴定。
70　 海　　洋　　与　　湖　　沼 38卷
1　材料与方法
1.1　材料
假根羽藻于 2001年 9月采自青岛汇泉湾。
分离纯化 Cy tb6 f使用的 β-辛基葡萄糖苷(β-OG)、苯
甲基磺酰氟 (PM SF)、胆酸钠 (SC)、癸基质体醌
(C10-PQ 2)等购自 S igma公司 (USA)。
1.2　多肽组成分析
参照 Laemm ili(1970)的十二烷基硫酸钠-聚
丙烯酰胺凝胶电泳 (SDS-PAGE)方法进行。分离
胶浓度为 15%,浓缩胶浓度为 4%。考马斯亮蓝
G-250染色 。电泳于室温条件下进行。
1.3　氧化还原差光谱的测定
Cyt b6 f的氧化还原差光谱分析 ,采用岛津
UV-2550型双光束分光光度计测定 。测定时用铁
氰化钾 [K3 Fe(CN)6 ]使 Cyt b6 f氧化 ,用抗坏血酸
使 Cy t f还原 ,用连二亚硫酸钠使 Cy t b6还原。样
品中 Cyt f和 Cy tb6的浓度通过测定其氧化还原差
异光谱确定 ,计算时 Cyt f和 Cy t b6的消光系数分
别采用 18mM - 1 cm -1(554— 540nm)和 20mM -1 cm - 1(563— 575nm)
(Hurt et a l, 1981)。
1.4　质体蓝素的制备
质体蓝素 (PC)按 E llefson等 (1980)的方法
从新鲜的菠菜叶中制备 ,菠菜购自香山市场。
1.5　电子传递活性的测定
Cy tb6 f催化电子传递活性的测定参照 R ich
等 (1987)的方法进行 。本实验中所测 Cy t b6 f
的酶活性是指它催化电子供体 C10-PQH 2至电子
受体 PC-K 3Fe(CN)6 的电子传递速率 。 PC和
K 3Fe(CN)6的消光系数分别为 4.8mM -1 cm - 1(595nm)
和 1.0mM - 1 cm -1(420 nm)。
电子供体还原态癸基质体醌 (C10-PQH 2)的
制备:在 C10-PQ 2 乙醇溶液中加少量硼氢化钾
(KBH 4),然后用添加少量 HC l使 KBH4降解并放
氢的方法使 C10-PQ2还原为 C10-PQH2。
电子受体溶液:由 50mmol /L Mes(pH 6.2),
2mmo l /L EDTA , 5μmol /L PC和 1mmol /L K3Fe(CN)6
组成。
活性的测定:添加 C10-PQH2到电子受体溶液
中使其浓度达到 20μmol /L,测定反应速度 1,添
加 Cy tb6 f到电子受体-电子供体溶液使其浓度达
到 20nmol /L,然后测反应速率 2。反应速率 2减
速率 1即得 Cyt b6 f催化电子传递的速率。电子
传递活性以 K 3Fe(CN)6在 420nm处吸收的变化
来计算 。
1.6　总蛋白测定
按 Low ry等(1951)方法进行。
1.7　Cytb6 f制剂中色素的反相 HPLC分析及其
吸收光谱的测定
Cy tb6 f中色素的抽提:将 Cyt b6 f样品置于
80%的丙酮中超声波处理 2m in, 离心收集上清
液 ,将沉淀再用上述方法抽提一次 ,合并上清液
即为色素的完整抽提液。
反相 HPLC:色素的反相 HPLC分析用 D is-
cove ry C-18柱 (Supw eleco. , 25 ×4.6mm , 5m icro)
在W ate rs 600HPLC仪上进行。上样前用甲醇将
柱子预平衡 10m in,上样后 ,线性梯度洗脱 1m in
到甲醇∶正己烷 =4∶1(预混合好 ),然后用甲醇:
正己烷 =4∶1(预混 合好 )洗脱 16m in。上样
20μl,洗脱速度 1m l /m in, 洗脱出的色素成分用
W ate r 996光电二级管阵列检测器在 440nm处进
行检测 。
洗脱出的色素成分的吸收光谱测定:在 W a-
ter 996光电二级管阵列检测器连续检测的条件
下 ,洗脱出的色素成分的吸收光谱用仪器的管理
系统 M illenn ium 2010在洗脱峰处给出 。
2　结果与分析
2.1　Cyt b6 f的分离纯化
预实验结果表明 ,按照从菠菜类囊体膜中分
离纯化 Cy tb6 f的方法 (Yan et a l, 2001)不能有效
地从假根羽藻的类囊体膜中纯化出该蛋白复合
体 。绝大部分的 Cy t b6 f已于最后一步硫酸铵沉
淀前析出 ,最终仅得到极少量的 Cy t b6 f制剂 ,且
其纯度很低 。为此 ,作者调整了 Cy t b6 f的粗制品
透析后硫酸铵沉淀的饱和度 ,将透析后 38%—
45%饱和度的硫酸铵沉淀物确定为需要收集的
Cy tb6 f组分。调整后的分离纯化步骤得到了较
大量的 Cy tb6 f制剂 ,但 SDS-PAGE分析显示 ,除 4
种主要的多肽外 ,还含有微量的 40— 60kD的杂
蛋白。为更好的去除杂蛋白 ,参照 Huang等(1994)
及 Hurt等 (1981)的方法 ,在原流程的基础上 ,增
加一次用 2mo l /L N aBr的洗膜过程 ,收到了理想
的效果 (图 1)。用此改进的方法 ,获得了高纯度 、
高活性的假根羽藻 Cy t b6 f ,且有很好的重复性。
具体的分离纯化流程如图 2所示 ,整个分离纯化
过程均在弱光 4℃下完成 。分离纯化过程中的具
体数据见表 1。
1期 李宾兴等:假根羽藻 Cy t b6 f蛋白复合体的分离与纯化 71　
图 1　假根羽藻 Cy t b6 f制剂 15% SDS-PAGE图谱
F ig. 1　15% SDS-PAGE o f p repa ra tion fo r Cy t
b6 f from B ryopsis corticu lans
1. 纯化的假根羽藻 Cy t b
6
f蛋白复合体;2. 标准蛋白
通常用样品中 Cyt f的含量与蛋白含量的比
值来估算 Cy t b6 f的纯度。 Cy t b6 f单体的分子量
约为 100— 104kD,因此 ,当其纯度为 100%时 ,样
品中 Cy t f的含量为 9.6— 10nmo l Cy t f /mg。表 1
结果表明 , 38%— 45%的硫铵沉淀后 , Cy t f的含
量为 9.9nmo l Cy t f /mg,说明用此改进方法获得
的 Cy tb6 f的纯度已很高。 Cy t b6 f制剂的产率为
19.50%(表 1)。
2.2　Cyt b6 f的特征分析
2.2.1　Cy tb6 f制剂的多肽组成分析　　图 1为
纯化的假根羽藻 Cy tb6 f样品的 SDS-PAGE图谱。
从中可以看出 ,按照迁移率增大的顺序依次是
Cy t f、Cyt b6 、R ie ske-FeS蛋白及亚基 IV ,表观分子
量分别为 34.8kD、 24.0kD、 18.7kD 及 16.7kD。
从电泳图谱 (图 1)还可以看出 ,该假根羽藻 Cy t
b6 f具有较高的纯度。由于在每个 Cy t b6 f蛋白
复合体的 b6 亚基上结合有两个 b-型的血红素
(Heme b6H和 Heme b6L ), f亚基上结合有一个 c-型
表 1　Cyt b6 f的纯度及产率在纯化过程中的变化
Tab.1　Varia tion in pu rity and y ie ld of Cy t b6 f during purification
Cy t b6 f的制备 Cy t f(nm o l)
Cy t b6
(nm o l) Cy t b6 /Cy t f 蛋白质(m g)
Cy t f /蛋白质
(m g) 相关产率(%)
30000g离心后 171. 00 434. 70 2.54 79.23 2. 16 100.00
40000g离心后 102. 13 253. 65 2.48 12.76 8. 00 59.70
38%— 45%硫铵沉淀 33. 32 67. 60 2.02 3.37 9. 90 19.50
的血红素(Heme f),因此 ,一个完整的 Cy t b6 f中
Cy tb6与 Cy t f的比值应为 2∶1,此比值也常被用
来鉴定 Cy tb6 f制剂的完整性 。图 3为 Cy t b6 f的
氧化还原差光谱 ,从中可以看出 ,源于 Cy t b6的
564nm处的最大吸收峰与源于的 Cy t f的 554nm
处的最大吸收峰之比等于 2.02,表明在分离纯化
的过程中 Cy t b6或 Cy t f均没有丢失。
2.2.2　Cy t b6 f制剂的色素组成 　　图 4是用
80%丙酮从假根羽藻 Cy t b6 f制剂中抽提出的色素
的反相 HPLC图谱 ,从中可以看出 ,在此图谱上有
3个主要的洗脱峰 (分别在 9. 54m in, 14. 07m in和
14. 38m in)。其中 9. 54m in洗脱出来的色素的吸
收峰峰位在 431. 6nm和 664. 4nm(叶绿素 a的特
征峰 ),所以此色素为叶绿素 a。其前的两个小
洗脱峰也是叶绿素 a(吸收图谱未示出 )。在
14. 07m in洗脱出的色素吸收峰的峰位分别为
443. 2nm和 471. 4nm;14. 38m in洗脱出的色素分
子 ,除在 438. 4nm和 465. 6nm有两个主要的吸收
峰外 ,还在 330. 2nm处有一个较弱的吸收峰。从
吸收峰的形状可以判断 ,在 14. 07m in和 14. 38m in
洗脱出的色素应为类胡萝卜素分子 。
2.2.3　催化电子传递的活性　　以 C10-PQH 2为
电子供体 ,菠菜的 PC为电子受体 ,参照 Rich等
(1986)及 Pie rre等 (1995)的方法 ,用光谱法对
Cy tb6 f催化电子传递的活性进行了测定 。结果
表明(图 5), 1分子的 Cyt b6 f每秒可以催化 73个
电子发生转移(73e /s)。
3　讨论
本研究结果表明 ,用于从菠菜类囊体膜中分
离纯化 Cy t b6 f的方法不适合假根羽藻 Cy t b6 f的
提取 ,这可能与假根羽藻中藻胶含量较高 、膜表
面的其他蛋白组分较复杂有关 。据此 ,作者对菠
72　 海　　洋　　与　　湖　　沼 38卷
图 2　假根羽藻 Cy t b6 f蛋白复合体分离纯化流程示意图
F ig. 2　Pu rifica tion pro cedu res o fB ryopsis corticulans Cy t b6 f comp lex
1期 李宾兴等:假根羽藻 Cy t b6 f蛋白复合体的分离与纯化 73　
图 3　Cy tb
6
f制剂的氧化还原差光谱
F ig. 3　The redox d iffe rence in spec tra o f Cy tb6 f prepara tion
———为连二亚硫酸钠还原-抗坏血酸还原的差异吸收光
谱;- - - -为抗坏血酸还原-铁氰化钾氧化的差异吸收
光谱
菜 Cy tb6 f分离纯化流程中硫酸铵沉淀的饱和度
进行了调整 ,为去除 40— 60kD的杂蛋白 ,在原流
程的基础上 ,增加了一次用 2mo l /L N aBr的洗膜
过程。结果表明 ,这种改进取得了较好的效果(图
1),所得 Cy t b6 f制剂的纯度达到了 9.9nmo l Cy t
f /mg,其纯度接近 100%。然而用改进后的流程
纯化假根羽藻 Cyt b6 f时 , Cyt b6 f的产率却仅有
19.5%,与已报道的 Cy t b6 f产率相比 , 下降了
1.5— 2倍 (Pierre et al, 1995;Doyle et al, 1985),
这可能是由于对分离纯化流程中硫酸铵沉淀饱
和度的调整或进一步 N aB r洗膜去除杂蛋白造
成的 。
本 Cy t b6 f制剂的 4个大亚基的表观分子量
由大到小 依次为 34.8kD、 24kD、 18. 7kD 及
16.7kD。相近条件下的电泳结果表明 , C. reinha-
图 4　假根羽藻 Cy t b6 f制剂中色素的 H PLC图谱
F ig. 4　HPLC chrom atogram o f p igm en ts extracted from Bryopsis corticu lans Cy t b6 f prepa ra tion
rdtii及 S. obliquus Cy t b6 f制剂的 4个亚基的表观
分子量分别为 35kD、23kD、19kD、16kD及 35kD、
23kD、20kD、16KD(B lack et a l, 1987);菠菜的表
观分子量为 33kD、 23kD、 20kD、 17kD(Huang et
al, 1994);M. lam inosus的表观分子量为 33kD、
24kD、21kD、18kD;Synechosy stis PCC6803的表观
分子量为 38kD、24kD、19kD、15kD(Roegner et a l,
1990)。由此可以看出 ,假根羽藻 Cyt b6 f的表观
分子量与 C. reinhardtii和 S.obliquus的表观分子
量更为接近 。在早期的研究中 , Cy t b6 f中的色素
分子被认为是污染 ,近来的研究表明 ,它们为 Cy t
b6 f的天然成分 ,每分子纯化的 Cy t b6 f制剂中含
有约 1— 1.5分子的叶绿素 a和 1分子或低于 1
分子的 β-胡萝卜素 (Pierre et a l, 1997;Zhang eta l,
1999;Yan et a l, 2001), Cy tb6 f的晶体结构研究表
明 ,每个 Cy t b6 f单体分子中含有 1分子的叶绿素
a和 1分子的 β-胡萝卜素(Kurisu et al, 2003;Stro-
ebe l et al, 2003)。反相 HPLC分析表明 ,假根羽
藻 Cy tb6 f制剂中同样含有叶绿素 a及类胡萝卜
素分子 。在目前已纯化出的 Cy t b6 f制剂中 ,除蓝
74　 海　　洋　　与　　湖　　沼 38卷
图 5　Cy t b6 f的电子传递活性
F ig.5　E lec tron transfe r ac tivity o f Cy t b6 f prepara tion
1. PC +C10PQH2 +K3Fe(CN)6;
2. PC+C10PQH2 +K 3Fe(CN)6 +Cy t b6 f
细菌 Synechosystis PCC6803的 Cy tb6 f含有的类胡
萝卜素为 β-胡萝卜素-4酮外 (Bo ronow sky et a l,
2001),其它 Cy t b6 f中的类胡萝卜素均为 β-胡萝
卜素(Zhang et al, 1999;Yan et al, 2001),并且它
们多具有 9-cis的构型(Yan et al, 2001)。 β-胡萝
卜素-4酮的吸收峰位于 458nm , 9-cis-β-胡萝卜素
的主要吸收峰位于 444nm和 471nm ,与本制剂中
14.07m in和 14.38m in洗脱出的类胡萝卜素的吸
收峰峰位 (443.2, 471.4nm;438.4 , 465.6nm)有
较大的差别 。由此可见 ,假根羽藻 Cy tb6 f中的类
胡萝卜素可能是另一种类的类胡萝卜素分子。
对比分析结果表明 ,提取的类胡萝卜素的吸收谱
与报道的 α-胡萝卜素的吸收谱较为接近。
本文中纯化的 Cy t b6 f催化电子传递的活性
为 73e /s(图 5),该速率比Wynn等 (1988)报道的
淡水绿藻 Cy t b6 f的活性高出 2— 10倍 ,和 Huang
等 (1994)、B lack等 (1987)及作者测定的菠菜 Cy t
b6 f的活性相近。这说明作者纯化的假根羽藻叶
绿体 Cy t b6 f不仅具有高的纯度 ,而且还具有较
高的活性 ,是进行 Cy t b6 f结构与功能研究的理
想样品 。
致谢　　中国科学院海洋研究所王广策研究员
在材料采集工作中给予热情帮助 ,谨致谢忱。
参　考　文　献
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Zhang H M , Huang D R, C ram e rW A, 1999. S toichiom e t-
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o f oxygenic photosynthe sis protec ts aga inst oxygen dam-
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ISOLATION AND PURIFICATION OF CYT b6 f COMPLEX
FROM BRYOPSIS CORTICULANS
L I B in-Xing1 , MAO Da-Zhang1 , GAO Zhen-Pan2 , L I Liang-B i1① , KUANG T ing-Yun1①
(1. Key Laboratory of Photosyn thesis and Environmen ta lMolecular Physiology , Institu te of Botany ,
Ch inese Academy of Sciences, Beijing 100093;
2. Key Labora tory of Experim enta lMarine B iology , Institute ofO ceanology ,
Chinese Academ y of Sciences, Q ingdao , 266071)
Abstract　　A s a plastoqu inol-plastocyanin oxido reduc tase, cy tochrome b6 f comp lex p lays an importan t role
in electron transfer and energy transduction in pho to syn thesis. Itmediates the linear e lec tron flow betw een PS II
and PSI, ca talyzes the cyc lic electron flow around PSI, and sets up a transmembrane proton e lec trochem ical
potential to support energy to form ATP. In add ition , cytochrome b6 f comp lex is also invo lved in the regulation
of ba lanced ligh t excitation energy distribu tion be tw een pho tosystem s since its redox sta te s gove rns the activa-
tion of LHC II kinase. It consists of fourma jo r subun its(Cyt f, Cy tb , Rieske iron-su lfur pro tein, and subunit
IV) and four small subunits(pet G , L, M , and N). B esides, about one chlorophy ll a mo lecu le and one or
less than one carotenoid molecule have been found in each cy toch rome b6 f monomer. The cy tochrome b6 f
comp lex has been purified from higher plants, freshw a te r g reen a lgae and cyanobacteria. How ever, no case has
been reported o f this comp lex from marine green alga. In this w ork, the cytochrome b6 f complex w as purified
from amarine g reen a lga———B ryopsis corticulans successfully by an imp rovedmethod, its composition and ac-
tiv ity w e re studied in this paper.
A ccord ing to the pu rifica tion of spinach b6 f complex, Cy t b6 f was no t isola ted from Bryopsis corticulans
thy lakoid. Itw as shown tha tmost of the b6 f comp lex has gone be fore last ammonium sulfate frac tiona tions. To
solve this prob lem , ammonium su lfate concentration w as ad justed. A lthough th ismodifica tion w as proved to be
useful, some 40— 60kD extrinsic pro teins still ex isted. To e ffectively remove these extrinsic pro te ins, 2mo l /L
N aB rmembrane w ash ing w as repea ted after that the ex trinsic prote ins w ere removed successfully show n by
SDS-PAGE. Thismodified purifica tion procedu res forB ryopsis corticulans b6 f comp lex are:Chlorop lasts w e re
iso lated from 2kg pre-chilled fresh B ryopsis corticulans as regular w ay. A fte r o smo tica lly broken, the ch lo ro-
plasts w ere resuspended in 2mol /L N aBr, 10mmo l /L T ric ine-N aOH(pH 8.0), 0.4mo l sucrose and the con-
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centra tion of ch loroplasts w as d ilu ted to 1mg /m l, then centrifuged a t 8000g fo r 20m in. This step(2mo l /L
N aB rmembrane w ashing)was repea ted. Cy tochrome b6 f ex traction w as carried out as regu larw ay. The crude
b6 f complex then precip itated by raising ammonium sulfate concen tration from 45%— 60% and w as resus-
pended in 30mmo l /L Tis-suc(pH 7.0), containing 1% sodium cho late. A fte r dia ly zed fo r 12h against
30mmol /L T is-suc(pH 7.0), 25mmol /L sucrose, 10mmo l /L N aC l and 40μmo l /L PM SF, the p ro tein so lu-
tion w as cen trifuged at 40000g for 5m in. the cy tochrome b6 f pe lle tw as resuspended to abou t 20μmol /L Cy t f
in 20mmol Tricine-N aOH(pH 8.0), containing 30mmo l /L β-OG and 0.5% sodium cho late and w as subjec-
ted to furthe r ammonium su lfa te frac tionations. Prec ip itate fo rmed in fractions from 38%— 45% was the end
product o f pu rified cy tochrome b6 f. A ll the testsw e re perfo rmed a t 4℃ under d im ligh.t
Using th is improvedm ethod , a pu re and ac tive Cy tb6 f was purified from marine green algaBryopsis cor-
ticu las. Itw as shown tha t the purity o f this complex neared 100%(9.9nmo l cy t f /mg) and its activity w as
73e /s(C10PQH2→PC). M o lecu larmasses o f the fourma jo r po lypeptidesw e re 34.8kD , 24kD , 18.7kD , and
16.7kD. The ratio of Cy t b6 to Cy t f was 2.02∶1. B esides Chl.a , there are tw o k inds of caro teno ids in this
comp lex and their intensity peaksw ere a round 443.2 and 471.4nm , 438.4 and 465.6nm , respective ly. They
w ere different from the caro teno ids reported in b6 f complex and the ir absorption spec traw ere sim ilar to those o f
α-caro tene. Ongo ing inve stiga tion is in progress.
Key words　　Marine g reen alga, B ryopsis corticulans, Cyt b6 f complex, Iso lation, Purifica tion