全 文 ：　　1河北省医学科学院实验医学研究所生化研究室　石家庄 050021
　　2德国吉森大学生化与内分泌研究所 GIESSEN 35392
第一作者: 李素琴 ,女 , 43岁 ,大学 ,研究员
　
抗哇巴因抗体及抗前海葱苷原 A抗体的制备及其
应用
李素琴 1　符云峰 1　卢振敏 1　朱树森 1　 Wilhelm Schoner2　 Christian Eim2
　　摘　要　为了探索内源性钠泵抑制因子在高血压发生中的作用 ,利用家兔免疫制备了抗哇巴因抗体及抗前海
葱苷原 A抗体 ,并对其特性进行了鉴定。利用该两种抗体和 ELISA法检测了高血压病人血浆及牛血清中哇巴因样
及前海葱苷原 A样钠泵抑制因子水平。检测结果发现原发性高血压病人血浆中存在哇巴因样物质水平 ( 0. 132±
0. 021mo l / L )和前海葱苷原 A样物质水平 ( 0. 102± DF8. 8nmol /L );牛血清中哇巴因样物质的水平 ( 1. 6± 0. 27
nmol /L )明显高于前海葱苷原 A样物质水平 ( 0. 222± 0. 086nmol / L)。证明内源性钠泵抑制因子哇巴因样及前海葱
苷原 A样物质在哺乳类动物血液里循环存在 ,是两种新的强心苷类固醇激素。
关键词　抗哇巴因抗体　抗前海葱苷原 A抗体　钠泵抑制因子　高血压
中图号　 R335. 4　 R57
RAISED AN TIBODIES AGAIN ST THE OUABAIN AND PROSCI-
LLARIDIN A IN RABBITS AND ITS APPLICAT ION
Li Suqin, Fu Yunf eng , Lu Zhenmin, Zhu Shusen , Wilhelm Schoner , Christian Eim
(Department of Biochemistry , Institute of Experimental Medicine, Hebei Academy of Medical Sciences , Shiji-
azhuang 050021)
　　 Abstract　 To know the concentration of the isomer of ouabain substance and proscillaridin A-like substance how
corr elate with hypertension, w e raised antibodies against ouabain and pro scilla ridin A and tested its concentra tion in
the plasma of patients with essential hyper tension and bov ine serum with an indirec t enzyme-linked immunoso rbent as-
say. The results sh ow that in human plasma exist ouabain-like substance ( 0. 132± 0. 021nmol / L) and proscillaridin A-
like substance ( 0. 102± DF8. 8nmol / L) , and that in bovine serum the higher concentration of ouabain imm unoreac-
tivities ( 1. 6± 0. 27nmol / L) than pro scilla ridin A immuno reactiv ities ( 0. 222± 0. 086nmol / L) . We concluded that
bo th concentra tion of th e ouabain immunoreactiv e and pro scillaridin A immuno reactiv e materials circulating in blood
corr elates with the blo od pressure in essential hypertension.
Key words　 Ouabain antibody, Pro scilla ridin A antibody , Sodium pump inhibitor , Hypertension
　
　　 80年代初国外学者报道在哺乳类动物体内存在
一种内源性类洋地黄物质 ( Endogenous digi talis-like
factor, EDLF) ,与地高辛抗体呈免疫反应 ,具有抑
制细胞膜 Na+ -K+ -ATP酶 (钠泵 )活性的作用 ,故称
其为“钠泵抑制因子” ,与血压和心功能调节有关。90
年代初 Hamlyn及其同事证明高血压病人血浆中的
EDLF是一种哇巴因样物质 [1 ] , Haupert等证明牛下
丘脑 EDLF为哇巴因同分异构体 [2 ]。另有学者从心
衰病人血浆中提取纯化得到海蟾蜍毒素 ( Marinob-
ufagenin)
[3 ]
,从高血压病人血浆中检测到前海葱苷
276
免 疫 学 杂 志　第 15卷　第 4期 1999年 10月　　　　　 IMMUNOLOGICAL JOURNAL Vo l 15 No 4 Oc t 1999
DOI : 10. 13431 /j . cnki . i mmunol . j . 19990089
原 A样物质 ( Proscillaridin A-like subs-tance) ,与血
压升高相关 [4 ]。为了进一步探索这两类物质是否同
时在哺乳类动物体内存在 ,本文利用家兔免疫制备
了抗哇巴因抗体及抗前海葱苷原 A抗体 ,并对其进
行了鉴定 ,用 ELISA法利用该两种抗体检测了高血
压病人血浆和牛血清中哇巴因样及前海葱苷原 A
样物质水平 ,现将结果报告如下。
1　材料与方法
1. 1　主要试剂及仪器　哇巴因 ,前海葱苷原 A,
Freund′s完全佐剂等购自美国 Sigma公司 ; HPLC
(日本 HITACH公司 )。
1. 2　抗体制备
1. 2. 1　取定量的前海葱苷原 A(或哇巴因 )与牛血
清白蛋白的联接物 100μg溶于 0. 5 ml生理盐水 ,和
0. 5 ml Freund′s完全佐剂混合 ,在新西兰大白兔的
脊背皮内注射 5～ 6个点 ,以后第 2、 3、 6、 12周再行如
上注射。第 40周自耳静脉取免疫的兔血 ,分离血清备
用。
1. 2. 2　抗体的纯化: 将含于 1mol /L甘氨酸和
0. 5mol /L NaCl ( pH8. 9)溶液内的抗血清球蛋白移
入蛋白质 A HPLC层析柱中 ,用 0. 1mol /L柠檬酸
( pH3. 0)洗脱免疫球蛋白 IgG,以 pH7. 0洗脱液进行
超过滤浓缩 , - 20°C贮存于含 0. 02% NaN3和 50%
甘 油 的 Tris /NaCl 缓 冲 液 ( 50mmol /L Tris,
150mmol /L NaCl, pH7. 8)内。
1. 2. 3　抗体的鉴定: 用 ELISA法分别进行上述两
种抗体与标准物哇巴因及前海葱苷原 A以及其它
同类物质的反应试验。
1. 3　 Na+ -K+ -ATP酶抑制因子的纯化　同参考文
献 [6 ]。将定量的高血压病人血浆或牛血清用乙醇提
取 ( 1 8, v /v ) ,再以 C18 HPLC反相色谱纯化。
1. 4　生物活性鉴定　用 ELISA法测定高血压病人
血浆及牛血清中内源性钠泵抑制因子哇巴因样及前
海葱苷原 A样物质的免疫活性。
2　结果
2. 1　抗前海葱苷原 A抗体　免疫 40周后的兔抗前
海葱苷原 A血清滴度的 kd值为 2× 10- 9mol /L。抗
前海葱苷原 A抗体与前海葱苷原 A发生免疫反应 ,
而不与哇巴因及其它物质发生反应 ,结果见表 1。
表 1　利用家兔免疫制备的抗哇巴因抗体及抗前海葱苷原 A
抗体特异性的比较
Tab 1　 Comparison o f specificities of antibodies against
ouabain and proscillaridin A raised in rabbits
Substances
An ti-Ouabain IgG
from rabbit(% )
Anti-Proscillaridin A IgG
from rabbit(% )
Cardenolides
ouabain 100 0
　 k-st rophanthidin 16. 67 0. 083
　digitox ig enin 3. 95 N. D.
　digitox in 0 0. 46
　dig oxigenin 0. 23 N. D.
　digixig eninsulfa te 10 N. D.
　dig oxigenin-3-g lucuronid 13. 13 N. D.
　dig oxin 0. 19 0
　 g itox in 0. 36 0. 047
　 conva llatox in 200 0. 054
Bufadienolides
pro scilla ridin A 7. 75 100. 0
　 bufalin N. D. 84. 4
　 marinobufagenin N. D. 5. 0
Other steroid hormones
　 co rtiso l N. D. 0
　 estradiol 0 0
　 testosterone N. D. 0. 1
　 progesterone N. D. 0. 125
　 co rticosterone N. D. 0
　 a ldo sterone 0 0
　　 N. D. : none detected
2. 2　利用抗哇巴因抗体和抗前海葱苷原 A抗体和
ELISA法测定高血压病人和牛血清中内源性钠泵
抑制因子所采用的标准曲线　见图 1。
图 1 哇巴因和前海葱苷原 A标准曲线
Fig 1 The concentration-dependence of ouabain and proscil-
laridin A standard curv e
2. 3　高血压病人血浆和牛血清中哇巴因样物质和
前海葱苷原 A样物质的水平　见表 2。
277
　第 4期 李素琴 ,等 .抗哇巴因抗体及抗前海葱苷原 A抗体的制备及其应用
表 2　高血压病人血浆和牛血清中哇巴因样物质和前海葱苷
原 A样物质的水平
Tab 2　 Th e levels o f ouabain and proscillaridin A im munore-
activities in plasma of pa tients with essential hyper-
tension and bovine serum ( x± s)
Species
Ouabain
imm unoreactivity
( noml /L )
Pro scilla ridin A
immunoreactivity
( noml / L)
Human 0. 132± 0. 021(n= 42) 0. 102± DF8. 8( n= 18)
Bov ine 1. 600± 0. 27(n= 18) 0. 222± 0. 086(n= 13)
　　 DF: Geomet ric m ean and dispersion factor
3　讨论
我们以往的研究证实 ,在高血压病人血浆中存
在一种具有强力抑制 Na+ -K+ -A TP酶活性的哇巴
因样内源性钠泵抑制因子 ,其水平高于正常人 [5 ];也
证实在哺乳类动物体内同时存在哇巴因样和前海葱
苷原 A样两种钠泵抑制因子 ,尤以肾上腺和下丘脑
最为丰富 [6 ]。本研究证据表明 ,在高血压病人血浆和
牛血清中同时存在两种钠泵抑制因子哇巴因样和前
海葱苷原 A样物质 ,前者浓度高于后者。该免疫制
备物抗哇巴因抗体与哇巴因发生免疫反应 ,而与前
海葱苷原 A不发生免疫反应 ;抗前海葱苷原 A抗体
与前海葱苷原 A发生免疫反应 ,而与哇巴因几乎不
发生交叉反应 ,表明该两种内源性钠泵抑制因子在
哺乳类动物体内同时独立存在 ,并可能与高血压的
发生和发展有关。这两种抑制因子的生物合成部位
和化学特性 ,以及在高血压发病中的病理生理作用
机制还在进一步研究中。
参考文献
1 Hamlyn JM . Discover y of endogenous ouabain: A new
mammalian hormone. In: Bamberg E, Schoner W . eds.
The Sodium Pump. New York: Steinkopff-Darm stadt,
Springer , 1994. 722
2 Haupert GTJr. Endogenous “ Digitalis ” , physiological
and structura l characterization of a ouabain isomer isola ted
from bovine hypo thalamus. Ther Res, 1995, 16: 51
3 Bag rov AY , Fedodorova OV , Austin-L JL, et al. En-
dogenous marinobufalin-like factor and Na+ -K+ -ATPase
inhibition during volunta ry hypoventila tion. Hyper tenson,
1995, 26: 781
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lates with a proscillaridin A immuno reac tiv e compound.
Hypertension, 1996, 26: 784
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泵抑制因子水平升高的直接证据 .心肺血管学报 , 1990, 9
( 1): 17
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drenals and hypo thalamus a re a ma jor source o f proscilla r-
idin A and ouabain immunoreasctivities. Life Sciences,
1998, 62( 11): 1023
( 1998-12-02收稿 ; 1999-04-19修回 )
(上接第 265页 )
CD8显著降低 ( P < 0. 01) ,已符合结论。因此 ,我们认
为滴度越高感染程度越严重 ,感染时间越长 , T细胞
亚群的变化越明显。
3. 3　 T细胞亚群变化及反复感染的原因分析　病
原体进入机体后 ,能迅速激活人体免疫系统 ,引起免
疫应答 ,包括特异性和非特异性两大类 ,通常整个免
疫应答的过程二者是无法截然分开的 ,其中起重要
作用的是 T细胞 ,作为免疫应答的调节枢扭多由
CD4与 CD8细胞数量及功能相互消长完成 [1 ]。
CD4细胞是辅助性 T细胞 ,能够协助 B细胞分
化抗体 ; CD8细胞是一种抑制性 T细胞 ,能够抑制 B
淋巴细胞活性 ,抑制抗体的合成、分泌及 T细胞的
增殖。两者的稳态维持着机体正常的免疫应答 ,当机
体被梅毒螺旋体感染后 ,随感染的加剧 , CD4细胞降
低 , CD8细胞增高 , CD4 /CD8比值下降 ,导致辅助性功
能下降 ,抑制性功能上升 ,引起梅毒螺旋清除困难 ,
且反复感染出现临床症状。
因此 ,本文认为治疗梅毒病人 ,尤其是反复感
染、病程较长的病人 ,是否可以联合应用增强细胞免
疫的药物 ,以便提高机体免疫 ,增强药物疗效 ,迅速
治愈梅毒病人 ,其免疫疗法的效果有待于进一步的
研究。
参考文献
1 杨锡强 .细胞免疫功能测定的临床意义 .中国实用儿科杂
志 , 1993, 5( 8): 271
( 1999-01-31收稿 ; 1999-05-12修回 )
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第 15卷 免 疫 学 杂 志 1999年 10月