全 文 ：第３３卷第３期
２０１５年６月
上 海 交 通 大 学 学 报 （农 业 科 学 版）
ＪＯＵＲＮＡＬ　ＯＦ　ＳＨＡＮＧＨＡＩ　ＪＩＡＯＴＯＮＧ　ＵＮＩＶＥＲＳＩＴＹ（ＡＧＲＩＣＵＬＴＵＲＡＬ　ＳＣＩＥＮＣＥ）
Ｖｏｌ．３３Ｎｏ．３
　Ｊｕｎ．２０１５
文章编号：１６７１－９９６４（２０１５）０３－００３６－０７　 ＤＯＩ：１０．３９６９／Ｊ．ＩＳＳＮ．１６７１－９９６４．２０１５．０３．００６
收稿日期：２０１４－０８－２９
基金项目：国家自然科学基金（３１３００５８０，３１３７０６９５）；中国博士后科学基金特别资助项目（２０１３Ｔ６０４５１）
作者简介：邹梦雯（１９８９－），女，硕士生，研究方向：园林植物种质资源开发与利用，Ｅ－ｍａｉｌ：ｚｏｕｍｅｎｇｅｎ＠ｈｏｔｍａｉｌ．ｃｏｍ；
申晓辉（１９６２－）为本文通讯作者，女，博士，教授，研究方向：园林植物种质资源开发与利用，Ｅ－ｍａｉｌ：ｓｈｅｎｘｈ６２＠ｓｊｔｕ．ｅｄｕ．ｃｎ；
张　荻（１９８０－）为本文共同通讯作者，男，博士，助研，研究方向：园林植物种质资源开发与利用，Ｅ－ｍａｉｌ：ｚｈａｎｇｄｉ２０１３＠ｓｊｔｕ．ｅｄｕ．ｃｎ
百子莲生长素受体基因ＴＩＲ１的全长
ｃＤＮＡ克隆及功能分析
邹梦雯，岳建华，张　荻，申晓辉
（上海交通大学 农业与生物学院，上海２００２４０）
摘　要：采用ｃＤＮＡ末端快速扩增（ｒａｐｉｄ　ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ　ｏｆ　ｃＤＮＡ　ｅｎｄｓ，ＲＡＣＥ）方法获得百子莲生
长素受体ＴＩＲ１基因ｃＤＮＡ全长序列，对该序列进行生物信息学分析的结果显示，ＴＩＲ１基因的
ｍＲＮＡ序列全长为２　２３５ｂｐ；５’非编码区２９６ｂｐ，３’非编码区１７２ｂｐ；该基因的ＯＲＦ全长为１　７６４
ｂｐ，编码一个含有５８８个氨基酸的蛋白。百子莲ＴＩＲ１推导蛋白序列与葡萄（Ｖｉｔｉｓ　ｖｉｎｉｆｅｒａ）、二穗
短柄草（Ｂｒａｃｈｙｐｏｄｉｕｍ　ｄｉｓｔａｃｈｙｏｎ）、高粱（Ｓｏｒｇｈｕｍ　ｂｉｃｏｌｏｒ），玉米（Ｚｅａ　ｍａｙｓ）等植物均具有较高
的同源性，同源性最高的是葡萄，可达７８％。系统进化树表明，百子莲与葡萄距离最近。由α－螺
旋，随机卷曲和延伸链组成一个磁状结构，为亲水蛋白，疏水性值为－０．０９２，在百子莲体细胞胚胎
发生过程中，实时荧光定量ＰＣＲ结果表明ＴＩＲ１基因表达量在愈伤组织中含量最低，在胚性愈伤
组织和体细胞胚胎中含量均有所升高，而在体胚幼苗中表达量最高，表明该基因介导的生长素信号
在体细胞胚胎发生过程中发挥着非常重要的作用。
关键词：百子莲；生长素受体基因；ＴＩＲ１；克隆；基因表达
中图分类号：Ｓ６８２．３２　　　　文献标识码：Ａ
Ｃｌｏｎｉｎｇ　ａｎｄ　Ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ　Ａｎａｌｙｓｉｓ　ｏｆ　Ｆｕｌ－Ｌｅｎｇｔｈ　ｃＤＮＡ　ｏｆ　ｔｈｅ　Ａｕｘｉｎ
Ｒｅｃｅｐｔｏｒ　Ｇｅｎｅ　ＴＩＲ１ｆｒｏｍ　Ａｇａｐａｎｔｈｕｓ　ｐｒａｅｃｏｘ　ｓｓｐ．ｏｒｉｅｎｔａｌｉｓ
ＺＯＵ　Ｍｅｎｇ－ｗｅｎ，ＹＵＥ　Ｊｉａｎ－ｈｕａ，ＺＨＡＮＧ　Ｄｉ，ＳＨＥＮ　Ｘｉａｏ－ｈｕｉ
（Ｓｃｈｏｏｌ　ｏｆ　Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒｅ　ａｎｄ　Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｓｈａｎｇｈａｉ　Ｊｉａｏｔｏｎｇ　Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｓｈａｎｇｈａｉ　２００２４０，Ｃｈｉｎａ）
Ａｂｓｔｒａｃｔ：Ｔｈｅ　ＲＮＡ　ｗａｓ　ｅｘｔｒａｃｔｅｄ　ｆｒｏｍ　ｙｏｕｎｇ　ｌｅａｖｅｓ　ｏｆ　Ａｇａｐａｎｔｈｕｓ　ｐｒａｅｃｏｘ　ｓｓｐ．ｏｒｉｅｎｔａｌｉｓ　ａｎｄ　ｔｈｅ　ｆｕｌ
ｌｅｎｇｔｈ　ｓｅｑｕｅｎｃｅ　ｏｆ　ＴＩＲ１ｃＤＮＡ　ｗａｓ　ｃｌｏｎｅｄ　ｂｙ　ＲＡＣＥ　ｔｅｃｈｎｉｑｕｅ．Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ　ａｎａｌｙｓｉｓ　ｓｈｏｗｅｄ　ｔｈａｔ　ｔｈｅ
ｆｕｌ　ｌｅｎｇｔｈ　ｍＲＮＡ　ｗａｓ　２　２３５ｂｐ，ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ　２９６ｂｐ　ｏｆ　５’ｕｎｔｒａｎｓｌａｔｅｄ　ｒｅｇｉｏｎ　ａｎｄ　１７２ｂｐ　ｏｆ　３’ｕｎｔｒａｎｓｌａｔｅｄ
ｒｅｇｉｏｎ．Ｉｔ　ｈａｄ　ａｎ　ｏｐｅｎ　ｒｅａｄｉｎｇ　ｆｒａｍｅ（ＯＲＦ）ｏｆ　１　７６４ｂｐ，ｅｎｃｏｄｉｎｇ　ａｐｒｏｔｅｉｎ　ｏｆ　５８８ａｍｉｎｏ　ａｃｉｄｓ．Ｔｈｅ　ｄｅｄｕｃｅｄ
ｐｒｏｔｅｉｎ　ｓｅｑｕｅｎｃｅ　ｗａｓ　ｈｉｇｈｌｙ　ｈｏｍｏｌｏｇｏｕｓ　ｗｉｔｈ　ｓｏｍｅ　ｐｌａｎｔ　ｓｐｅｃｉｅｓ，ｓｕｃｈ　ａｓ　Ｖｉｔｉｓ　ｖｉｎｉｆｅｒａ，Ｂｒａｃｈｙｐｏｄｉｕｍ
ｄｉｓｔａｃｈｙｏｎ，Ｓｏｒｇｈｕｍ　ｂｉｃｏｌｏｒ　ａｎｄ　Ｚｅａ　ｍａｙｓ．Ｔｈｅ　ｈｉｇｈｅｓｔ　ｈｏｍｏｌｏｇｙ　ｏｆ　ｗａｓ　Ｖ．ｖｉｎｉｆｅｒａ　ｗｈｉｃｈ　ｒｅａｃｈｅｄ　７８％．
Ｐｈｙｌｏｇｅｎｅｔｉｃ　ｔｒｅｅ　ｒｅｖｅａｌｅｄ　ｔｈａｔ　ｔｈｅ　ｅｖｏｌｕｔｉｏｎａｒｙ　ｄｉｓｔａｎｃｅ　ｂｅｔｗｅｅｎ　Ａ．ｐｒａｅｃｏｘ　ｓｓｐ．ｏｒｉｅｎｔａｌｉｓ　ａｎｄ　Ｖ．
ｖｉｎｉｆｅｒａ　ｗａｓ　ｔｈｅ　ｎｅａｒｅｓｔ．Ｔｈｅ　ｒｅａｌ－ｔｉｍｅ　ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ　ＰＣＲ　ｒｅｓｕｌｔｓ　ｓｈｏｗｅｄ　ｔｈａｔ　ｔｈｅ　ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ　ｏｆ　ＴＩＲ１ｉｎ
ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ　ｓｔａｇｅｓ　ｏｆ　ｔｈｅ　ｓｏｍａｔｉｃ　ｅｍｂｒｙｏｇｅｎｅｓｉｓ　ｗａｓ　ｔｏｔａｌｙ　ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ．Ｔｈｅ　ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ　ｌｅｖｅｌ　ｉｎ　ｃａｌｕｓ　ｗａｓ　ｔｈｅ
第３期 邹梦雯，等：百子莲生长素受体基因ＴＩＲ１的全长ｃＤＮＡ克隆及功能分析
ｌｏｗｅｓｔ　ａｎｄ　ｃｏｎｔｉｎｕｏｕｓｌｙ　ｅｌｅｖａｔｅｄ　ｉｎ　ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ　ｃａｌｕｓ　ａｎｄ　ｓｏｍａｔｉｃ　ｅｍｂｒｙｏｓ，ｗｈｉｌｅ　ｔｈｅ　ｈｉｇｈｅｓｔ　ｉｎ　ｓｏｍａｔｉｃ
ｓｅｅｄｌｉｎｇｓ，ｗｈｉｃｈ　ｉｎｄｉｃａｔｅｄ　ｔｈａｔ　ＴＩＲ１ｐｅｒｈａｐｓ　ｐｌａｙｅｄ　ａ　ｃｒｕｃｉａｌ　ｒｏｌｅ　ｉｎ　ｓｏｍａｔｉｃ　ｅｍｂｒｙｏｇｅｎｅｓｉｓ　ｏｆ　Ａ．ｐｒａｅｃｏｘ
ｓｓｐ．ｏｒｉｅｎｔａｌｉｓ．
Ｋｅｙ　ｗｏｒｄｓ：Ａｇａｐａｎｔｈｕｓ　ｐｒａｅｃｏｘｓｓｐ．ｏｒｉｅｎｔａｌｉｓ；ＴＩＲ１；ａｕｘｉｎ　ｒｅｃｅｐｔｏｒ　ｇｅｎｅ；ｃｌｏｎｉｎｇ；ｇｅｎｅ　ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ
　　生长素是最早被发现的一类植物激素，广泛地
参与植物的生长和发育［１］，如维管组织形成、根伸
长、不定根的形成、顶端优势、根系向地性和向光性；
它也能促进开花和胚胎发生［２］。生长素受体的研究
是生长素作用机理研究中最为重要的一个环节［３］。
２００５年，Ｌｅｙｓｅｒ与Ｅｓｔｅｌｅ两个研究团队共同发现
转运抑制响应蛋白（ｔｒａｎｓｐｏｒｔ　ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ　ｒｅｓｐｏｎｓｅ　１，
ＴＩＲ１）是生长素受体［４，５］，外源生长素与生长素受体
结合是生长素信号转导过程的第一步，也是调控植
物生长发育的关键一步［６，７］。植物体内的生长素活
性物质能够与植物生长素受体 ＴＩＲ１／ＡＦＢ（ａｕｘｉｎ－
ｓｉｇｎａｌｉｎｇ　Ｆ－Ｂｏｘ　ｐｒｏｔｅｉｎ）家族蛋白相互作用介导生
长素 的 信 号 转 导 过 程，并 通 过 泛 素 连 接 酶
ＳＣＦＴＩＲ１／ＡＦＢ降解转录抑制子 Ａｕｘ／ＩＡＡ，从而激活生
长素响应因子（ａｕｘｉｎ　ｒｅｓｐｏｎｓｅ　ｆａｃｔｏｒ，ＡＲＦ）调控下
游基因的表达［８，９］，进而调控植物的生长发育过程。
百子莲（Ａｇａｐａｎｔｈｕｓ　ｐｒａｅｃｏｘ　ｓｓｐ．ｏｒｉｅｎｔａｌｉｓ）
为百子莲科百子莲属多年生草本，原产于南非。因
其花期长，花形秀丽，花色别致，自２００２年引种上海
后，现已成为该地区园林绿化的新宠，示范应用于地
被和花境、鲜切花及盆花生产中。张荻等人研究发
现外源激素通过调控内源生长素ＩＡＡ，在百子莲花
芽分化和花器官分化与发育过程中发挥决定性的作
用［１０，１１］。范现丽和 Ｗａｎｇ等以百子莲幼胚、花梗、
茎段和叶片为外植体，在含有０．５～２．０ｍｇ／Ｌ外源
生长素类物质毒莠定（ｐｉｃｌｏｒａｍ，ＰＩＣ）的 ＭＳ培养基
上诱导胚性愈伤组织［１２，１３］，建立了百子莲体细胞胚
胎发生（ｓｏｍａｔｉｃ　ｅｍｂｒｙｏｇｅｎｅｓｉｓ，ＳＥ）体系。但实验
室在长期继代中发现培养基中不同浓度的ＰＩＣ会
引起胚性细胞形态发生较大变化［１３］，当ＰＩＣ浓度为
１．５ｍｇ／Ｌ时细胞状态最好，浓度升高或降低都会引
起不同程度的胚性丧失（图１），这一实验体系有助
于从生长素受体角度在分子水平上揭示生长素类物
质对百子莲愈伤组织的胚性获得和保持的调控
作用。
目前关于外源生长素类物质调控百子莲体细胞
胚胎发生的机制仍不清楚。因此，本研究拟从百子
莲实生幼苗中克隆出ＴＩＲ１基因的全长ｃＤＮＡ，并
运用生物信息学分析方法对该序列所编码蛋白质的
性质、结构和功能进行预测和分析，为进一步研究生
长素类物质在百子莲生长发育以及体胚发生的调控
机制奠定基础。
１　材料与方法
１．１　植物材料
供试材料为本实验室长期继代的百子莲愈伤组
织、胚性愈伤组织、体细胞胚和体胚幼苗，２０１３年５
月８日选取实验所需材料保存于－８０℃冰箱用于
总ＲＮＡ的提取。
１．２　实验药品与试剂
Ｔｒｉｚｏｌ试剂购于Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ公司；ＳＭＡＲＴｅｒ　ＴＭ
ＲＡＣＥ　ｃＤＮＡ　Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ　Ｋｉｔ购于 Ｃｌｏｎｔｅｃｈ公
司；ＥＸ　Ｔａｑ　ｅｎｚｙｍｅ，ＬＡ　Ｔａｑ　ｅｎｚｙｍｅ，Ｐｒｉｍｅ　Ｓｃｒｉｐｔ
Ｒｅｖｅｒｓｅ　 Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ， Ｏｌｉｇｏ　 ｄＴ１８， ＲＮａｓｅ
ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ，ＤＮａｓｅＩ，ｄＮＴＰ，ＤＬ２０００ＤＮＡ　Ｍａｒｋｅｒ，
ｐＭＤ　１８－Ｔ　ｖｅｃｔｏｒ等购于ＴａＫａＲａ公司；ＤＨ５－α感
受态细胞购于Ｔｉａｎｇｅｎ公司；ＳａｎＰｒｅｐ柱式ＤＮＡ胶
回收试剂盒购于上海生工生物工程有限公司；引物
合成和测序分别由生工生物工程（上海）有限公司和
上海英骏（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）生物技术有限公司完成。
１．３　ＴＩＲ１基因克隆
参照张荻修改的 Ｔｒｉｚｏｌ法提取与纯化植物总
ＲＮＡ［１４］，应用ＯｌｉｇｏｔｅｘＴＭ－ｄＴ３０＜Ｓｕｐｅｒ＞ｍＲＮＡ
Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ　Ｋｉｔ（Ｔａｋａｒａ）操作说明建立 ｍＲＮＡ富
集 纯 化。 按 照 ＳＭＡＲＴｅｒ　ＴＭ　ＲＡＣＥ　ｃＤＮＡ
Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ　Ｋｉｔ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）用户手册进行操作，
构建５’－ＲＡＣＥ与３’－ＲＡＣＥ　ｃＤＮＡ文库。根据百
子莲转录组测序获得的ＴＩＲ１ＥＳＴ序列为参考设
计特异性引物（ＴＩＲ１ｓｅｎｓｅ，ＴＩＲ１ａｎｔｉｓｅｎｓｅ），进行
ＰＣＲ扩增验证转录组测序获得的ＴＩＲ１基因拼接
序列的准确性。根据 ＴＩＲ１ 核心序列设计 ３’－
ＲＡＣＥ（３’－ＧＳＰ１和３’－ＧＳＰ２）与５’－ＲＡＣＥ （５’－
ＧＳＰ１和５’－ＧＳＰ２）特异性引物（表１）扩增基因序列
全长。
７３
上 海 交 通 大 学 学 报 （农 业 科 学 版） 第３３卷
图１　不同浓度ＰＩＣ诱导的百子莲愈伤组织及胚性愈伤组织细胞形态差异
ａ：百子莲愈伤组织；ｂ～ｄ：不同浓度ＰＩＣ继代培养的胚性愈伤组织；ｂ：１．０ｍｇ／Ｌ　ＰＩＣ；ｃ：１．５ｍｇ／Ｌ　ＰＩＣ；ｄ：２．０ｍｇ／Ｌ　ＰＩＣ
Ｆｉｇ．１　Ｍｏｒｐｈｏｌｏｇｙ　ｄｉｆｆｅｒｅｎｃｅｓ　ｏｆ　ｃａｌｕｓ　ａｎｄ　ｅｍｂｒｙｏｇｅｎｉｃ　ｃａｌｕｓ　ｉｎ　Ａｇａｐａｎｔｈｕｓ　ｐｒａｅｃｏｘｓｓｐ．ｏｒｉｅｎｔａｌｉｓ　ｉｎｄｕｃｅｄ
ｂｙ　ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ　ｌｅｖｅｌｓ　ｏｆ　ｅｘｏｇｅｎｏｕｓ　ＰＩＣ
ａ：ｃａｌｕｓ；ｂ－ｄ：ＥＣ　ｓｕｂｃｕｌｔｕｒｅｄ　ｉｎ　ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ　ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎｓ　ｏｆ　ＰＩＣ；ｂ：１．０ｍｇ／Ｌ　ＰＩＣ；ｃ：１．５ｍｇ／Ｌ　ＰＩＣ；ｄ：２．０ｍｇ／Ｌ　ＰＩＣ
表１　ＴＩＲ１基因扩增引物序列
Ｔａｂ．１　Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ　ｏｆ　ｐｒｉｍｅｒｓ　ｆｏｒ　ＴＩＲ１ＰＣＲ
引物
Ｐｒｉｍｅｒｓ
碱基序列（５’－３’）
Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ
熔解温度／℃
ＴＭ　ｖａｌｕｅ
ＵＰＭ （１０Ｘ）
Ｌｏｎｇ／（０．４μｍｏｌ·Ｌ－１）
ＣＴＡＡＴＡＣＧＡＣＴＣＡＣＴＡＴＡＧＧＧＣＡＡ
ＧＣＡＧＴＧＧＴＡＴＣＡＡＣＧＣＡＧＡＧＴ ７０．３
Ｓｈｏｒｔ／（２μｍｏｌ·Ｌ－１） ＣＴＡＡＴＡＣＧＡＣＴＣＡＣＴＡＴＡＧＧＧＣ　 ５８．２
ＮＵＰ（１０μｍｏｌ·Ｌ－１） ＡＡＧＣＡＧＴＧＧＴＡＴＣＡＡＣＧＣＡＧＡＧＴ　 ６０．２
３’－ＧＳＰ１／（１０μｍｏｌ·Ｌ－１） ＴＧＴＣＣＴＣＴＴＣＴＴＣＧＣＣＧＣＣＴＴＴＧＧＧＴ　 ６６．７
３’－ＧＳＰ２／（１０μｍｏｌ·Ｌ－１） ＣＡＡＣＧＣＣＴＴＧＣＴＧＴＴＴＣＧＧＧＴＣＴＡＴＴ　 ６３．６
５’－ＧＳＰ１／（１０μｍｏｌ·Ｌ－１） ＡＴＣＣＡＴＴＧＧＣＴＣＧＴＴＧＧＴＧＡＧＧＴＡＧＴＣＧ　 ６６．４
５’－ＧＳＰ２／（１０μｍｏｌ·Ｌ－１） ＣＣＴＴＧＣＡＴＡＣＣＡＡＡＧＡＣＡＣＧＧＣＧＣＴＡ　 ６６．６
ＴＩＲ１ｓｅｎｓｅ　 ＡＴＧＧＧＣＡＡＴＣＣＣＴＡＡＴＣＴ　 ５２．７
ＴＩＲ１ａｎｔｉｓｅｎｓｅ　 ＣＴＣＧＴＧＣＴＴＴＣＣＣＴＧＡＴＧ　 ５７．３
ＴＩＲ１－Ｆ　 ＧＡＴＴＧＴＧＧＣＧＡＧＧＴＧＴＡＧ　 ５７．３
ＴＩＲ１－Ｒ　 ＡＧＣＧＴＧＴＴＣＡＧＧＴＴＣＴＴＧ　 ５５
Ａｃｔｉｎ－Ｆ　 ＣＡＧＴＧＴＣＴＧＧＡＴＴＧＧＡＧＧ　 ５３
Ａｃｔｉｎ－Ｒ　 ＴＡＧＡＡＧＣＡＣＴＴＣＣＴＧＴＧ　 ５３
　　按照ＴａＲａＫａ公司的ｐＭＤ　１８－Ｔ　ｖｅｃｔｏｒ使用说
明对回收片段进行转化和克隆，将阳性克隆子送至
上海Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ生物公司完成测序。
１．４　生物信息学分析
应用ＣｌｕｓｔａｌＸ（１．８３）对测序获得的序列进行基
因全长拼接。基因开放阅读框通过 ＮＣＢＩ网站
（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｇｏｒｆ／ｏｒｆｉｇ．ｃｇｉ）
在线软件ＯＲＦ　Ｆｉｎｄｅｒ查询确定。蛋白质的基本性
质分析及三级结构预测通过ＳＯＰＭＡ与Ｉ－ＴＡＳＳＥＲ
在线 软 件 （ｈｔｔｐ：／／ｚｈａｎｇｌａｂ．ｃｃｍｂ．ｍｅｄ．ｕｍｉｃｈ．
ｅｄｕ／Ｉ－ＴＡＳＳＥＲ／）进行分析。蛋白３Ｄ 结构应用
ＰｙＭｏｌ软件进行绘制。蛋白的疏水性由ＰｒｏｔＰａｒａｍ
软件分析（ｈｔｔｐ：／／ｗｅｂ．ｅｘｐａｓｙ．ｏｒｇ／ｐｒｏｔｐａｒａｍ／），
蛋白间互作关系应用ＳＴＲＩＮＧ软件分析（ｈｔｔｐ：／／
８３
第３期 邹梦雯，等：百子莲生长素受体基因ＴＩＲ１的全长ｃＤＮＡ克隆及功能分析
ｓｔｒｉｎｇ－ｄｂ．ｏｒｇ／）。应用ＢｌａｓｔＸ进行氨基酸序列比
对，使用 ＭＥＧＡ　５软件完成系统发生树的构建。
１．５　实时荧光定量ＰＣＲ
以百子莲体胚发生过程中愈伤组织、胚性愈伤
组织、体细胞胚胎和体胚幼苗为材料通过ＴＲＩＺＯＬ
法提取总ＲＮＡ，ＲＮａｓｅ　ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ和ＤＮａｓｅＩ纯化后
反转录为ｃＤＮＡ模板并建立ｃＤＮＡ文库。通过实
时荧光定量ＰＣＲ（ｑＲＴ－ＰＣＲ）方法分析ＴＩＲ１在４
个阶段的表达情况。使用Ｂｅａｃｏｎ　Ｄｅｓｉｇｎ　７软件设
计ｑＲＴ－ＰＣＲ引物ＴＩＲ１－Ｆ和ＴＩＲ１－Ｒ（表１）。利用
ＦＴＣ－３０００ＴＭＳＹＳＴＥＭ 实时荧光定量ＰＣＲ仪进行
荧光定量ＰＣＲ反应，反应体系为：ＳＹＢＲ　Ｐｒｅｍｉｘ　Ｅｘ
ＴａｑⅡ （２Ｘ）１０μＬ、ｐｒｉｍｅｒ（１０μｍｏｌ／Ｌ）各０．５μＬ、
ｃＤＮＡ　２．０μＬ，ＲＮａｓｅ－ｆｒｅｅ　Ｈ２Ｏ定容至２０μＬ。反
应程序设置９４℃预变性６０ｓ；９４℃变性１０ｓ，５３℃
退火１５ｓ，７２℃延伸２５ｓ，共４０个循环。反应完成
后计算平均值和标准差，采用２－ΔΔＣｔ法进行数据分
析，所用百子莲内参基因为Ａｃｔｉｎ（表１），片段大小
为１１７ｂｐ。所有样品重复３次。
２　结果与分析
２．１　百子莲ＴＩＲ１基因全长序列的获得及分析
据百子莲转录组测序获得的ＴＩＲ１基因序列为
参考设计特异性引物。通过３’－ＲＡＣＥ第１轮ＰＣＲ
获得１条大小接近１　１００ｂｐ（图２Ａ）的条带，经第２
轮巢式ＰＣＲ获得６００ｂｐ大小的单一条带（图２Ｂ），
测序得到长度为５８６ｂｐ。５’－ＲＡＣＥ第１轮扩增产
物位于１　７００ｂｐ（图２Ｃ），第２轮巢式ＰＣＲ扩增条
带近于５００ｂｐ（图２Ｄ），测序结果为４３８ｂｐ。将３’－
ＲＡＣＥ序列、核心序列和５’－ＲＡＣＥ测序获得的序
列进行比对拼接得到２　２３５ｂｐ的百子莲ＴＩＲ１全长
ｃＤＮＡ序列，５’非编码区２９６ｂｐ，３’非编码区１７２
ｂｐ；起 始 密 码 子 位 于 ２９７ｎｔ，终 止 密 码 子 位 于
２０６１ｎｔ。将此序列提交到 ＮＣＢＩ的 ＯＲＦ　Ｆｉｎｄｅｒ网
页分析表明该基因的ＣＤＳ－ＯＲＦ全长为１　７６４ｂｐ，
编码一个含５８８个氨基酸的蛋白，其相对分子质量
为６５．８ｋＤａ，等电点（ｐＩ）５．８３（图３）。
图２　百子莲ＴＩＲ１基因ＲＡＣＥ扩增产物电泳检测图谱
Ａ：ＴＩＲ１基因３’－ＲＡＣＥ第１轮扩增；Ｂ：ＴＩＲ１基因３’－ＲＡＣＥ第２轮扩增；Ｃ：ＴＩＲ１基因５’－ＲＡＣＥ第１轮扩增；Ｄ：ＴＩＲ１基因５’－ＲＡＣＥ
第２轮扩增；Ｍ：ＤＬ２０００ＤＮＡ　Ｍａｒｋｅｒ
Ｆｉｇ．２　Ａｇｒｏｓｅ　ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ　ｏｆ　ＴＩＲ１ＲＴ－ＰＣＲ　ａｎｄ　ＲＡＣＥ　ｐｒｏｄｕｃｔｓ　ｉｎ　Ａ．ｐｒａｅｃｏｘｓｓｐ．ｏｒｉｅｎｔａｌｉｓ
Ａ：Ｔｈｅ　ｆｉｒｓｔ　ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ　ｏｆ　ＴＩＲ１　３’－ＲＡＣＥ；Ｂ：Ｔｈｅ　ｓｅｃｏｎｄ　ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ　ｏｆ　ＴＩＲ１　３’－ＲＡＣＥ；Ｃ：Ｔｈｅ　ｆｉｒｓｔ　ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ　ｏｆ　ＴＩＲ１　５’－
ＲＡＣＥ；Ｄ：Ｔｈｅ　ｓｅｃｏｎｄ　ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ　ｏｆ　ＴＩＲ１　５’－ＲＡＣＥ；Ｍ：ＤＬ２０００ＤＮＡ　Ｍａｒｋｅｒ
２．２　ＴＩＲ１基因的蛋白结构与序列分析
应用ＳＯＰＭＡ软件对ＴＩＲ１蛋白的氨基酸二级
结构进行了分析，结果表明ＴＩＲ１蛋白由５３．２３％的
α－螺旋（ａｌｐｈａ　ｈｅｌｉｘ），３１．８％的随机卷曲（ｒａｎｄｏｍ
ｃｏｉｌ），１２．０７％的延伸链（ｅｘｔｅｎｄｅｄ　ｓｔｒａｎｄ）和２．８９％
的β－转角（ｂｅｔａ　ｔｕｒｎ）组成，且均匀分布于蛋白质序
列中，其中α－螺旋与随机卷曲所占比重较大。
应用Ｉ－ＴＡＳＳＥＲ软件对蛋白的三级结构分析
也证明ＴＩＲ１蛋白具有较多的α－螺旋结构（图４Ａ），
且α－螺旋、延伸链和随机卷曲在空间上形成一个碗
状结构，可以与ＩＡＡ分子进行结合（图４Ａ、Ｂ）。通
过ＰｒｏｔＰａｒａｍ软件分析后表明ＴＩＲ１蛋白是１个亲
水 蛋 白， 其 疏 水 性 （ｇｒａｎｄ　ａｖｅｒａｇｅ　ｏｆ
ｈｙｄｒｏｐａｔｈｉｃｉｔｙ，ＧＲＡＶＹ）值为 !０．０９２。目前 ＴＩＲ１
蛋白在拟南芥生长素信号转导通路中的作用机制研
究比较明确，通过ＳＴＲＩＮＧ软件分析表明共有９个
蛋白与ＴＩＲ１蛋白具有明确的互作关系，分别为：
ＳＫＰ１（ｓｐｈａｓｅ　ｋｉｎａｓｅ－ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ　ｐｒｏｔｅｉｎ　１），ＩＡＡ７
（ｉｎｄｏｌｅ－３－ａｃｅｔｉｃ　ａｃｉｄ　７），ＡＸＲ３（ａｕｘｉｎ　ｒｅｓｉｓｔａｎｔ　３），
ＡＸＲ６（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ　ｔｈａｌｉａｎａ　Ｃｕｌｉｎ　１，ＡＴＣＵＬ１），
ＡＳＫ１（ＳＮＦ１－ｒｅｌａｔｅｄ　ｐｒｏｔｅｉｎ　ｋｉｎａｓｅ　２．４，ＳＮＲＫ２．
４），ＳＨＹ２ （ｓｈｏｒｔ　ｈｙｐｏｃｏｔｙｌ　２），ＩＡＡ９ （ｉｎｄｏｌｅ－３－
９３
上 海 交 通 大 学 学 报 （农 业 科 学 版） 第３３卷
ａｃｅｔｉｃ　ａｃｉｄ　ｉｎｄｕｃｉｂｌｅ　９），ＳＫＰ１Ｂ （Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ
ＳＫＰ１－Ｌｌｋｅ　２，ＡＳＫ２），ＩＡＡ１ （ｉｎｄｏｌｅ－３－ａｃｅｔｉｃ　ａｃｉｄ
ｉｎｄｕｃｉｂｌｅ）与ＳＧＴ１Ｂ（图４Ｃ）。
将克隆得到的ＴＩＲ１基因ＣＤＳ序列及编码的
蛋白与ＮＣＢＩ数据库中其他物种ＴＩＲ１序列进行比
对分析。结果表明百子莲 ＴＩＲ１推导蛋白序列与
其他植物物种具有较高的同源性，同源性最高的
是 葡 萄 （Ｖｉｔｉｓ　ｖｉｎｉｆｅｒａ，ＸＭ ＿００２２７１３７６ ｉｎ
Ｇｅｎｅｂａｎｋ），其同源性可达７８％，与其他物种的序
列同源性也在５０％以上（图５Ａ）。为了研究ＴＩＲ１
蛋白与其他植物ＴＩＲ１分子进化关系，利用 ＭＥＧＡ
５软件构建了百子莲ＴＩＲ１蛋白与其他１１种ＴＩＲ１
蛋白已知序列物种的系统进化树。结果表明，百
子莲ＴＩＲ１蛋白最早与葡萄聚合为一组，说明它们
具有较近的亲缘关系；而与其他植物进化关系相
对较远（图５Ｂ）。
图３　百子莲ＴＩＲ１基因编码序列及推导蛋白的氨基酸序列
Ｆｉｇ．３　Ｃｏｄｉｎｇ　ｓｅｑｕｅｎｃｅ　ａｎｄ　ｄｅｄｕｃｅｄ　ａｍｉｎｏ　ａｃｉｄ　ｓｅｑｕｅｎｃｅ　ｏｆ
ＴＩＲ１ｇｅｎｅ　ｉｎ　Ａ．ｐｒａｅｃｏｘｓｓｐ．ｏｒｉｅｎｔａｌｉｓ
图４　百子莲ＴＩＲ１蛋白三级结构预测和互作网络
Ａ：预测的ＴＩＲ１蛋白三维结构；Ｂ：ＴＩＲ１蛋白与ＩＡＡ结合的三维结构图 （白色箭头：ＩＡＡ）；Ｃ：ＴＩＲ１蛋白互作网络
Ｆｉｇ．４　Ｐｒｅｄｉｃｔｉｏｎ　ＴＩＲ１ｐｒｏｔｅｉｎ　ｔｅｒｔｉａｒｙ　ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ　ａｎｄ　ｐｒｏｔｅｉｎ－ｐｒｏｔｅｉｎ　ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎ　ｎｅｔｗｏｒｋ　ｉｎ　Ａ．ｐｒａｅｃｏｘｓｓｐ．ｏｒｉｅｎｔａｌｉｓ
Ａ：Ｐｒｏｔｅｉｎ　ｔｈｒｅｅ－ｄｉｍｅｎｓｉｏｎａｌ　ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ　ｏｆ　ＴＩＲ１；Ｂ：Ｔｈｅ　３Ｄｓｔｒｕｃｔｕｒｅ　ｏｆ　ＴＩＲ１ｐｒｏｔｅｉｎ　ｂｉｎｄｉｎｇ　ｔｏ　ＩＡＡ；Ｃ：ＴＩＲ１ｐｒｏｔｅｉｎ－
ｐｒｏｔｅｉｎ　ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎ　ｎｅｔｗｏｒｋ
２．３　百子莲ＴＩＲ１基因在体细胞胚胎发生过程中
的表达分析
分别取百子莲体胚发生过程中愈伤组织、胚性
愈伤组织、体细胞胚和体培苗进行ＴＩＲ１基因的实
时荧光定量分析，如图６所示：ＴＩＲ１基因表达量在
百子莲愈伤组织中最低，胚性愈伤组织中则上升２．
２７倍，在体细胞胚中表达量上升１．８４倍，而在体胚
幼苗中ＴＩＲ１表达量最高，为愈伤组织的７．３２倍，
表明该基因在分化能力强的细胞中发挥重要作用。
３　讨论
自ＴＩＲ１被确认为生长素受体以来，人们先后
在水 稻 （Ｏｒｙｚａ　ｓａｔｉｖａ）［１５］、番 茄 （Ｌｙｃｏｐｅｒｓｉｃｏｎ
ｅｓｃｕｌｅｎｔｕｍ）［１６］、人参 （Ｐａｎａｘ　ｇｉｎｓｅｎｇ）［１７］、烟 草
（Ｎｉｃｏｔｉａｎａ　ｔａｂａｃｕｍ ）［１８］、龙 眼 （Ｄｉｍｏｃａｒｐｕｓ
ｌｏｎｇａｎ）［１９］等植物中克隆出该基因的全长序列，然
而在观赏植物百子莲中尚未被报道。通过蛋白结构
与序列分析显示，ＴＩＲ１蛋白结构可以与ＩＡＡ分子
０４
第３期 邹梦雯，等：百子莲生长素受体基因ＴＩＲ１的全长ｃＤＮＡ克隆及功能分析
图５　ＴＩＲ１氨基酸序列同源性比较（Ａ）和植物中ＴＩＲ１蛋白系统进化关系（Ｂ）
分析的ＴＩＲ１分别来自于葡萄（Ｖｉｔｉｓ　ｖｉｎｉｆｅｒａ，ＸＭ＿００２２７１３７６），二穗短柄草（Ｂｒａｃｈｙｐｏｄｉｕｍ　ｄｉｓｔａｃｈｙｏｎ，ＸＰ＿００３５７９６５３．１），高粱
（Ｓｏｒｇｈｕｍ　ｂｉｃｏｌｏｒ，ＸＰ＿００２４４７７１９．１），玉米（Ｚｅａ　ｍａｙｓ，ＮＰ＿００１１３６６０８．１），水稻（Ｏｒｙｚａ　ｓａｔｉｖａ　Ｊａｐｏｎｉｃａ，ＮＰ＿００１０５２６５９．１），毛果杨（Ｐｏｐｕｌｕｓ
ｔｒｉｃｈｏｃａｒｐａ，ＸＭ＿００２３２１３００．１），（Ｎｉｃｏｔｉａｎａ　ｔａｂａｃｕｍ，ＧＱ２４９４０８．１），龙眼（Ｄｉｍｏｃａｒｐｕｓ　ｌｏｎｇａｎ，ＧＱ８７０２６４．２），柑橘（Ｃｉｔｒｕｓ　ｔｒｉｆｏｌｉａｔｅ，
ＦＪ５０２２４０．１），陆地棉（Ｇｏｓｓｙｐｉｕｍ　ｈｉｒｓｕｔｕｍ，ＤＱ６５９６２１．１），桃树（Ｐｒｕｎｕｓ　ｐｅｒｓｉｃａ，ＪＮ８６５２５１．１），拟南芥（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ　ｔｈａｌｉａｎａ，ＮＭ＿１１６１６３．
３）。
Ｆｉｇ．５　Ａｌｉｇｎｍｅｎｔ（Ａ）ａｎｄ　ｐｈｙｌｏｇｅｎｅｔｉｃ　ｎｅｔｗｏｒｋ（Ｂ）ｏｆ　１２ＴＩＲ１ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ　ｉｎ　ｐｌａｎｔ
ＴＩＲ１ｆｒｏｍＶｉｔｉｓ　ｖｉｎｉｆｅｒａ （ＸＭ＿００２２７１３７６），Ｂｒａｃｈｙｐｏｄｉｕｍ　ｄｉｓｔａｃｈｙｏｎ （ＸＰ＿００３５７９６５３．１），Ｓｏｒｇｈｕｍ　ｂｉｃｏｌｏｒ （ＸＰ＿００２４４７７１９．１），Ｚｅａ
ｍａｙｓ（ＮＰ＿００１１３６６０８．１），Ｏｒｙｚａ　ｓａｔｉｖａ　Ｊａｐｏｎｉｃａ （ＮＰ＿００１０５２６５９．１），Ｐｏｐｕｌｕｓ　ｔｒｉｃｈｏｃａｒｐａ （ＸＭ＿００２３２１３００．１），Ｎｉｃｏｔｉａｎａ　ｔａｂａｃｕｍ
（ＧＱ２４９４０８．１），Ｄｉｍｏｃａｒｐｕｓ　ｌｏｎｇａｎ （ＧＱ８７０２６４．２），Ｃｉｔｒｕｓ　ｔｒｉｆｏｌｉａｔｅ （ＦＪ５０２２４０．１），Ｇｏｓｓｙｐｉｕｍ　ｈｉｒｓｕｔｕｍ （ＤＱ６５９６２１．１），Ｐｒｕｎｕｓ　ｐｅｒｓｉｃａ
（ＪＮ８６５２５１．１），Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ　ｔｈａｌｉａｎａ（ＮＭ＿１１６１６３．３）．
结合并发生相互作用，亲水性说明它更多位于基质
或细胞质、而非细胞膜系统来介导生长素信号。蛋
白互作网络中的９种蛋白是生长素信号转导途径中
相关蛋白，说明ＴＩＲ１在生长素信号转导过程中发
挥着核心作用。分子系统进化分析表明百子莲
ＴＩＲ１蛋白最早与葡萄聚合为一组且同源性最高。
百子莲从营养生长期到花芽形成期，茎尖内
ＴＩＲ１的ｍＲＮＡ水平呈现稳定的上调表达，且茎尖
中生长素ＩＡＡ含量也表现为持续上升趋势，它们之
间呈显著正相关关系［１４］。通过对百子莲体胚发生
过程中不同阶段ＴＩＲ１表达分析结果表明，愈伤组
织中ＴＩＲ１表达量最低，而在胚性愈伤组织保持期
间表达量有所上升，说明胚性的保持需要较高水平
的生长素；而在体培苗中ＴＩＲ１表达量最高，证明幼
嫩的体胚苗需要高浓度的生长素来促进根、茎、叶器
官 的 生 长 发 育。这 与 龙 眼 体 胚 发 生 过 程 中
ＤＬＴＩＲ１的变化趋势基本一致［１９］。目前普遍认为，
体细胞转化为胚性细胞的分子基础是诱导条件下
１４
上 海 交 通 大 学 学 报 （农 业 科 学 版） 第３３卷
图６　荧光定量ＰＣＲ检测ＴＩＲ１在百子莲体胚发生
过程中的差异表达
ＣＡ：愈伤组织ＥＣ：胚性愈伤组织ＳＥ：体细胞胚ＳＬ：体胚幼苗
Ｆｉｇ．６　Ｒｅｌａｔｉｖｅ　ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ　ｏｆ　ＴＩＲ１ｉｎ　ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ　ｓｔａｇｅｓ
ｏｆ　ｓｏｍａｔｉｃ　ｅｍｂｒｙｏｇｅｎｅｓｉｓ　ｉｎ　Ａ．ｐｒａｅｃｏｘｓｓｐ．ｏｒｉｅｎｔａｌｉｓ
ＣＡ：ｃａｌｕｓ　ＥＣ：ｅｍｂｒｙｏｇｅｎｉｃ　ｃａｌｕｓ　ＳＥ：ｓｏｍａｔｉｃ　ｅｍｂｒｙｏ　ＳＬ：
ｓｏｍａｔｉｃ　ｅｍｂｒｙｏ　ｓｅｅｄｌｉｎｇｓ
基因差别表达的结果［４，２０］。ＩＡＡ，ＩＢＡ，ＮＡＡ与２，
４－Ｄ能够与拟南芥ＴＩＲ１／ＡＦＢ１－３互作调控生长素
下游信号转导过程，拟南芥ａｆｂ５缺失突变体对ＰＩＣ
不敏感，并推断ＰＩＣ可能会作用于ＡＦＢ５蛋白调控
拟南芥的生长发育［１４］；ＡＲＦ和Ａｕｘ／ＩＡＡ蛋白可能
是“感受”生长素浓度梯度的中心，并且将这一信息
转换成基因表达水平高低的信号，从而引起形态学
和发育模式上的变化［２１］。百子莲中，推测ＰＩＣ的主
要调控作用取决于生长素受体蛋白的功能，因为不
同生长素与ＴＩＲ１具有不同的结合能力。生长素可
以直接与ＴＩＲ１结合并促进其与 Ａｕｘ／ＩＡＡ蛋白的
相互作用，而且ＴＩＲ１至少和其他３种相关Ｆ－ｂｏｘ
蛋白／受体相互作用来调节植物生长发育过程中的
生长素反应［２２］。在愈伤诱导初期外源生长素起主
导作用，随着胚性细胞的形成可自身合成生长素，后
期内源生长素便成为主导。外源ＰＩＣ与２，４－Ｄ一
样，可调控生长素下游信号，进而调控体细胞胚胎发
生过程。因此ＴＩＲ１作为生长素受体在体胚发生过
程的信号调控网络中具有非常重要的作用。
本研究采用ｃＤＮＡ末端快速扩增方法获得百子
莲生长素受体ＴＩＲ１基因全长序列，这些均将为今后
进一步研究ＴＩＲ１基因如何参与百子莲体胚发生的
生长素信号途径以及外源生长素类物质ＰＩＣ如何调
控胚性细胞极性结构保持与丧失具有重要指导意义。
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２５