全 文 ：海洋科学/2004年/第 28卷/第 6期46
研究报告REPORTS
孔石莼外植体再生及发育途径的研究
邵魁双1 ,2 ,王金霞 1 ,周百成 1
(1.中国科学院海洋研究所 山东 青岛 266071;2.中国科学院研究生院 , 北京 100039)
摘要:将孔石莼(Ulva pertusa Kjellm)野生种和“不育株”突变体的叶状体切成 1 cm2以下大小不
同的片段培养 , 发现再生情况和外植体大小存在密切关系 。在 5 mm×5 mm以下的片段中 ,
90%以上的细胞都出现了再生 , 表现为 3种发育途径:形成球形的原生质体 , 经丝状体而成叶
状体;产生游动细胞 ,也经过丝状体而成叶状体;细胞原位分裂 ,形成球状体或管状体 , 呈现礁
膜属和浒苔属的特征 。 5 mm×5 mm ～ 10 mm×10mm的片段 , 除边缘的 1 ～ 2层中有极少量
细胞形成游动细胞和球形原生质体外 , 其它细胞没有变化 。将由片段再生形成的小叶状体采
到紫菜苗网上 ,经过一年的海区养殖 ,长成 1 m长的叶状体 。
中图分类号:Q813.1 ,S968.4 文献标识码:A 文章编号:1000-3096(2004)06-0046-05
关键词:孔石莼(Ulva pertusa Kjellm);外植体再生;育苗
收稿日期:2003-04-24;修回日期:2003-08-20
基金项目:国家九五攻关项目(96-C01-05-01)
作者简介:邵魁双(1973-), 辽宁凤城人 , 男 , 博士 , 研究方
向:藻类生物技术 , E-mail:sksteven@sina.com
孔石莼 (Ulca pertusa Kjellm)是北太平洋西部特
有种类 ,也是黄渤海区最常见的海藻之一 。这种温带
性绿藻 , 广泛分布于辽宁 、河北 、山东和江苏等省沿
岸。长江以南的东海和南海沿岸也有生长 ,但由北往
南逐渐稀少 [1 ] 。在中国 , 孔石莼除食用和作饲料外 ,
《本草纲目》等早已有作药用的记载 。《中国海洋药物
辞典》记载了孔石莼等多种石莼的化学成分和药用功
能 ,认为孔石莼有软坚散结、利水消肿和降压之功效 ,
主治甲状腺肿大 ,水肿和高血压等症 [2 ] 。近年来 ,对孔
石莼的药用价值仍在进行深入的研究 。
孔石莼的生活史属于同型世代交替 。孢子体和配
子体都是由双层紧贴的细胞组成的形态相似的叶状
体。在繁殖时 ,叶状体细胞直接发育成孢子囊和配子
囊 , 孢子和合子萌发后直接形成配子体或孢子体 , 均
为具假根的双层细胞构成的叶状体 , 无囊状体 、管状
体等藻体中空的形态 。Migita [3 ]在日本长崎的大村湾
发现和选育出孔石莼的一个株系 , 将其叶状体切成
10 mm×10 mm的片段 ,可以营养繁殖 ,而且耐高温 。
它与野生种不同 , 经 10 a的充气培养 , 未发现产生孢
子和配子 ,只营营养繁殖 。因此 ,认为是一株“不育株”
突变体 。由于这种孔石莼易繁殖 ,在高温期生长旺盛 ,
所以在鱼类养殖和轮虫培养中用于水处理 ,以除去过
量的营养盐类 [4 ,5 ] 。同时 ,它也适于在高温期大量养殖
作为鲍等的饵料 , 因此这种 “不育株” 也已被引入中
国。在切段繁殖过程中也未见通过孢子或配子繁殖 。
孔石莼在食品 、药物 、饵料和环境保护方面的应
用价值使其可能发展成为新的人工栽培海藻 。为此 ,
必须解决人工育苗问题 。孔石莼人工育苗的最佳途径
是建立无性系 , 进行种质保存 , 随时利用无性系的大
量扩繁实现人工育苗 。因此 ,作者研究了孔石莼野生
种和“不育株”外植体再生的条件和过程 ,建立了孔石
莼的无性系并在海上养成大型叶状体 ,同时证明不但
“不育株”在一定的条件下也是可育的 ,而且孔石莼的
叶状体细胞在全能性获得表达时具有 3条不同的发
育途径。
1 材料与方法
野生孔石莼于 7月份采自青岛太平角中潮带 。用
软毛刷刷洗藻体 , 用消毒海水反复冲洗至无杂藻 。用
刀片从藻体中上部切取 2 cm×2 cm的片段 ,用消毒海
水静止培养 3 d ,备用 。所用材料经显微镜观察确定无
繁殖细胞和杂藻 。孔石莼突变株系Migita [3 ]选自日本
长崎 。在本实验室以 20 ℃弱光保存 ,已保存和营养繁
Marine Sciences/Vol.28, No.6/2004 47
图 1 孔石莼外植体切片(5 mm×5 mm以下)
体细胞再生示意
Fig.1 The regeneration pattern of the somatic cells of the
fragments from the sterile mutant of Ulva pertusa
A:体细胞形成成游动细胞 ,萌发形成单列丝状体 ,最后长成叶
状体;B:体细胞 , 形成球形原生质体 , 萌发形成单列丝状体 ,最后长
成叶状体;C:体细胞在原位分裂 ,然后形成球状体或管状体
殖达 3 a 。在单藻培养条件下未见孢子 、配子释放和小
苗的发生 。
用刀片将叶状体先切成边长分别为 1～ 10 mm的
正方形 , 用刀片将 1 mm2片段切碎得到 1mm2以下的
小片段 。显微镜下测量确定小片段大小并分别在培养
皿中培养 。培养液为 PES [6 ] ,用消毒海水配制 ,不加激
素 , 每 3 d更换一次 。培养温度除特别说明者外均为
23 ℃。以荧光灯为光源 ,光强 1 000 ～ 2 000 lx , 光周期
L:D为 12 h:12 h 。每天观察记录切段生长发育情况 。
以紫菜苗网(维尼纶)作为附着基 ,将孔石莼幼苗
采到网上 。于室内培养后移至海上养殖 。每月测定藻
体大小 1次 。养殖期为 1 a。
2 结果
孔石莼野生型和突变株的外植体的再生情况没
有明显的差异 。但一直认为这种突变株只能进行营养
繁殖 ,其外植体细胞全能性表达和再生情况更值得注
意 ,所以图版照片只表示这种突变体的研究结果 。
2.1 外植体再生途径
在不加激素 , 用消毒海水进行单藻培养的条件
下 , 孔石莼野生型和突变株外植体的再生都有 3种发
育途径 。第 1种发生在切片边缘的 1 ～ 2层细胞内 。其
中的少量细胞在培养的 48 h内发生质壁分离 , 成为
球形原生质体(图 2a , b)。它从细胞中释放出来后在
36 h内就可萌发 。经过第一次分裂后(图 2c),下面的
细胞萌发成盘状的假根细胞 ,上面的细胞经几次分裂
后形成单列的丝状体(图 2d)。当丝状体的细胞数达到
13 ～ 15个时 , 从丝状体的基部开始纵分裂 , 最后成为
叶状体 。第 2种途径为先是边缘细胞 , 然后是片段内
部体细胞原生质浓缩 , 质壁分离 (图 2e)。在以后的
6 ～ 7 d内 , 在这些细胞中形成游动细胞 。每个细胞内
这种游动细胞一般为 16个 , 先是在细胞内剧烈旋转 ,
在大约 3 d内全部释放出来 。游动细胞梨形 , 长度为
9 ～ 11μm。附着后变圆 ,直径约 7 ～ 9μm。于 6 ～ 7 d后
细胞直径达到 10μm时开始分裂(图 2g)。细胞先一分
为二 (图 2h), 下面的细胞逐渐成为丝状或盘状的假
根 , 上面的细胞先分裂形成单列的丝状体(图 2i), 然
后再从丝状体的基部开始纵分裂 , 最后形成叶状体
(图 2k)。有的游动细胞释放出来以后 ,又附着在原来
的片段上 , 结果成为一簇丝状体(图 2j), 最后成为成
簇的叶状体小苗 。产生游动细胞的体细胞一般连接成
片 , 在叶状体片段上呈斑状分布 。第 3种途径是切片
上的体细胞在原位直接分裂成不规则的细胞团 (图
3a),经过连续分裂发育成为囊状或管状的藻体 。经 6
个月的培养 ,囊状体的直径达到 1 cm左右(图 3b),管
状体的长度达到 3～ 4 cm(图 3c)。在这批材料的重复
实验中 , 外植体再生的 3种途径中 , 以产生游动细胞
的途径为主 。外植体小片段形成游动细胞的体细胞最
高可达到总细胞数的 90%左右 。
2.2 外植体再生的条件
在单藻培养条件下 , 上述外植体再生均不需外
加激素 。但是必须从藻的整体上切下 , 即与整体形成
隔离 ,同时再生的情况与外植体的大小密切相关 。
在比较大的 5mm×5 mm ～ 10 mm×10 mm的片
段中 , 只有边缘的 1 ～ 2层细胞中的少数细胞发生质
壁分离 , 呈球状或形成游动细胞 , 通过第 1和第 2种
途径再生 , 发育成新的叶状体 。 5 mm×5 mm以下
的外植体除边缘细胞在 24 h内形成游动细胞或呈球
状外 , 9 0%以上的内部细胞在以后也形成游动细胞
或原位分裂形成囊状体或管状体。 大小为 1mm ×
1 mm ～ 5 mm×5 mm的外植体 ,形成游动细胞的细胞
占体细胞总数的 60%～ 70%, 0.5 mm×0.5 mm以下
的外植体中约占 30%～ 50%。同时 ,随着外植体变小 ,
形成游动细胞的细胞数减少 ,原位分裂产生囊状体或
管状体的细胞数增加 , 通过第 2和第 3条途径再生的
细胞数仍占外植体细胞总数的 90%以上 。
2.3 幼苗的重新附着
在育苗过程中 , 幼苗的附着能力是十分重要
的 。将已经附着的长度小于 5 mm的再生小苗带假根
刮下 , 发现幼苗的重新附着速度同培养温度有关 。在
研究报告 REPORTS
海洋科学/2004年/第 28卷/第 6期48
图 2 孔石莼突变体外植体切片(5 mm×5 mm以下)再生-Ⅰ
Fig.2 Regeneration of the fragments(less than 5 mm×5 mm)from the sterile mutant of Ulva pertusa-Ⅰ
标尺 a～ j=10μm;k=1 cm;l=0.5 cm;m, n=10 cm
a:开始培养时的体细胞;b:边缘细胞形成的球形原生质体(箭头);c:原生质体开始萌发;d:由 c形成的丝状体;e:细胞原生质浓缩;f:游动
细胞形成;g:刚释放和已变圆的游动细胞;h:游动细胞开始萌发;i:具有两种假根的单列丝状体;j:簇生的丝状体;k:由游动细胞发育形成的叶
状体;l:附着在苗绳上的幼苗;m:在紫菜苗网上养殖的孔石莼突变株;n:孔石莼突变株的成体(1 m长)
23 ℃下培养 , 48 h后有 57%的小苗已重新附着 , 4 d
后全部小苗已牢固附着 。但在 15 ℃下培养 , 48 h后还
未见小苗附着 。5 d后只有 50%附着 。在 10 ℃下培养
的小苗需要 17 d才能全部附着 。
若将上述小苗切掉假根培养 ,伤口处的细胞可以
延伸形成新的假根丝 , 仍可以附着在基质上 。这种假
研究报告 REPORTS
Marine Sciences/Vol.28, No.6/2004 49
图 3 孔石莼突变体外植体切片(5 mm×5 mm以下)再生-Ⅱ
Fig.3 Regeneration of the fragments(less than 5 mm×5 mm)f rom the sterile mutant of Ulva pertusa-Ⅱ
标尺 a =10μm;b , c=0.5 cm
a:体细胞连续分裂形成不规则的细胞团;b:由 a进一步发育形成管状体;c:由 a进一步发育形成囊状体
根丝的形成也同培养温度有关 。在 23 ℃, 全部小叶
状体在 4 d内都已重新长出假根并附着牢固 , 而在
15 ℃和 10 ℃则分别需要 14 d和 19 d。
2.4 再生苗的养成
附着到苗绳上的孔石莼再生小苗(图 2L)在室内
通气培养半个月后长度达到 3 ～ 4 cm , 于 9月中旬置
海上养殖 , 养殖深度为 1m , 1个月后 , 孔石莼长度达
到 15 ～ 20 cm。但是从 9月到 10月养殖海区敌害生物
如麦杆虫 、钩虾等较多 ,对幼苗损害较大。从 11月至
第 2年的 3月份 , 由于水温低 , 孔石莼的生长也比较
缓慢 。4月以后水温回升 ,生长速度加快 ,到 9月收获
时 , 大部分藻体长度已达到 1m左右(图 2 m ,n)。这
一初步结果说明 , 用孔石莼的再生苗可以作为种苗
来源进行人工养殖 , 但养殖季节和技术尚待进一步
研究 。
3 讨论
为了发展孔石莼的人工养殖 , 首先需要解决苗
种培育问题 。直接利用孢子育苗 ,不仅无法解决种质
保存和纯种化养殖 ,又因为孢子繁殖的季节性而受到
季节的限制 。海带 、裙带菜和紫菜的研究结果表明 ,细
胞工程育苗技术可以克服这些困难。上述结果表明 ,
用孔石莼外植体再生的幼苗可以养成新的藻体 。同
时 , 这种再生苗在低温 、弱光 、高密度 、不换水的条件
下培养 , 保存已达 3 a之久 , 虽然幼苗的生长受到抑
制 ,但仍然保持再生假根、附着和继续生长的能力 ,表
明用其进行孔石莼的种质保存和苗种生产是完全可
能的 。
对于像孔石莼这样简单的叶状体海藻 ,在不加激
素的单藻培养的条件下 , 通过简单的切割就可以诱导
外植体细胞全能性表达 ,获得再生植株 。除孔石莼外 ,
作者在绿藻礁膜 (Monosroma nitidum)、 肠浒苔
(Enteromorpha intestinalis)、缘管浒苔 (E.linza)、和扁
浒苔(E.compressa)中也观察到类似的现象(另文发
表)。紫菜是单层细胞构成的叶状体 。 Notoya [7 ]用甘
紫菜 (Porphyra tenera)、圆紫菜 (P.suborbicalata)、条
斑紫菜(P.yezoensis)和冈村紫菜(P.okamurae)的小片
状外植体获得再生植株 。梅俊学等 [8 ,9 ]把条斑紫菜叶
状体切成 10 mm×10 mm以下的切块培养 , 切块上
的体细胞可以形成“单孢子”并长成新的叶状体 ,而且
5 mm×5 mm以下的切块出苗又早又多 。说明再生能
力也同外植体与整体隔离和切块的大小有关 。这些事
实说明外植体同藻体整体隔离是诱导体细胞全能性
表达 ,完成脱分化和再分化过程的先决条件 。这种脱
分化和再分化过程不必经过愈伤组织阶段 。
孔石莼外植体再生植株可以通过 3条不同的途
径 ,分别形成囊状体 、管状体和叶状体 。在孔石莼的生
活史中只有叶状体和孢子 、合子萌发初期的丝状体形
态 。囊状体是礁膜属早期发育过程中出现的特征 , 管
状结构是浒苔属的特征 。这种现象在石莼属藻类的原
生质体培养中也已观察到 。其中 , Reddy等 [10 ]观察到
裂片石莼(U.fasciata)、蛎菜(U.conglobata)的原生质
体再生后形成孢子囊 、锥状体和叶状体 , 孔石莼原生
质体再生后形成孢子囊 、囊状体和叶状体 。Chen [11 ]报
道裂片石莼原生质体再生过程中也出现了孢子囊 、微
藻体 、管状体和囊状体 。但这些藻体形式只是过渡类
型 ,后来都发育成叶状体 。虽然与孔石莼的囊状体和
管状体经 6个月的培养继续长大并保持原来形态不
同 ,但是其共同点是石莼属的体细胞在全能性表达时
研究报告 REPORTS
海洋科学/2004年/第 28卷/第 6期50
其发育途径可以不局限于遵循通常个体发育的一种
途径 。这是值得注意并需要深入研究的问题 。这一问
题的研究将加深对植物细胞全能性的含义 、基因组的
结构和进化的理解 。
参考文献:
[ 1] 曾呈奎 .中国经济海藻志[ M] .北京:科学出版社 .
1962.39-40.
[ 2] 姜凤吾等 .中国海洋药物辞典[ M] .北京:海洋出版
社 .1994.81.
[ 3] Migita S.The steri le mutant of Ulva pertusa Kjellman from
Omura Bay[ J] .Nagasaki suisan , 1985, 57:33-37.
[ 4] Xu B T , Hirata H.Effects of feed additive Ulva reproduced
in feedback culture system on the survival and growth rates
of Japanese flounder[ J] .Suisanzoshoku , 1992, 40(2):
207-213.
[ 5] Yamasaki S , Tanaka K.Possibility of utilizing sterile
mutant Ulva pertusa as a bio-fil ter in a closed culture
system of the rotifer Brachionus plicatilis[ J] .Fisheries
Science , 1996 , 62(2):323-324.
[ 6] Provasoli L.Media and products for the cultivation of
marine algae[ A] .Watanabe A , Hattori A.Culture and
collections of algae[ C] .Tokyo:Jap Soc Plant Physiology ,
Tokyo , 1968, 63-75.
[ 7] Notoya M.Seedproduction of Porphyra spp.by tissue
culture[ J] .Journal of Applied Phycology , 1999 , 11(1):
105-110.
[ 8] 梅俊学 ,费修绠 .形成条斑紫菜离体组织再生苗的几
种方式[ J] .海洋科学 , 1999, 23(4):66-68.
[ 9] 梅俊学 ,费修绠 .条斑紫菜离体组织再生苗的研究
[ J] .海洋科学 , 2000, 24(6)39-42.
[ 10] Reddy C R K , Migita S , Fuji ta Y.Protoplast isolation and
regeneration of three species of Ulva in axenic culture[ J] .
Botanica Marina, 1989 , 32:483-490.
[ 11] Chen Y C , Shih H C.Development of protoplasts of
Ulva fasciata (Chlorophyta)for algal seed stock[ J] .
Journal of Phycology, 2000 , 36(3):608-615.
Study on the regeneration and development pattern of explants
of Ulva pertusa Kjellm(Ulvales , Chlorophyta)
SHAO Kui-shuang1 ,2 , WANG Jin-xia1 , ZHOU Bai-cheng 1
(1.Institute of Oceanology , the Chinese Academy of Sciences , Qingdao 266071 , China;2.The Graduate School of the
Chinese Academy of Sciences , Beijing 100039 , China)
Received:Apr., 24, 2003
Key words:Ulva pertusa;explants;regeneration;arti ficial breeding
Abstract:Tissues of sterile mutant and wild type Ulva pertusa Kjellm were cut into fragments of less than 1 cm2.It
was found that regeneration was relative to size of the explants.Among the fragments of size less than 0.25 mm2 , more
than 90%of the cells of the fragments regenerated showing three development patterns.A few cells produced spherical
protoplasts that germinated into filaments and later grew into fronds;most of the cells gave rise to mobile cells that also
developed into fronds;other cells divided in situ and regenerated into tubular or saccate thalli.Among the fragments of size
5mm×5 mm ～ 10mm×10mm , only a very small quantity of somatic cells around the margin produced mobile cells and
spherical protoplasts.The nori-nets with regenerated fronds were incubated indoors for half a month and transplanted into
the field sea.The seedlings grew into 1 m long thalli after one year of marine cultivation.
(本文编辑:张培新)
研究报告 REPORTS