全 文 ：第 29卷 第 4期 海 洋 通 报 Vol. 29, No. 4
2010 年 08 月 MARINE SCIENCE BULLETIN Aug. 2010
收稿日期：2009-06-17；修订日期：2009-12-08
基金项目：海洋赤潮灾害立体监测技术与应用国家海洋局重点实验室开放研究基金资助课题重点项目 ( 200801 )
作者简介：顾佳萍 (1985－)，女，上海人，硕士研究生，环境科学专业，主要从事水环境新生污染物的研究。电子邮箱：feixuezhuangzhu@sina.com
通讯作者：袁涛，副教授，硕士生导师。电子邮箱：taoyuan@sjtu.edu.cn

赤潮毒素软骨藻酸检测方法研究进展
顾佳萍，袁涛
(上海交通大学环境科学与工程学院，上海 200240)

摘 要：海洋环境污染日趋严重，赤潮的频发导致赤潮藻毒素严重威胁着人类健康。软骨藻酸是由拟菱形藻产生的一种记忆丧失性
贝类毒素，在很多海域均有检出和中毒报道。针对中国相关研究较为薄弱的现状，本文首先介绍软骨藻酸的研究背景、理化性质和
毒性，然后对其检测分析方法进行了详细的综述，讨论了生物分析法、高效液相色谱法、酶联免疫分析法、毛细管电泳法等各自的
优缺点及适用性，并建议今后要结合分子模拟技术、分子印迹技术、胶体金、生物传感器等技术研发更快速、简便、灵敏的新方法。
关键词：赤潮藻毒素；记忆丧失性贝毒；软骨藻酸；检测；进展
中图分类号：X55 文献标识码：A 文章编号： 1001-6932(2010)04-0472-06

A critical review for determination methods of
the marine algal toxin-domoic acid

GU Jia-ping, YUAN Tao
(School of Environmental Science and Engineering, Shanghai Jiao Tong University, Shanghai 200240, China)

Abstract：Marine pollution becomes worse in recent years and frequently occurred red tides is threatening human
health due to the marine algal toxins. Domoic Acid (DA), an amnesic shellfish toxin mainly produced by
Pseudo-nitzschia, has been identified and reported with poisoning cases in many sea areas. As the relevant researches
are limited in China, this paper firstly introduced the research background, physical-chemical properties and toxicity of
DA. The analytical methods were then reviewed in detail. The pros and cons of the methods, such as bioassay,
high-performance liquid chromatography, enzyme-linked immunoassay, capillary electrophoresis, were discussed.
Finally, some promising directions were proposed to develop faster, simpler and more sensitive detection methods for
DA based on several new developed technologies such as molecular simulation, molecular imprinting, colloidal gold,
biosensor and so on. This paper provides some important information for the DA relevant researches.
Keywords：marine algal toxin; amnesic shellfish poisoning; domoic acid; detection; development

近三十年来，海洋环境污染日趋加重，海洋赤
潮也频频发生。由赤潮生物产生的大量生物毒素通
过食物链污染了水生动物，进而威胁人类健康。软
骨藻酸（Domoic Acid, DA）是一种记忆丧失性贝类
毒素，它最早是在 1987 年加拿大爱德华王子岛的
东海岸因食用紫贻贝而造成的食物中毒事件中被
发现的。中毒者症状主要表现为腹痛、腹泻、呕吐，
并伴有记忆丧失、意识混乱、不能辨认家人及亲朋
好友等严重精神症状，严重者陷于昏睡状态甚至死
亡，中毒者即使在病愈后仍然丧失记忆长达十几个
月，因此称之为记忆丧失性贝类中毒。后来经过专
家们分析鉴定，发现该中毒物质为 DA，主要由经
常在加拿大东海岸形成赤潮的一种硅藻——多列
拟菱形藻产生[1]。此后，在加拿大、美国海岸，拟
菱形藻赤潮产生 DA 而引起危害的事件不断被报
道。
由于贝类毒素毒性大，反应快，无适宜解毒剂，
给防治带来了许多困难，因此开展贝类毒素的快速
检测研究对确保水产品安全及人体健康极为重要。
目前国外对 DA 的研究主要集中于水产品中含量的
检测方法以及毒性研究，但中国对其研究还属于起
步阶段，尚缺乏有效的检测手段和监控网络。
中国是一个贝类生产大国，近几年来的赤潮藻
类污染对贝类的影响越来越大，贝毒不仅对人类的
4 期 顾佳萍 等：赤潮毒素软骨藻酸检测方法研究进展 473

图 1 软骨藻酸分子结构
Fig. 1 Molecular structure of DA
健康构成威胁，而且影响了贝类的销售，造成经济
损失。因此，建立快速、高效、特异、灵敏的贝毒
素检测技术至关重要。虽然中国检出 DA 的报导还
很罕见，但在中国海区，已经检测到了多种拟菱形
藻，其广泛分布在中国沿海，其中有九种拟菱形藻
是潜在产毒种，在非中国海区均有产毒报道[2]。中
国现在几乎没有检出 DA 有可能是因为目前中国拟
菱形藻污染还不严重，但也有可能是现有的检测方
法还不够灵敏，缺乏有效的检测技术。本文综述了
国内外相关研究进展，详细分析了各种检测方法的
优缺点，并讨论了今后研究的新思路，为中国尽快
建立高效的检测痕量 DA 的方法提供重要参考。

1 软骨藻酸理化性质和毒性
DA 分子式为 C15H21NO6，分子量为 311.33，其
分子结构如图 1。DA 纯品为白色固体粉末，溶于
水，微溶于甲醇，熔点 223~224 ℃，在紫外光谱区
最大吸收波长为 242 nm，在体积比为 1:9 的乙腈/
水溶液和-12 ℃黑暗条件下可保持稳定一年左右[3]。
DA 在常温或光照下在碱性溶液中不会降解[4]，但
它在酸性溶液(pH = 3)中一星期降解 50%[5]。DA 分
子中含有三个羧基和一个仲氨基，羧基结构的 pKa
分别为 2.10、3.72、4.97，氨基结构的 pKa 为 9.82[6] ，
因此它在溶液中的存在受 pH 的影响[7]。

DA 是一种兴奋性脯氨酸衍生物和神经毒素，
是浮游植物代谢的产物，可以在被藻类污染的海洋
食物特别是贝类中检测到，其结构与红藻氨酸和谷
氨酸相似，是红藻氨酸受体的兴奋剂[3,8]。DA 主要
由某些拟菱形藻属和菱形藻属的海洋硅藻产生，
Walz 等[9]检测了水中澳洲拟菱形藻的含量及 DA 的
浓度，只要该种藻在水中的含量达 4.0×103 个/L，
就可检出 DA。
水生动物(尤其是贝类)能富集 DA，但同时它们
具有很强的耐受力，而食用这些水生动物的鸟类、
海洋哺乳类动物和人类则会引起不同程度的中毒
症状。贝壳类动物的摄食过程是通过不断过滤水流
进行的，这样在它们的内脏组织中会浓缩蓄积 DA，
并在组织间迁移，可通过食物链影响人类健康。DA
可以通过胃肠粘膜吸收，但吸收率低[10]，其纯品也
可通过呼吸道、角膜和皮肤直接进入体内而产生危
害。在血液中，DA 以带电的亲水分子形式存在，
能够到达所有外周组织[11]。
DA 可影响人和动物的消化道、心血管系统、
中枢神经系统[12]，它对与内脏功能有关的脑干区域
具有兴奋作用，而对与记忆有关的脑区域具有明显
的神经毒性作用。此外，DA 也会损害脊髓、视网
膜[12,13]。研究发现，贝组织中 DA 含量达到 40 mg/kg
时可引起食用者中毒，150 mg/kg 时有致死危险，
人类通过进食可耐受的最大限量为 20 mg/kg，加拿
大首先制定了 DA 的安全限量标准为 20 μg/g 贝肉，
欧洲、日本也相继将该种毒素列为贝类常规检测项
目[7,14,15]。

2 软骨藻酸检测分析方法
DA 的检测方法有好几种，主要检测的是贝类、
浮游植物、海水以及人体和动物血液、尿液、粪便
中 DA 的含量。常用的检测方法主要有生物分析法、
高效液相色谱法、酶联免疫分析法、毛细管电泳法
等等。生物分析法灵敏度较低，选择性弱，因此应
用有限。高效液相色谱法是目前官方指定的标准方
法，该方法检测限低，灵敏度高，特异性强，应用
广泛。高效液相色谱的检测器有紫外检测器、荧光
检测器和质谱检测器，由于贝类提取液中干扰组分
复杂，光度检测往往不能提供化合物的充分结构信
息，因此会引起假阳性的结果，而质谱能提供化学
物质的结构信息，是一种高效的方法，能作为 DA
确证的分析方法。另外，在传统检测方法的基础上，
近年来发展了许多新的检测方法，如神经受体结合
检测技术、生物传感器法等，但目前应用范围不广，
还存在一些缺陷，没有被广泛采用。
2.1 生物分析法
小鼠生物分析法是最早用于 DA 检测的一种经
典方法，其原理是将毒素注射入小白鼠体内，根据
注射后小鼠的存活时间和中毒症状来评价毒性，一
般用半致死剂量表示[16]。1987 年该方法首次应用于
加拿大 DA 中毒事件中 DA 的测定，结果显示该方
法适于检测贝类组织中高浓度的DA(高于30 μg/g)，
DA 浓度较低时无法检测(低于 20 μg/g)[17]。该方法
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具有应用广泛、有历史数据、能表达出样品实际毒
性、不需复杂设备等优点，但仍然存在着许多缺陷
和不足，如灵敏度低、假阳性高、重现性差、操作
时间长、无法区别毒素的种类等[17]，已逐渐被其他
新的分析方法所取代。
2.2 高效液相色谱法(HPLC)
高效液相色谱法是目前检测 DA 应用最广的方
法，已被多国列为国家标准方法，中国国家标准[18]
中规定使用反相高效液相色谱法检测海产双壳类
贝肉、贝柱、外套膜及其制品(不包括盐渍制品)中
的 DA 含量，该方法检测限为 1 μg。
生物分析法注重的是样品毒性的分析，其专一
性和灵敏度低，而高效液相色谱法则能灵敏、快速、
准确地确定各种毒素成分，被广泛用于研究和确认
实验。HPLC 检测 DA 是利用其在 242 nm 处具有最
大吸收值的特征使用紫外或二极管检测器进行检
测，或者将 DA 衍生后通过荧光检测器进行分析，
或使用质谱进行检测。其中质谱法检测范围广、灵
敏度高、定性准确、速度快、操作简单，已被越来
越多的研究人员采用。
2.2.1 紫外检测法 高效液相色谱－紫外检测
法（HPLC-UV）特别适用于贝类组织中 DA 含量的
测定，尤其适用于毒素含量超过 20 μg/g 的情况。
Lawrence 等人建立[19]以及 Quilliam 等[20]改进的
HPLC-UV 法采用了反相 C18 柱在 242 nm 处检测
DA，该方法已被英国、爱尔兰等国定为标准方法[21]。
后来，又有一些研究人员对此方法进行了改进。
López-Rivera 等[22]建立了一种不需要固相萃取预处
理检测 DA 的 HPLC-UV 法，通过等梯度淋洗以及
控制流动相 pH 来分离化合物，结果表明，最佳 pH
为 2.5，方法检测限为 25 ng/mL。该方法快速、灵
敏，能成功检测大批量贝类样品。HPLC-UV 法已
经被很多研究人员用来检测贝类等动物组织中的
DA 含量。Costa 等[23]用 HPLC-UV 法检测了葡萄牙
海岸的两种章鱼 E.cirrhosa 和 E.moschata 体内 DA
的含量，结果表明，DA 含量超过了 100 μg/g，其
中，E.moschata 体内毒素含量更高，表明 DA 可能
通过食物链由这种章鱼体内进入更高级消费者如
人类体内，潜在危险性更大。中国对 DA 的检测大
多采用 HPLC-UV 法，陈西平等[24]采用该方法检测
了部分水及水生动物中 DA 的含量。结果表明，虽
然在海水及地面淡水中未检出 DA，但部分海洋贝
壳动物体内有检出。因此，随着海洋污染的加剧，
现阶段中国的 DA 污染问题不容忽视，应加强对其
污染状况的监测。
2.2.2 荧光检测法 高效液相色谱－荧光检测
法是使用衍生剂将 DA 衍生成含荧光基团的物质，
用荧光检测器进行检测，在 DA 分子上引入荧光基
团可使方法的灵敏度提高。James 等[25]使用 NBD-F
来衍生化 DA，用等梯度淋洗程序分离化合物，激
发波长为 470 nm，发射波长为 530 nm，方法检测
限高于 1 ng/mL，贝类组织中 DA 的回收率>95%，
当用强阴离子交换 SPE 柱萃取 DA 时，检测限达到
6 ngDA/g 贝类组织。Chan 等[26]参考了这种方法来
检测 DA，但他们改进了样品预处理方法，即在 SPE
柱中加入 TiO2，可以更好地吸附 DA，并探讨了最
佳 pH，结果表明，吸附的最佳 pH 为 4，解吸时 pH
则为 11，吸附平衡时间为 2 小时，最佳吸附剂装载
量为 0.67 mgTiO2 /ngDA。最近，Maroulis 等[27]采用
NBD-Cl 柱后衍生 DA 进行检测，成功测得了贝类
组织中 DA 含量为 75 μg/kg 的样品，该方法检测限
低至 25 ppb，能实现全自动化分析，对样品预处理
要求低，干扰少。由于大多数衍生试剂价格昂贵、
不稳定，且其分解产物可能出现在色谱图中，同时
衍生试剂的变质也可能导致毒素的不完全衍生化，
因此荧光检测法的实际应用很少。
2.2.3 质谱法 现今，由于质谱技术具有检测范
围广、灵敏度高、速度快、操作简单等优点，已经
成为 DA 检测的常用手段。高效液相色谱-质谱
(HPLC-MS)联用技术可以不使用衍生试剂和毒素
标准品，相比其他检测器，具有很大的优势。然而
本方法对设备条件要求较高，现阶段还不能大量用
于基层的日常监测工作。Lawrence 等[28]建立的高效
液相色谱－电喷雾离子阱质谱法(HPLC/ESI-MS)法
是一种高灵敏度、高选择性的方法，被应用到了环
境中各种介质的检测中，并被后人不断改进，但是
这种方法对样品预处理的要求较高。宋琍琍等[29]
参考了这种方法来测定 DA 残留。样品经 50%甲醇
提取，LC-SAX 柱净化，然后选用电喷雾离子源进
行测定分析，该方法的定量限为 0.02 μg/g。Pardo
等[30]采用加压湿法萃取(PLE)来提取 DA，然后用液
相色谱-电喷雾电离双质谱(HPLC-ESI-MS-MS)法
来检测 DA，电离源采用电喷雾可以提高分析信号，
方法经过优化后回收率在 81%至 95%之间，他们用
此方法成功检测了 46 个西班牙超市里的贝类样品，
表明该方法能进行大批量检测。Wang 等[31]采用
LC-MS对水样和浮游植物中的DA进行了定性和定
量分析，样品预处理采用 C18 柱进行固相萃取，结
4 期 顾佳萍 等：赤潮毒素软骨藻酸检测方法研究进展 475

果表明，酸性条件有利于在 C18 柱上保留亲水性的
DA，加标水样的回收率超过了 90%，浮游植物样
品的回收率则接近 98%，方法检测限为 0.03 ng/mL，
本方法不仅可以证明 DA 是由浮游植物产生的，还
揭示了溶解在水中的 DA 也有可能进入海洋食物链
网。Iglesia 等[32]也采用 LC-MS 法检测了海水中的
DA 及它的异构体，但样品预处理采用的是固相萃
取盘，该方法的检测限为 0.02 ng/mL，回收率为
92.1%~110.6%，用此方法能检测海水中的痕量 DA。
2.3 酶联免疫分析法(ELISA)
免疫分析法是基于抗体与抗原或半抗原之间
的高选择性反应而建立起来的一种生物化学分析
法[33]，即根据抗原-抗体反应，采用特异性贝类毒
素的抗体来检测 DA。免疫分析法主要包括酶联免
疫法、放射性免疫法、荧光免疫法等，具有方便、
快速的特点，但缺点是费用较高，而且各毒素之间
的交叉反应低，不能全面体现出样品的毒性。检测
DA 所采用的免疫分析方法主要是酶联免疫吸附法
（ELISA）。
ELISA 是利用抗原-抗体反应的特异性与酶催
化作用的高效性相结合，通过酶作用于底物后的显
色反应判定结果，是目前应用最广泛的免疫学检测
技术，由于其实验结果可用目测，也可用酶标仪测
定光密度值以反映抗原含量，所以有易定性定量的
双重优点[33]。
Yu 等[34]采用匙孔血蓝蛋白(KLH)和小牛血清
蛋白(BSA)为载体，进行直接酶联免疫测定，结果
表明，蓝贻贝样品的检测限<25 ng/g，回收率为
81.1%，Yu 等还将实验结果用 HPLC 方法进行了验
证，最终发现 15 种被污染的贝类样品中有 10 种样
品的 DA 含量<50 ng/g。
Maucher等[35]结合ELISA技术使用血液采集卡
来提取小鼠血液中的 DA，这种方法可以避免 DA
在血液中被清除。一般说来，在 4 小时内，99%的
DA 会从血液中被清除，但使用该方法后，DA 在
24 小时内仍然能被检测到。该方法灵敏度高，用血
液采集卡提取样品方便，因此可用此方法来监测海
洋哺乳动物体内的 DA 含量。
Tsao 等[36]采用单克隆抗体 ELISA 检测法检测
DA，并建立了基于单克隆抗体的胶体金免疫条检测
法，免疫条检测法的检测限为 5 ng/mL，在十分钟内
就可完成检测。Tsao 等的实验结果表明，用免疫条检
测得到的结果与用 ELISA 方法得到的结果有很好的
吻合性，可以用来快速检测贝类样品中的 DA。
另外，Shaw 等[37]建立了基于基因工程单链抗
体（scFv）竞争 ELISA 检测方法，相比传统方法，
这种方法具有很多优势，基因工程单链抗体（scFv）
可以在大肠杆菌中快速、大量地得到表达，且容易
和其他小分子融合，形成融合蛋白以用于检测或其
它用途。用该方法检测天然扇贝组织得到的数据与
标准 HPLC 方法检测的结果基本相符。
大多数 ELISA 法采用的都是直接法，而许道艳
等[38]则以 DA-OVA 为包被抗原，利用抗原抗体反
应，建立了间接竞争酶联免疫吸附技术分析检测海
水样品和海洋贝类中 DA 的方法。结果表明，该方
法最低检出限为 10 μg/L，海水样品平均回收率为
102.2%，贝类样品平均回收率为 111.5%。
ELISA 方法能够进行批量检测，但特异性较
差，因而主要用于 DA 的初步筛选。另外，由于 DA
标准品昂贵，且 DA 分子量太小，因此制备免疫抗
原较困难，从而限制了免疫方法在 DA 分析中的应
用，目前国内还未见商品化的免疫检测试剂盒。
2.4 毛细管电泳法（CE）
毛细管电泳法的基本原理是不同荷质比的带
电粒子在电场中具有不同的迁移速度而得到分离，
然后再经过荧光或紫外检测器进行检测[17]。该方法
具有操作简单、分离速度快、灵敏度高、运行成本
低等优点，是贝类等生物体内 DA 含量常规检测较
理想的方法。
Zhao 等[39]建立了毛细管电泳-紫外检测法来检
测海洋食物中的 DA，首先用 SPE 提纯，使用了强
阴离子交换柱和强阳离子交换柱，避免了基体中色
氨酸的干扰，然后用 CE-UV 在 242 nm 处检测，该
方法能用于检测贻贝、缢蛏、凤尾鱼等样品，最低
能检出 150 ng/g DA。但是在实验同时发现毛细管
电泳法的灵敏度要比液相色谱法(检测限 20 ng/g)
低。李大志等[40]也采用这种方法对 2001 年 5 月在
大连海域(黑石礁海区)采集的 5 种贝类进行分析，
结果表明大连海域黑石礁海区的扇贝受到了 DA 的
污染。Kvasnička 等[41]则建立了一种在线毛细管等
速电泳-毛细管区带电泳法来检测贝类和藻类中的
DA。该方法优化了电解液系统，使 DA 能在 25 分
钟内从甲醇提取液中分离出来，检测限为 1.5 μg/L。
2.5 其他分析方法
除了高效液相色谱法、酶联免疫法等较常用的
方法外，其他方法如薄层色谱法、神经受体结合检
476 海 洋 通 报 29 卷

测法、生物传感器法等也被尝试用于检测 DA。
薄层色谱法（TLC）是将固定相涂布在平板上，
点样后用合适的流动相进行洗脱，不同组分的毒素
将在平板上分开。该方法快速、简单，不需要使用
复杂的仪器，对贝组织中 DA 的检出限约为
10 μg/g[42]。由于其检出限过高、无法准确定量，因
此到目前未被广泛推广使用。
Van Dolah 等人建立了竞争性神经受体分析测
试 DA 毒素的方法，该方法非常灵敏，具有高度专
一性[43]，目前已用来分析贝类和藻类的提取物[44]。
其原理主要是使用青蛙的脑突触体作为受体，将红
藻氨酸放射标记的 DA 结合在谷氨酸神经递质上，
观察神经细胞流的情况。放射受体分析法测试毒素
的检测灵敏度非常高，但由于实验中使用了放射同
位素，限制了这一方法的推广使用。
生物传感器是一种快捷、低廉的检测技术，其
原理是待测物质经扩散作用进入生物活性材料，经
分子识别，发生生物学反应，产生的信息继而被相
应的物理或化学换能器转变成可定量处理的电信
号，再经二次仪表放大并输出，便可知道待测物浓
度。Stevens 等[45]建立了一个表面等离子体共振生
物传感器系统，可以检测贝类、藻类以及海水中
4~60 ppb 的 DA。Lotierzo 等[46]则采用了分子印迹
聚合物作为传感器来检测 DA，该传感器与单克隆
抗体相比，分子印迹聚合物芯片再生时，其识别性
能不会受到影响且能够连续测量至少 2 个月。

3 结论与展望
目前国内外所采用的 DA 的检测方法都有进
一步完善的必要，例如，对于免疫分析法，未来的
发展方向是制作快速检测试剂盒，实现大批量样品
的快速、简便分析。虽然现在已经制作出 DA 的免
疫检测试剂盒，但还有着改进空间，如果能够结合
分子印迹技术、胶体金、生物传感器等新方法，可
以使 DA 的检测更简便、更快速、更准确。
高效液相色谱－质谱法是目前应用较广的方
法，有极好的发展前景，但其对样品预处理要求较
高，因此想要提高该方法的检测效果，应该从样品
预处理方法上进行突破，提高进样溶液的纯度。一
般样品预处理采用的是固相萃取法，除了改进固相
萃取的各种条件外，寻找能更好吸附 DA 的固相萃
取填充材料也极为重要。可以尝试采用分子模拟技
术来筛选填充材料。例如，利用分子模拟技术，通
过电脑软件计算分子间作用力来预测材料对 DA 分
子的吸附效果，可以不通过实验就筛选出分子材
料，这样不仅可以节省大量的时间、精力，而且有
望取得一些创新性成果，是未来选取固相萃取材料
极具潜力的一种手段。
全球海洋环境不断恶化，赤潮频繁爆发，海水
中 DA 的污染水平很可能会随之加剧，但中国在这
方面的研究还比较少，痕量 DA 的检测方法还不完
善，尤其是针对海水中 DA 的检测研究非常少，因
此迫切需要研究快速、简便、灵敏地检测海水中
DA 的方法，尽快掌握该类藻毒素的信息，及时采
取有效手段防止危害发生，保障人类健康。

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