全 文 ：　第 2 6 卷第 1 期
2 0 0 7 年 1 月
热带 海 洋学 报
JOU RNAL OF TROPICAL OCEANOGRAPHY
Vo l. 26 , No. 1
Jan . , 2 0 0 7　
　　收稿日期:2006-03-23;修订日期:2006-04-07。刘学东编辑
　　基金项目:国家自然科学基金项目(30471330);广东省重大专项课题(A3050402)
　　作者简介:向文洲(1967—), 男 , 湖北省鹤峰县人, 副研究员 , 从事微藻生物技术及微藻资源研发工作。E-mai l:xw z@scsio. ac. cn
一种绿球藻的极端适应特性与虾青素高效诱导
向文洲1 , 吴华莲1 , 2 , 谢　科1 , 2 , 何　慧1 , 肖　伟1
(1. 中国科学院南海海洋研究所 , 广东广州 510301;2. 中国科学院研究生院 , 北京 100039)
摘要:绿球藻 Chlorococcum sp. MC-1株系(简称 MC-1)的高盐碱极端适应性和虾青素积累特性的初步研究结果显
示 , MC-1 适应极端高碱培养并保持快速生长 , NaHCO3 浓度为 8g L - 1时 , M c-1 平均比生长率明显高于低碱培
养 (1g L - 1的 NaHCO3), NaHCO3 浓度为 20g L - 1时平均比生长率与低碱培养的相近 , 其最高适应生长 pH 可
达 12 以上。MC-1 积累虾青素等次生类胡萝卜素与室内老化培养物的转红细胞相比 , 室外强光高盐高碱极端条件
(室外太阳光 、 51g L - 1的 NaCl 、 81g L - 1的 NaHCO3) 诱导转红细胞的虾青素和总类胡萝卜素含量分别提高了
50. 46%和 71. 20%, 细胞转红速度显著加快 , 显示出极端条件对虾青素的高效诱导作用。
关键词:绿球藻 Chlorococcum sp. ;极端适应特性;虾青素;HPLC
中图分类号:Q949. 9 文献标识码:A 文章编号:1009-5470(2007)01-0050-05
Extremophilic traits of Chlorococcum sp. and rapid induction of astaxanthin
XIANG Wen-zhou1 , WU Hua-lian1 , 2 , XIE Ke1 , 2 , HE Hui1 , XIAO Wei1
(1. S outh Ch ina Sea Inst itute o f Oceanolog y , CAS , Guangzhou 510301 , China;
2. Graduate Un iv . o f Chinese Acad emy o f sciences , Bei j ing 100039 , Ch ina)
Abstract:Preliminary studies on the adaptation of Chloroccaccum sp. st rain MC-1 (MC-1 fo r sho rt) to
e xt reme alkalinity and salini ty as well as astaxanthin accumulation w ere carried out . T he results showed
that M C-1 could adapt to ext reme alkalinity and g row w ell under such condi tions. The average specific
grow th ra te of M C-1 under 8 g L -1 NaHCO 3 was obviously higher than that under low alkalinity (1 g
L -1 NaHCO3), while that under 20 g L - 1 NaHCO 3 was similar to that under low alkalinity. The maxi-
mum adaptable pH for M C-1 g row th w as above 12. It w as revealed by means of HPLC analy sis that astax-
anthin and several o ther secondary caro tenoids could be induced and accumulated in MC-1. In comparison
wi th the red cells of aging cul ture in the lab , the contents of total carotenoids and astax anthin in the red
cells of M C-1 induced by outdoo r st rong so lar radiation and ex t reme alkali-salinity conditions (51 g L -1
NaCl , 81 g L - 1 NaHCO 3) were enhanced by 50. 46% and 71. 20% respectively , w ith obviously acceler-
a ted change f rom g reen to red in cell co lor. The resul t indicated that MC-1 had the abili ty to grow rapidly
under alkali-salinity conditions , and the ext reme condition could induce accumulation of astaxanthin and
other secondary carotenoids.
Key words:Chlorococcum sp. ;ex t remophile;astax anthin;HPLC
　　虾青素属羰基化类胡萝卜素 , 是许多水产动物
必需的营养成分和优良的着色剂 , 具有抗紫外辐
射 、 抗氧化 、抗肿瘤等功能。虾青素抗氧化功能远
远高于其它次生类胡萝卜素 、 维生素 E 和维生素
C , 因而倍受食品 、制药和化妆品工业的青睐[ 1 -3] 。
近年来 , 从微藻中开发高值化的天然虾青素在
国际上引起了 广泛的关注[ 2 , 3] 。雨生红球藻
Haematococcus p luvialis 在胁迫条件下可以大量积
累虾青素 , 含量高达细胞干重的 4%[ 4] , 远远高于
其它生物。由于雨生红球藻生长速度慢 , 易受微生
　第 1 期 向文洲等:一种绿球藻的极端适应特性与虾青素高效诱导
物污染[ 5] , 在培养过程中难以获得高产 , 使其产品
成本高昂 , 严重妨碍了产业开发与推广 。由此寻找
可快速生长 、 积累虾青素的绿藻如小球藻 Chlo-
rel la zof ingiensis 、绿球藻 Chlorococcum sp. 等绿
藻作为替代种源受到广泛重视[ 6—9] 。
迄今为止 , 在世界上数万种微藻资源中 , 产业
开发最为成功的仅有螺旋藻 、 小球藻和盐藻 , 藻种
对高碱和 (或) 高盐的极端适应和快速生长特性对
其产业开发起到关键作用[ 10] 。筛选极端适应和快
速生长的微藻 , 建立低成本开放式养殖 , 提高细胞
生物活性成分的含量 , 研究极端条件下生物活性物
质的诱导与转化机制具有重要的理论与实践意
义[ 11 , 12] 。
本研究对分离筛选到的耐碱性绿球藻开展生长
特性 、极端适应特性和虾青素诱导等方面进行的初
步研究 , 探索合理开发天然虾青素的新方法与新思
路 , 为其产业开发与深入研究打下基础 。
1　材料与方法
1. 1　藻种与培养方法
1. 1. 1　藻种
本研究材料绿球藻株系 MC-1 (简称 MC-1)
由中国科学院南海海洋研究所微藻项目组于 2002
年在室外蓝藻培养箱中分离得到 , 后经固体纯化培
养得到株系。
1. 1. 2　培养基
使用 ZSN T 培养基 , 配制方法为每升蒸馏水
中分别加入 1g N aCl 、 0. 05g NaH 2PO 4 2H 2O 、
1g NaNO3 、 0. 02g CaCl2 、 0. 05g M gSO 4 7H 2O 、
0. 01 g 柠檬酸以及 M2 、 A 5 和土壤提取液各 1ml ,
其中每升 M2 水溶液含有 0. 244g FeCl3 6H 2O 和
0. 189g Na2 EDTA , 每 升 A 5 水 溶 液 含 有
2. 86gH 3BO3 、 0. 22gZnSO 4 7H 2O 、 0. 01gM OO 3 、
1. 80gM nCl2 4H 2O 和 0. 08gCuSO 4 5H 2O 。
ZSNT 培养基 pH 为 7. 91 , 高压灭菌后根据实验设
计的需要添加不同量的 NaHCO3 。
1. 1. 3　培养条件
耐碱性实验在培养室内进行 , 培养架光强为
135μE m - 2 s- 1 , 温度为 28±2℃, 光周期 L ∶D
为 24∶0。室外强光诱导细胞转红:将室内培养绿
色细胞分 2组转移到室外培养 , 其中 1组维持室内
培养时的营养盐条件 , NaCl和 NaHCO 3 浓度同为
1g L -1 , 另一组采用高盐高碱诱导 , 通过逐步加
入 NaCl 和 NaHCO 3 , 使其终浓度分别为 51g
L -1和 81g L - 1 , 总盐度大于 130 , 太阳直射光最
大光强约 1 400 μE m - 2 s -1 。
1. 1. 4　生长测定
MC-1生长测定用 Unicon-UV-2102 紫外可见
光分光光度计测波长 700nm 光密度值作为生物量
指标 , 绘制 MC-1的生长曲线并计算比生长率 。
1. 2　类胡萝卜素分析方法
HPLC 方法参考 Yuan等[ 13]的方法进行 , 藻细
胞经离心收集 , 弃上清液 , 用蒸馏水清洗 , 然后冷
冻干燥 。定量取冷冻干燥样品 10—15mg , 在避光
条件下加液氮研磨 , 丙酮反复提取直至样品变白为
止 。提取液低温高速离心(4℃, 12 000r min - 1离
心 20min)去沉淀 , 上清液用氮气吹干 , 用甲醇 /二
氯甲烷(9. 5∶3)定容为 1. 25 m l , 然后进行 HPLC
分析。仪器采用美国Waters 1525型高效液相色谱
仪 , Waters2996 型检测器 , Waters 反相色谱柱
SymmetryShield
TM
RP18 5μm (3. 9mm ×150mm)。
HPLC 流动相 A液:二氯甲烷 /甲醇 /乙腈 /水为 10
∶170∶11∶9;B 液:二氯甲烷 /甲醇 /乙腈 /水为 44
∶56∶91 ∶9。用 100%的 A 液梯度洗脱 0—8min;
用 0 到 100%的 B 液梯度洗脱 8—15min;用 0到
100%的 A 液梯度洗脱 15—16min;用 100%的 A
液梯度洗脱 16—25min 。流速为 1. 0m l min - 1 ,
进样体积 20μl。2996 型检测器在 250—700nm 波
长范围扫描 , 在 450nm 处进行检测。用虾青素 、
叶黄素 、角黄素 、 叶绿素 b 、叶绿素 a 和 β-胡萝卜
素(Sigma 产品)做标准品 。
类胡萝卜素含量测定参考 Dere 等[ 14] 的方法进
行 。
1. 3　统计分析
实验设 2个平行样 , 取其平均值 。统计用 Ex-
cel将实验组和对照组进行显著性 t 检验 , 以 p<
0. 05作为显著依据 。图 1 、 2中所示值为平均值±
标准差 。
2　结　果
2. 1　MC-1的快速生长特性
在较低碳酸氢钠浓度范围内 , MC-1具有良好
的快速生长特性 , 其中碳酸氢钠浓度为 0. 8g L -1
时 , 最大比生长率达到每天 1. 18 , 分裂代时为
14h , 持续培养 1周 , 平均比生长率最高每天可达
0. 49 , 平均分裂代时为 34h(图 1)。碳酸氢钠在较
低浓度范围内 , 随着浓度的增加促进 MC-1生长作
用越明显 , 完全不加碳酸氢钠组的生长率低于不同
浓度的添加组(图 1 , 2)。
51
热 带 海 洋 学 报 第 26 卷　
图 1　不同碳酸氢钠浓度下 MC-1 的生长曲线
C:0、 0. 2 、 0. 4 、 0. 8分别为 0 、 0. 2 、 0. 4和 0. 8g L- 1碳酸氢钠.
Fig. 1　Grow th curve s of M C-1
cultured at different concentr ations of NaH CO 3
图 2　高碱性条件下 MC-1的生长曲线
C:0 、 1 、 8 、 20分别为 0 、 1 、 8和 20g L - 1碳酸氢钠.
F ig. 2　Grow th curv es o f MC-1
cultured under high alkaline conditions
2. 2　MC-1极端适应特性
图 2显示 MC-1在高碱条件下的快速生长特
性 , 在含有 8—20g L - 1碳酸氢钠的高碱培养基
中 , MC-1生长状态良好 , 无论是最大生长率还是
平均生长率均保持较高的水平。经测定 , 在 3—4d
内的进一步培养中 , MC-1培养物的 pH 从 8 左右
迅速升到 12以上 , 并继续生长 , 表现出非同寻常
的极端碱性适应特性 。
2. 3　MC-1细胞的转红及其色素组分变化
室内培养 , 处于静止生长的老化培养物 , 藻细
胞逐渐转红 , 而经室外强光照射 , 指数生长状态的
藻细胞也迅速转红(转红周期见表 2)。图 3 、 4为
绿色和红色细胞色素组分的 HPLC 分析结果 , 并
通过标准样 、保留时间和特征吸收峰以及参考文献
[ 15]鉴别色素组分(表 1)。
52
　第 1 期 向文洲等:一种绿球藻的极端适应特性与虾青素高效诱导
表 1　绿色细胞与红色细胞光合色素组分鉴别
Tab. 1　Pigments in green cells and red cells
峰号 保留时间 最大吸收峰 色素
1 2. 07 477. 8 虾青素*
2 2. 26 473. 0 金盏花黄质*
3 2. 55 446. 4 , 474. 2 叶黄质
4 3. 38 477. 8 角黄质
5 4. 83 468. 1 , 650. 6 叶绿素 B
6 7. 56 431. 9 , 665. 3 叶绿素 A
7 9. 42 477. 8 虾青素酯*
8 10. 93 477. 8 金盏花黄质酯*
9 15. 26 456. 0 , 482. 6 β -胡萝卜素
　　注:*为红色细胞新出现的色素组分。
HPLC结果表明 , 绿色细胞转为红色细胞后 ,
其光合色素组分发生改变 , 出现了虾青素 、 虾青素
酯 、 金盏花黄质以及金盏花黄质酯 4个新组分。由
图 4各组分的光吸收强度可以推断 , 这 4种次生类
胡萝卜素组分占总色素含量的比例较大 。同时 , 室
内缓慢和室外快速 2种状态的转红细胞 , 其光合色
素组分基本一致 。
2. 4　虾青素转化的高效诱导
MC-1在室外强光低盐低碱和强光高盐高碱诱
导下 , 细胞可分别在 6 、 10d(其中有 2 个阴天)的
短时间内转红 , 并快速积累虾青素(表 2)。室内培
养 MC-1转红细胞 , 虾青素含量是 0. 61mg g - 1 ,
总类胡萝卜素含量是 1. 25mg g - 1 , 强光诱导后虾
青素和总类胡萝卜素含量稍有提高 , 强光高盐高碱
诱导后两者含量显著提高(p <0. 05), 分别提高
50. 46%和 71. 20%, 含量达到 0. 93 mg g - 1和
2. 14 mg g - 1 。
表 2　不同诱导条件下MC-1 青素和
总类胡萝卜素含量的变化
Tab. 2　Contents of astaxanthin and total carotenoids
of MC-1 induced under different conditions
诱导条件 老化培养 强光诱导 强光高盐高碱诱导
转红时间 /d 30 10 6
虾青素含量 /mg g - 1 0. 61±0. 0250. 64±0. 010 0. 93±0. 005
类胡萝卜素含量
/mg g - 1 1. 25±0. 0211. 31±0. 127 2. 14±0. 081
　　注:强光为室外太阳光;强光高盐高碱为室外太阳光 , 高盐
为 51g L- 1 NaCl , 高碱为 81g L - 1NaHCO3 。
3　讨　论
3. 1　MC-1的极端适应特性
MC-1具有良好的极端碱性 、渗透胁迫(高盐)
适应特性。碱性的大幅度变动对 MC-1的生长影响
不明显(图 2), 最大适应生长 pH 大于 12 , 并可以
忍耐 130以上的高盐度 , 并能使细胞快速转红 。这
种生理特性在微藻中十分罕见。利用这一特性 , 可
望建立如同盐藻和螺旋藻模式的开放培养系统 , 通
过碳酸氢钠浓度和盐度来调节培养物状态 , 避免其
它生物污染 , 实现低成本的大规模培养[ 10] 。
3. 2　MC-1的次生类胡萝卜素高效诱导及其代谢
途径
寻找快速生长 、极端适应和积累虾青素的藻类
来取代雨生红球藻的研究引起了科研工作者的广泛
重视。 Ip [ 9] 报道了快速生长的小球藻可以混合培
养并可积累大量的虾青素。Zhang 等[ 6] 报道了一种
快速生长 、 适应高 pH 、强光诱导产生大量虾青素
的绿球藻 , 其可适应的最大 pH 只在 10. 0 以下 ,
pH 高于 10. 0 的培养条件将导致细胞很快死亡。
但本实验中 MC-1在室外高盐高碱条件下可高效积
累虾青素等次生类胡萝卜素 , 其转化速度明显快于
已报道的其它绿藻 , 并能维持高比例的游离虾青素
(占总类胡萝卜素的 43%), 显示出独特的应用价
值与理论研究意义 。
MC-1次生类胡萝卜素代谢特别是虾青素的诱
导合成过程较为特殊 , 其它绿藻出现多种虾青素中
间代谢产物 , 如海胆酮 、 3-羟基海胆酮 、 β-隐黄
质 、 Adonirubin 、 金盏花黄质等[ 16 , 17] , 而 MC-1仅
有角黄素和金盏花黄质 , 表明绿球藻可能存在独特
的代谢途径 , 这有待进一步研究 。
MC-1对 pH 和渗透胁迫的极端适应特性 , 不
仅可以建立类似盐藻和螺旋藻的开放式培养系统 ,
在降低生产成本的同时保证生产效率 , 而且可以通
过胁迫条件诱导虾青素的积累 , 提高其产品的商业
价值。目前尚未见报道有这些特性的绿藻 , 因而
MC-1有望成为一种开发前景广阔和研究价值极高
的微藻新资源。
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