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生物技术通报
BIOTECHNOLOGY BULLETIN 2013年第12期
CDC2基因［1，2］是细胞分裂周期基因的一种，
它编码相对分子质量为 34 kD 的丝氨酸 / 苏氨酸蛋白
激酶（p34cdc2 激酶），此酶与周期蛋白结合后被激
活，并促使细胞进入细胞周期［3，4］，因此又被称为
细胞周期引擎［5］，具有促进细胞生长分裂的作用。
陈长恒［1］报道了 p34cdc2 激酶广泛存在于从酵母到
人的多种生物中，并且具有较高的同源性。现今，
各国学者已将栗酒裂殖酵母作为研究细胞周期调控
和基因表达的模式生物，如 Dai 等［6］研究了在栗酒
裂殖酵母中超表达 SpTrz2p 基因对细胞周期具有明
收稿日期 ： 2013-05-30
基金项目 ：黑龙江省科学院青年创新基金项目（CX2011G01），大庆市科技计划项目（scyh-2011-76）
作者简介 ：刘玉，女，博士研究生，助理研究员，研究方向 ：微藻生物柴油及其基因工程 ；E-mail ：liuyu19830526@qq.com
通讯作者 ：刘宇峰，女，研究员，研究方向 ：应用微生物及其基因工程 ；E-mail ：384751172@qq.com
栗酒裂殖酵母 CDC2基因克隆及淡水舟形藻
表达载体构建
刘玉1 朱万鹏2 王莹莹2 姬妍茹1 张洪升3 邓军3 刘宇峰1
（1. 黑龙江省科学院大庆分院 生物新技术研究所，大庆 163319 ；2. 大连工业大学生物工程学院，大连 116034 ；
3. 大庆应用技术研究院，大庆 163316）
摘 要： 利用试剂盒提取栗酒裂殖酵母的总 DNA，以其为模板进行 PCR克隆 CDC2基因，再将 pBI121载体质粒和 CDC2
基因进行 BamH I和 Sma I双酶切，电泳分离和检测，最后连接目的片段构建重组载体 pBI121-CDC2。克隆得到长度约为 1.2 kb的
CDC2基因片段与 NCBI网站所公开的 CDC2基因序列最大同源性达 98%，所构建载体经酶切和 PCR验证构建成功，并且在淡水舟
形藻中得到表达，表明成功构建栗酒裂殖酵母 CDC2基因的淡水舟形藻表达载体。
关键词： 栗酒裂殖酵母 CDC2基因 克隆 淡水舟形藻 表达载体 构建
Cloning of CDC2 Gene from Schizosaccharomyces pombe and
Construction of Freshwater Navicula Expression Vector
LiuYu1 Zhu Wanpeng2 Wang Yingying2 Ji Yanru1 Zhang Hongsheng3 Deng Jun3 Liu Yufeng1
（1. Daqing Branch of Heilongjiang Academy of Sciences，Daqing 163319；2. School of Bioengineering，Dalian Polytechnic University，
Dalian 116034；3. Daqing Application Technique Institute，Daqing 163316）
Abstract: Total DNA of Schizosaccharomyces pombe was extracted by kit and was used as a template for PCR to clone CDC2 gene. The
plasmid pBI121 and CDC2 gene were double-enzyme digested with BamH I and Sma I, isolated and verified by electrophoresis. At last, the
vector of pBI121-CDC2 was constructed by linking the fragments. The 1.2 kb fragment which was obtained by cloning had 98% base similarity to
the CDC2 gene of the website NCBI. The vector was digested and used for PCR to identify the successful constrction, and it was also expressed in
freshwater Navicula. This showed that the freshwater Navicula expression vector with CDC2 gene was constructed successfully.
Key words: Schizosaccharomyces pombe CDC2 gene Clone Freshwater Navicula Expression vector Construction
显影响 ；付永平等［7］成功完成绿色木霉纤维二糖
cbh Ⅱ基因在栗酒裂殖酵母中的表达。另外，栗酒
裂殖酵母遗传背景清晰，操作方便［8-10］，NCBI 网站
上也公布了栗酒裂殖酵母基因组中 CDC2基因的相
关信息，所以利用分子生物学方法克隆栗酒裂殖酵
母 CDC2基因是完全可行的。
淡水舟形藻［11］是生长在江、湖等淡水水域中
的舟形藻，属于硅藻类，经测定其部分种类含油量
较高。季祥等［12］从内蒙古中西部呼包鄂地区湖泊
中筛选到一株含油量高的淡水舟形藻，并优化其生
2013年第12期 109刘玉等：栗酒裂殖酵母 CDC2基因克隆及淡水舟形藻表达载体构建
长条件，以改善其生长速度为扩大培养奠定基础。
如果将含油量高的淡水舟形藻进行大规模培养可成
为制备微藻生物柴油的良好原料来源，但是由于其
多数具有生长速度相对缓慢的缺点，所以很难利用
其实现微藻生物柴油的产业化生产［13］。近年来，国
内外学者利用基因工程技术在分子水平上对硅藻进
行品种改良均获得了良好的效果。Falciatore 等［14］
成功完成了报告基因GUS在2种底栖硅藻中的转化；
朱葆华等［15］采用基因枪方法成功建立了三角褐指
藻遗传转化体系 ；朱聪聪等［16］采用电穿孔法同样
也成功完成了三角褐指藻叶绿体表达体系的建立，
另外，Apt 等［17］采用微粒轰击法将 sh ble基因转化
底栖三角褐指藻得到稳定的细胞核转化体系。然而
淡水舟形藻属于单细胞藻类植物，所以本研究欲将
CDC2基因片段与植物表达载体 pBI121 质粒进行重
新拼接，构建成为能在淡水舟形藻中表达 CDC2基
因的表达载体，并通过此载体的转化和表达以改善
淡水舟形藻生长速度缓慢的缺点，提高其生长分裂
速度。如果该载体构建成功将为在分子水平上改良
淡水舟形藻品种奠定坚实基础，在利用其实现生物
柴油产业化领域也具有广阔的应用前景。同时在国
内外研究中，关于栗酒裂殖酵母 CDC2基因克隆及
利用植物表达载体 pBI121 构建 CDC2基因淡水舟形
藻表达载体方面的研究还未见报道。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 菌株和质粒 栗酒裂殖酵母（Schizosaccharo-
myces pombe），菌种编号 2.1630，购自中国微生物菌
种保藏管理委员会普通微生物中心 E.coli DH5α，菌
种编号 81023-1，购自宝生物工程（大连）有限公司；
舟形藻（Navicula sp.），藻种编号 FACHB-1226，购
自中科院水生生物研究所淡水藻种库 ；植物表达载
体 pBI121，购自上海希匹吉生物技术有限公司。
1.1.2 引物 根据 NCBI 网站中栗酒裂殖酵母 CDC2
基因序列（GenBank 登录号 ：NC_003423.3）设计
PCR 引物，并根据后续构建植物表达载体 pBI121 的
需要，在引物两端分别加入 BamH I 位点和 Sma I 位
点，由上海生工生物技术服务有限公司合成。其引
物序列如下 ：
CDC2-F ：GCCGGATCCATGGAGAATTATCAAA-
AAGTCG，
CDC2-R ：TTACCCGGGTTAATGAAAATCACGA-
AGATAA。
1.1.3 主要试剂 酵母基因组 DNA 提取试剂盒，购
自北京康为世纪生物科技有限公司。Premix Ex TaqTM
Version 2.0（Loading dye mix），SanPrep 柱式 DNA 胶
回收试剂盒，琼脂糖，EB，限制酶 BamH I，限制
酶 Sma I，T4 DNA 连接酶，buffer，Wide Range DNA
Marker（DL500-15 000），购自宝生物工程（大连）
有限公司。
1.2 方法
1.2.1 栗酒裂殖酵母 CDC2基因的克隆 收集生长
旺盛的栗酒裂殖酵母菌体，按照酵母基因组 DNA 提
取试剂盒所述步骤提取栗酒裂殖酵母的总 DNA。然
后以其为模板，分别以 CDC2-F 和 CDC2-R 为引物
进行 PCR 扩增。 PCR 反应体系 ：DNA 模板 1 μL，
引 物 CDC2-F 1 μL， 引 物 CDC2-R 1 μL，Premix Ex
TaqTM Version 2.0 10 μL，加无菌水补足至 20 μL。
PCR 反应条件 ：94℃预变性 5 min ；94℃ 45 s，55℃
45 s，72℃ 75 s，35 个循环 ；72℃延伸 5 min。
PCR 反应结束后，采用 1% 琼脂糖凝胶检测基
因片段，利用 SanPrep 柱式 DNA 胶回收试剂盒，将
CDC2基因片段进行胶回收，收集回收的 CDC2基因
溶液低温保存，并送至生工生物工程（上海）股份
有限公司北京测序部进行基因序列测定。测定出的
基因序列结果在NCBI的GenBank中利用BLASTX进
行比对，确定获得的序列是否为栗酒裂殖酵母 CDC2
基因片段，并分析所得到的栗酒裂殖酵母 CDC2基
因片段与 NCBI 网站中的已知序列相似性程度。
1.2.2 淡水舟形藻表达载体的构建 分别对 pBI121
载体和 CDC2基因片段进行 BamH I 和 Sma I 双酶切，
双酶切反应体系 ：pBI121 载体或 CDC2基因 20 μL，
限制酶 BamH I 0.5 μL，限制酶 Sma I 0.5 μL，10×
共用酶切缓冲液 5 μL，加无菌水补足至 50 μL。30℃
水浴锅中酶切 3 h，酶切后的产物用琼脂糖凝胶电
泳进行分离和检测，切割载体和基因片段所在的凝
胶分别进行胶回收，然后进行相应的连接反应。连
接反应体系 ：载体片段 2 μL，基因片段 6 μL，buffer
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2013年第12期110
1 μL，T4 DNA 连接酶 1 μL。16℃连接 12-16 h，连
接后产物转化大肠杆菌（E.coli DH5α）感受态细胞，
采用碱法从转化菌落中提取重组载体，分别进行
BamH I 和 Sma I 双酶切和 PCR 验证，并利用电转化
方法将构建好的表达载体导入淡水舟形藻（Navicula
sp.）中，观察生长情况。如有转化后的淡水舟形藻
生长，将其接种至 D1 培养基中并放置于人工气候
箱中培养，利用显微镜和血球计数板计数生长时期
培养液中转化后的淡水舟形藻细胞密度，并以未转
化的淡水舟形藻作对照绘制生长曲线。通过生长曲
线计算出转化后和未转化的淡水舟形藻平均生长速
度，通过比较确定所构建载体在淡水舟形藻中是否
表达，以验证淡水舟形藻表达载体 pBI121-CDC2 的
构建是否成功。
2 结果
2.1 栗酒裂殖酵母CDC2基因克隆
以 提 取 的 栗 酒 裂 殖 酵 母 总 DNA 为 模 板，
CDC2-F 和 CDC2-R 为引物，按照上述 PCR 反应体
系进行扩增，琼脂糖凝胶电泳检测结果如图 1 所示。
图 1 中显示 PCR 扩增产物为长度约 1.2 kb 的基因
片段，与 NCBI 网站中栗酒裂殖酵母 CDC2基因序
列（1 189 bp）长度相符，并利用 BLASTX 与已克隆
并测定的序列进行比对，两个序列的最大同源性为
98%，表明栗酒裂殖酵母 CDC2基因克隆成功。
约 1.2 kb 的片段，与 CDC2基因片段长度一致，表
明重组载体 pBI121-CDC2 构建成功。
在含有卡那霉素的培养基中可观察到有淡水舟
形藻生长，而未转化的淡水舟形藻在含有卡那霉素
的培养基中不生长，说明重组载体 pBI121-CDC2 已
成功转化淡水舟形藻。
培养转化后的淡水舟形藻，绘制生长曲线，并
与未转化的淡水舟形藻生长曲线进行对比，其结
果如图 4 所示，未转化的淡水舟形藻生长期为 24
d，转化后的淡水舟形藻生长期为 15 d，由此计算
出未转化和转化后的平均生长速度分别为 0.16×106
和 0.51×106cell/mL·d，所以转化后淡水舟形藻的
平均生长速度较转化前提高了 2 倍，表明重组载体
pBI121-CDC2 在淡水舟形藻中得到表达。综上所述
M ：DNA Marker DL2 000 ；1 ：PCR 扩增 CDC2 基因片段
图 1 PCR扩增产物电泳图
2.2 淡水舟形藻表达载体构建
将重组载体 pBI121-CDC2 进行 BamH I 和 Sma I
双酶切验证，其电泳结果如图 2 所示，双酶切后得
到两条片段，长度分别约为 11.5 kb 和 1.2 kb，与连
接前两条片段长度一致。再以重组载体为模板进行
PCR 验证，其电泳结果如图 3 所示，扩增得到长度
M ：DNA Marker DL15 000 ；1 ：BamH I 和 Sma I 双酶切所得基因片段
图 2 重组载体 pBI121-CDC2的酶切验证电泳图
M ：DNA Marker DL2 000 ；1 ：PCR 扩增所得基因片段
图 3 重组载体 pBI121-CDC2的 PCR验证电泳图
图 4 未转化和转化后的淡水舟形藻生长曲线对比图
2013年第12期 111刘玉等：栗酒裂殖酵母 CDC2基因克隆及淡水舟形藻表达载体构建
表明，栗酒裂殖酵母 CDC2基因的淡水舟形藻表达
载体 pBI121-CDC2 构建成功。
3 讨论
本研究以试剂盒提取的栗酒裂殖酵母总 DNA 为
模板克隆得到 CDC2基因，并将其与植物表达载体
pBI121 进行重组构建成为表达载体 pBI121-CDC2，
此载体实现了在淡水舟形藻中的表达，可明显提高
淡水舟形藻的生长速度。在以往研究中，大多学者
从人类或动物的基因组中克隆 CDC2基因，由于真
核生物基因序列较长和不表达的重复序列较多，所
以需对其 cDNA 进行克隆，操作比较繁琐。徐波等［18］
采用 RT-PCR 法完成了人 CDC2基因的克隆 ；陶敏
等［19］采用 PCR 和 cDNA 末端快速分离法克隆得到
雌核发育二倍体鲫鲤及其他倍性鱼 CDC2基因 cDNA
全序列。而本研究所用的栗酒裂殖酵母为原核生物，
其 CDC2基因序列较短和不表达的重复序列较少，
所以将其基因组作为模板可直接进行克隆，省去了
反转录等操作，操作过程简单方便。另外，以往研
究硅藻的表达载体构建大多采用几个基因片段的切
割和拼接，包括启动子、终止子、抗性基因、报告
基因和目的基因等，操作复杂，试验耗时长，对于
试验操作也要求具有很高的专业性。王娟飞等［20］
从载体质粒中切下报告基因 GUS，再将目的片段
PPDKiRe 和 PPDKiSe 依次连入载体完成三角褐指藻
PPDK 基因 RNAi 载体的构建 ；郑国庭等［21］克隆了
三角褐指藻内源 fcp 基因簇的多个调控序列（启动
子、终止子），构建了包括 fcpB 启动子 -bar 基因 -fcpA
终止子、以及 fcpA 启动子 -多克隆位点（MCS）-fcpA
终止子两个表达盒的通用转化载体 pfcA-MCS/fcpB-
Bar。而本研究采用植物表达载体 pBI121，其本身就
带有强大的 CaMV35S 启动子和卡那霉素抗性等基
因，可以实现在植物细胞中基因的表达，所以只需
将所克隆的 CDC2基因与 pBI121 质粒进行重组拼接
即可得到重组表达载体，操作简单，耗时短，并且
成功率较高，可以广泛应用于淡水舟形藻的品种改
良，筛选出生长速度较快的淡水舟形藻，为实现淡
水舟形藻生物柴油产业化生产奠定坚实的理论基础。
4 结论
以栗酒裂殖酵母基因组 DNA 为模板，克隆得到
长度约为 1.2 kb 的 CDC2基因片段，其与 NCBI 网站
所公开的 CDC2基因序列最大同源性达 98%，并将
其成功构建淡水舟形藻表达载体 pBI121-CDC2。
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（责任编辑 李楠）