全 文 ：纳米 TiO2对小球藻和新月菱形藻的毒性研究
孙 羿 1 王 华 1 * 吕丰訸 1 于春艳 2 刘恒明 3
（1大连海洋大学水产与生命学院，辽宁省贝类良种繁育工程技术研究中心，辽宁大连 116023； 2国家海洋环境监测中心；
3大连海洋大学海洋科技与环境学院）
摘要 研究了纳米 TiO2对小球藻（Chlorella sp.）和新月菱形藻（Nitzschia closterium）的毒性。15 d 的试验结果表明，纳米 TiO2对 2 种微
藻的毒性均随着纳米 TiO2浓度的增加而增强。但是，纳米 TiO2对 2 种微藻生长的抑制作用呈现一定差异性，当水中纳米 TiO2浓度低于 9.0
mg/L 时，纳米 TiO2对小球藻生长产生的抑制作用强于新月菱形藻；当水中纳米 TiO2浓度高于 12.0 mg/L 时，纳米 TiO2对小球藻和新月菱形
藻生长产生的抑制作用相近，生长相对抑制率均为 40%左右。利用扫描电子显微镜观察了纳米 TiO2对小球藻藻细胞个体形态的影响，发现
纳米 TiO2可以导致小球藻表面出现塌陷。
关键词 纳米 TiO2；小球藻；新月菱形藻；毒性
中图分类号 X52 文献标识码 A 文章编号 1007-5739（2016）01-0217-03
Toxicity of TiO2 Nanoparticles to Chlorella sp. and Nitzschia closterium
SUN Yi 1 WANG Hua 1* LV Feng-he 1 YU Chun-yan 2 LIU Heng-ming 3
（1 Engineering Research Center of Shellfish Culture and Breeding in Liaoning Province ，College of Fisheries and Life Science，Dalian Ocean
University，Dalian Liaoning 116023； 2 National Marine Environmental Monitoring Center； 3 School of Marine Science and Environment Technology，
Dalian Ocean University）
Abstract The toxicity of titanium dioxide（TiO2）nanoparticles for Chlorella sp. and Nitzschia closterium was investigated. The results indicated
that the toxicity of TiO2 nanoparticles was increased with the TiO2 nanoparticle concentration increasing. Under the same experimental conditions ，these
two species of microalgae showed different expressions within the same culture duration. When the concentration of TiO 2 was lower than 9.0 mg/L，the
inhibiting effect for Chlorella sp. was higher than that of Nitzschia closterium.When the concentration of TiO2 was higher than 12.0 mg/L，the inhibiting
effect for both Chlorella sp. and Nitzschia closterium were the same，and the inhibiting effect reached about 40%. It could be found from the scanning
electron microscopy image that the surface structure of Chlorella sp. shrinked under the treatment of high TiO2 nanoparticle concentration.
Key words TiO2 nanoparticles；Chlorella sp.；Nitzschia closterium；toxicity
纳米材料的表面效应、体积效应和量子尺寸效应使得
纳米材料具有极大的比表面积和极高的化学反应活性，且
所表现的力、声、热、光、电磁等性质也不同于块体材料 [1]。但
是，随着人工纳米材料的广泛应用，流失于环境中的纳米材
料可能会影响生态环境安全。已有研究结果表明，部分纳米
材料具有一定的生物毒性。例如，金星龙等研究了纳米 ZnO、
纳米 NiO 和纳米 Fe2O3对小球藻 Chlorella vulgaris 的毒性效
应，发现高浓度的纳米氧化物对小球藻均产生不同程度的
生长抑制作用 [2]。Francois 等研究了纳米 CuO 对莱茵衣藻
Chlamydomonas reinhardtii 的毒性效应，发现纳米 CuO 对莱
茵衣藻生长产生一定的影响 [3]。王 秀等报道了纳米氧化铁
对大型蚤 Daphnia magna 的急性毒性，发现暴露于纳米氧化
铁悬乳液中 48 h 后，大型蚤的活动能力受到一定的抑制 [4]。
Hao 等研究了纳米 TiO2对鲤鱼 Cyprinus carpio 的毒性，发现
水中的纳米 TiO2会影响鲤鱼的生长 [5]。
微藻是水生生态系统中最重要的初级生产者，微藻种
类组成和群落结构变化直接影响水生生态系统的能量流
动、物质循环和信息传递。此外，微藻的世代周期短，易于培
养，对环境污染物有较高敏感性，常被作为评价环境污染的
受试生物。目前，纳米 TiO2 作为一种新型的无机半导体材
料，广泛应用于化工、环保、纺织、陶瓷、建筑等领域。本文选
取海水饵料生物培养中常见的小球藻（Chlorella sp.）和新月
菱形藻（Nitzschia closterium）为受试生物，研究了不同浓度
纳米 TiO2 对这 2 种海洋微藻的毒性 ，进而为海水中纳米
TiO2的生物安全评估提供基础数据，也为今后更加科学合
理地使用纳米材料提供一定参考。
1 材料与方法
1.1 试验材料
纳米 TiO2（P25，Degussa），含量>99.5%，粒径约为 20 nm，
白色粉体，混晶型。试验中所用玻璃器皿在使用前均用 10%
硝酸浸泡 48 h，然后用去离子水洗净，经高温高压（121 ℃，
15 min）灭菌后待用。
1.2 试验方法
1.2.1 微藻培养。微藻培养所需海水为砂滤的大连黑石礁
近岸表层海水（S=30，pH=8.0），经煮沸后使用。试验用小球
藻和新月菱形藻藻种由大连海洋大学藻种间提供。在无菌条
件下，取生长良好的小球藻和新月菱形藻藻种分别接种到
250 mL锥形瓶中，加入适量康威营养盐，在室温自然光照下
培养。
1.2.2 毒性试验。称取一定量的纳米 TiO2，用超纯水配制成
纳米 TiO2 悬浊液，并通过超声使其充分分散。将适量 TiO2
悬浊液加入培养微藻的锥形瓶中，使溶液中纳米 TiO2的浓
度分别为 0、3.0、6.0、9.0、12.0、15.0 mg/L，每个试验浓度梯度
设置 3 个平行试验，试验持续时间为 15 d。
1.2.3 微藻计数方法。分别于毒性试验开始后的 1、3、5、7、
9、11、13、15 d 对小球藻和新月菱形藻取样，微藻生长状况
采用细胞计数法表征。
1.2.4 相对抑制率计算。纳米 TiO2对海洋微藻生长相对抑
制率的计算公式为 [6]：
IR（%）=（1–Nt/N0）×100
式中，IR为相对抑制率，N0 为对照组微藻细胞个数，Nt
基金项目 辽宁省自然科学基金（2014020149）。
* 通讯作者
收稿日期 2015-11-30
资源与环境科学现代农业科技 2016年第 1 期
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资源与环境科学 现代农业科技 2016年第 1期
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12.0 mg/L
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6.0 mg/L
3.0 mg/L
15.0 mg/L
图 2 不同浓度纳米 TiO2对小球藻相对抑制率的影响
为纳米 TiO2试验组微藻细胞个数。
1.2.5 扫描电镜观察。将 15 d 后对照组和 15.0 mg/L 纳米
TiO2处理组的小球藻分别放入离心管中离心，离心后的藻细
胞用 2.5%的戊二醛固定，再经叔丁醇梯度逐级脱水后，真空
干燥，喷金，样品在扫描电子显微镜（JEM-2000FX）下观察。
1.3 数据分析
采用 SPSS 18.0 软件分析所得试验数据，采用单因素方
差法比较试验组与对照组及试验组之间的差异，P<0.05 为
差异显著，P<0.01 为差异极显著。
2 结果与分析
2.1 纳米 TiO2对小球藻的毒性
图 1 为水中纳米 TiO2 含量分别为 0、3.0、6.0、9.0、12.0、
15.0 mg/L 时对小球藻生长的影响。可见，随着试验时间的延
长，各组小球藻的密度均呈现增加的趋势。在 1~5 d 内，各试
验组中小球藻数量增加不明显；从 7 d 开始，对照组和加入
纳米 TiO2的试验组中，小球藻藻细胞数量均开始出现增加；
到 11 d 时，对照组小球藻类密度为 2.88×106个/mL，而高浓
度纳米 TiO2（15.0 mg/L）处理组的藻细胞密度只有 1.50×106
个/mL；15 d时，对照组小球藻细胞密度达到 3.34×106个/mL，
远高于其他各试验组。从图 1 还可以看出，随着水中纳米
TiO2浓度增加，小球藻藻细胞密度逐渐降低，表明纳米 TiO2
对小球藻生长的抑制作用随纳米 TiO2浓度增加而增强。
图 2为纳米 TiO2浓度分别为 3.0、6.0、9.0、12.0、15.0 mg/L
时，对小球藻的相对抑制率。可见，各浓度梯度的纳米 TiO2
均对小球藻产生抑制效应，且相对抑制率随着时间增长逐渐
增加。15 d 时，纳米 TiO2浓度分别为 3.0、6.0 mg/L 试验组的
小球藻相对抑制率分别为 24.43%和 25.68%，两者差异不显
著；9.0 mg/L 试验组相对抑制率为 33.17%，与 3.0、6.0 mg/L
试验组差异显著（P<0.05）；12 mg/L 试验组相对抑制率为
40.06%，15.0 mg/L 试验组相对抑制率为 41.56%，2 组间差异
不显著，但与低浓度试验组的差异显著（P<0.05）。由图 2 可
知，纳米 TiO2会对小球藻生长产生抑制作用，不同浓度纳米
TiO2对小球藻生长的影响存在一定差异，纳米 TiO2低浓度
组（3.0、6.0 mg/L）与高浓度组（12.0、15.0 mg/L）之间差异极显
著（P<0.01）。
图 3 为 15 d 时 0 mg/L 纳米 TiO2对照组和 15.0 mg/L 纳
米 TiO2 处理组中小球藻藻细胞的扫描电镜图。如图 3a 所
示，对照组小球藻细胞饱满、完整，细胞表面光滑。图 3b、c
的扫描电镜图清晰显示了高浓度纳米 TiO2处理组小球藻藻
细胞形态发生的变化，可见小球藻藻细胞表面皱缩，部分细
胞结构出现塌陷，且小球藻藻细胞间粘连严重。
2.2 纳米 TiO2对新月菱形藻的毒性
图 4 为 0、3.0、6.0、9.0、12.0、15.0 mg/L 纳米 TiO2 对新月
菱形藻生长的影响。可见新月菱形藻密度均随着时间延长
而增加，但与未加入纳米 TiO2 的对照组相比，各加入纳米
TiO2组对新月菱形藻的生长均有一定程度的影响。15 d 时，
对照组新月菱形藻密度达到 1.66×106 个/mL，3.0 mg/L 纳米
TiO2 试验组密度为 1.58×106 个/mL，但 15.0 mg/L 纳米 TiO2
处理组新月菱形藻细胞密度仅为 9.47×105个/mL，说明纳米
TiO2对新月菱形藻生长产生了影响。
图 5 为 3.0、6.0、9.0、12.0、15.0 mg/L 纳米 TiO2对新月菱
形藻生长的相对抑制率。可见，各浓度梯度的纳米 TiO2 对
新月菱形藻生长均产生抑制 ，且生长相对抑制率随着纳
米TiO2 浓度的增加而增大。试验初期，低纳米 TiO2 浓度组
（3.0、6.0 mg/L）均表现出较低的抑制效应，在前 7 d 相对抑
制率都低于 10%，组间差异不显著；在 15 d 时，3.0、6.0 mg/L
纳米 TiO2浓度组相对抑制率分别为 15.03%和 18.68%，说明
随着试验时间延长，纳米 TiO2的毒性逐渐显现。在 15 mg/L
纳米 TiO2处理组中，3 d 时相对抑制率达到 25.41%，并随时
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图 1 不同浓度纳米 TiO2对小球藻生长的影响
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图 4 不同浓度纳米 TiO2对新月菱形藻生长的影响
图 3 纳米 TiO2对小球藻藻细胞生长影响的扫描电镜图
注：a为对照组（0 mg/L），b、c 为处理组（15 mg/L）。
a b c
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9.0 mg/L
6.0 mg/L
3.0 mg/L
15.0 mg/L
图 5 不同浓度纳米 TiO2对新月菱形藻相对抑制率
的影响
间延长相对抑制率逐渐增加。当 15 d 时，12、15 mg/L 纳米
TiO2的相对抑制率分别达到 38.06%和 40.00%，与纳米 TiO2
低浓度试验组（3.0、6.0 mg/L）差异极显著（P<0.01）。
3 结论与讨论
3.1 结论
研究结果表明，纳米 TiO2对小球藻和新月菱形藻的生
长均会产生抑制作用。当水中纳米 TiO2 浓度低于 9.0 mg/L
时，纳米 TiO2对小球藻生长产生的抑制作用强于新月菱形
藻；当水中纳米 TiO2浓度高于 12.0 mg/L 时，纳米 TiO2对小
球藻和新月菱形藻生长产生的抑制作用相近，生长抑制率
均为 40%左右。
3.2 讨论
流失于水生生态环境中的纳米材料可能会对水生态系
统的结构和功能产生影响。浮游植物作为水环境中的初级
生产者，在水生态系统中占有重要地位，是纳米材料毒性研
究中的常用指示生物。在本研究中发现，纳米 TiO2对小球藻
和新月菱形藻的生长均表现出抑制作用，且抑制作用随着
纳米 TiO2浓度的增高而增加。同时，纳米 TiO2 对小球藻和
新月菱形藻的生长抑制作用略有不同。15 d 时，当水中纳米
TiO2浓度分别为 3.0、6.0、9.0 mg/L 时，对小球藻的生长相对
抑制率分别为 24.43%、25.68%、33.17%，对新月菱形藻的生
长相对抑制率分别为 15.03%、18.68%、19.26%，可见在纳米
TiO2浓度低于 9.0 mg/L 时，对小球藻的生长抑制作用强于
新月菱形藻。当水中纳米 TiO2 浓度分别为 12.0、15.0 mg/L
时，纳米 TiO2对小球藻的生长相对抑制率分别为 40.06%和
41.56%，纳米 TiO2对新月菱形藻的生长相对抑制率分别为
38.06%和 40.00%，可见在 TiO2浓度高于 12.0 mg/L 时，纳米
TiO2对小球藻和新月菱形藻的生长抑制作用相近。李雅洁
等研究纳米二氧化钛对斜生栅藻（Scenedesmus oblignus）的
毒性，发现低浓度纳米氧化物对斜生栅藻有促进生长作用，
但高浓度则存在明显抑制效应 [7]。本研究中纳米 TiO2浓度设
定范围为 0~15.0 mg/L，在此浓度范围内纳米 TiO2对小球藻
和新月菱形藻生长全部表现为抑制作用，这可能与本试验
中使用的纳米 TiO2晶型有关。已有研究证实，锐钛矿型 TiO2
比金红石型 TiO2有更强的细胞毒性 [8]。在侯东颖等研究中，
考察锐钛矿型纳米二氧化钛对普生轮藻（Chara vulgaris L）
的急性毒性，发现 TiO2组（10 mg/L 和 100 mg/L）与对照组相
比差异极显著，且表现出剂量效应 [9]。
纳米 TiO2对鱼类的影响也受到人们的关注。纳米 TiO2
可以在鱼体内富集 ，在鱼鳃及内脏中的富集量较高 [ 10]。
Warheit 等研究纳米 TiO2对虹鳟（Oncorhynchus mykiss）的毒
性，试验结果表明，在急性暴露实验中水中纳米 TiO2会对虹
鳟产生潜在危害 [11]。Gillian 等发现纳米 TiO2 能引起虹鳟
（Oncorhynchus mykiss）鳃的水肿，并引起了肝细胞脂肪过量
和脂沉积 [12]。Hao 等使用 100~200 mg/L 纳米 TiO2 对鲤鱼处
理20 d，发现鲤鱼腮小片增厚、腮丝出现病变和肝脏坏死等
生理变化[5]。
纳米 TiO2的毒性研究并不局限在藻类或鱼类上。例如
Laura Clément 等以不同粒径与晶体型的纳米 TiO2处理枝角
类、微藻、轮虫等，发现纳米 TiO2在一定浓度范围内对受试
生物表现出一定程度的毒性效应 [13]。Loven 等研究表明大型
蚤（Daphnia magna）对纳米 TiO2毒性敏感，当处于一定浓度的
TiO2水溶液中时，随着 TiO2浓度的增加，大型蚤死亡率增加[14]。
除纳米 TiO2外，其他纳米材料也存在一定生物毒性。巩
宁等研究了 2 种粒径氧化镍纳米颗粒对小球藻 （Chlorella
vulgaris）的毒性，不同浓度（1、5、10、30、50 mg/L）纳米 NiO 处
理小球藻 48 h 后，小球藻出现明显的抑制效应，且随着处理
浓度的增加，生长抑制程度不断增强。当浓度达到 100 mg/L
时，72 h 抑制率接近 50%，120 h 抑制率接近 80%，生长基本
停滞[6]。雷静静等通过配制不同浓度（0、60、120、180、240、300
mg/L）纳米氧化镍悬浊液，对四尾栅藻（Scenedesmus quadric-
auda）、小球藻（Chlorella vulgaris）和羊角月牙藻（Selenastrum
capricornutum）进行连续 10 d 的毒性试验，结果表明纳米
NiO对四尾栅藻、小球藻和羊角月牙藻的生长均有一定抑制
作用 [15]。李永仙等使用 0、18、31、44、57 mg/L 纳米 NiO 对小
球藻（Chlorella vulgaris）进行处理，发现初始时纳米 NiO 的
浓度对小球藻的胁迫作用差别不大，但随着时间的延长，高
浓度组纳米 NiO 对小球藻的抑制作用差别明显 [16]。
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（下转第 223页）
孙 羿等：纳米 TiO2对小球藻和新月菱形藻的毒性研究
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（上接第 219页）
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加重视酵素菌肥料的应用情况。
5.1 建议
对于在我国推广酵素菌技术存在的问题提出以下建
议：一是应积极从日本引进原菌生产技术，拓展企业发展空
间，加快酵素菌企业化发展步伐，以方便各地生产和使用酵
素菌肥，并为其质量检测提供依据。同时还要加快生产酵素
菌肥标准的制定步伐，以进一步加强其质量检测，确保菌肥
的质量达到合格标准。二是增加酵素的投入产出比，实现生
产成本降低、经济效益提高的目标。在施用酵素菌肥时，应
考虑我国农业生产的实际情况，有针对性地科学合理利用
酵素菌肥料的特性，实现增加肥效和提高作物产量的目标。
如水果花卉及大棚蔬菜等作物，甚至发生病害较严重的作
物，均可应用酵素菌技术，应做到物尽其用 [2]。三是应以引进
的酵素菌技术为基础，进一步研制出对我国土壤针对性更
强的专用肥，以提高酵素菌肥的利用效率，减少肥料浪费，
降低肥料成本，提高施肥的合理性，使酵素菌技术充分发挥
其优势。四是除了研究酵素在肥料和饲料方面的应用，还应
该在此基础上作更深入的探讨和研究，如发掘其在其他领
域的潜在价值等，以充分开发功能性酵素菌。例如，利用其
发酵能力能够去除异味并且降低有害物质的优势开发具有
环保功能的功能性酵素，使其对环境起到改善作用等。
5.2 展望
微生物肥料取代化肥的趋势日益明显，其低成本、高功
效且不破坏环境的优势，与化肥在现代农业生产中高成本、
低效率以及污染环境等劣势形成鲜明对比。因此，降低化肥
的使用率，提高微生物肥料的使用率是农业生产界的大势
所趋。但在微生物肥料推广时必须要注意以下几点：一是具
有国家的登记证明；二是有效活菌数量达标，且存放时间是
在有效期内；三是使用方法正确；四是严格按照规定存放。
因此，为了不影响功效，微生物肥料必须全部符合以上要求
才能推广使用。
总之，由于酵素菌技术在我国的引进和使用时间较短，
因此在推广应用过程中，要边推广边总结，并因地制宜地改
进和创新该项技术，使其更符合我国农业生产的要求，促进
我国农业产业结构调整，帮助我国农民更好地增收。
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冯 蕾等：酵素菌微生物在农业生产中的应用进展
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