全 文 ：第 33 卷第 2 期
2012 年 2 月
环 境 科 学
ENVIRONMENTAL SCIENCE
Vol． 33，No． 2
Feb．，2012
软骨藻酸直接竞争 ELISA方法的建立及优化
王茜，程金平* ，高利利，董宇，席磊
(上海交通大学环境科学与工程学院，上海 200240)
摘要:为建立软骨藻酸(domoic acid，DA)直接竞争 ELISA方法快速检测样品中的软骨藻酸，本研究利用碳化二亚胺法将辣根
过氧化物酶(HRP)标记软骨藻酸(DA) ，成功制得偶联物 DA-HRP．在前期已制得抗软骨藻酸单克隆抗体的基础上，利用酶标
抗原和单克隆抗体的特异性反应，对软骨藻酸进行定量分析．通过对封闭液、封闭时间和温育温度的优化，建立标准曲线．结
果表明以 1%明胶作为封闭液，在 37℃下封闭 1 h，加入单抗 37℃ 温育 1 h是直接竞争 ELISA法的最佳反应条件，方法检出限
为 3. 58 ng·mL －1，孔间变异系数均≤15%，加标回收率为 80% ～120%，检测速度较快，1. 5 h 内可检测出一批样品，适用于现
场和批量检测，具有广泛的发展前景．
关键词:软骨藻酸(DA) ;酶联免疫吸附法(ELISA) ;抗体;抗原;快速检测
中图分类号:X830. 2 文献标识码:A 文章编号:0250-3301(2012)02-0647-05
收稿日期:2011-04-26;修订日期:2011-06-30
基金项目:国家高新技术研究发展计划(863)项目(2007AA092001-
15) ;上海科委科技攻关项目(08DZ1206302) ;海洋赤潮
灾害立体监测技术与应用国家海洋局重点实验室开放研
究基金项目(MATHAB200917)
作者简介:王茜(1987 ～) ，女，硕士研究生，主要研究方向为赤潮藻
毒素的快速检测，E-mail:wangqian19870102@ 163． com
* 通讯联系人，E-mail:jpcheng@ sjtu． edu． cn
Development of Direct Competitive Enzyme-Linked Immunosorbent Assay for
the Determination of Domoic Acid
WANG Qian，CHENG Jin-ping，GAO Li-li，DONG Yu，XI Lei
(School of Environmental Science and Engineering，Shanghai Jiao Tong University，Shanghai 200240，China)
Abstract:To develop a direct competitive enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) for rapid detection of domoic acid
concentrations，HRP (horse radish peroxidase)was successfully linked to DA using EDC． The concentration of DA was quantitatively
analyzed on the basic of the specific immune responses between the DA-HRP and the monoclonal antibodies made in advance．
Calibration curve were established after the optimization of reaction conditions such as the type of blocking solution，the blocking time
and the incubation temperature． The results show that，the best reaction condition of the direct competitive ELISA is 1% gelatin，
blocking 1 h at 37℃ ，incubating 1 h at 37℃ after the monoclonal antibodies added. The detect limit is 3. 58 ng·mL －1，the coefficient
of variation between the holes is below 15%，and the recovery is 80% -120% ． The whole analysis process could be completed within
1. 5 h． It meets the requirements of rapid and batch detection of domoic acid． The method will have broad development prospects．
Key words:domoic acid(DA) ;enzyme-linked immunosorbent assay(ELISA) ;antibody;antigen;rapid detection
软骨藻酸(domoic acid，DA) ，作为一种罕见的
天然神经毒性氨基酸，由它引发的食物中毒可引起
呕吐、腹泻、神志不清、记忆丧失、眩晕、昏迷甚至死
亡［1，2］． 1987 年加拿大王子岛的东海岸首次发生有
人食用了被软骨藻酸污染的贻贝而中毒死亡［3］，随
后又相继在多种海洋生物中发现 DA［4 ～ 7］．为了保证
人类健康，软骨藻酸的检测技术逐渐得到了发展．目
前，常用的软骨藻酸的检测技术包括:小白鼠生物检
测法、高效液相色谱(HPLC)检测法、毛细管电泳检
测法、酶联免疫吸附法等．小白鼠生物检测法受外界
影响因素多，检出限高，只有 300 ～ 1 000 μg·g －1左
右［8］，不能满足现今科研的要求． 高效液相色谱法
检测速度快、检出限低，能够达到μg·kg －1级、测定结
果精确度高，能够与紫外检测器、质谱仪和荧光检测
器联用来改善方法的灵敏度［9 ～ 12］，但是仪器贵重，
不能批次测定，携带不便，不适于现场的快速检测．
酶联免疫吸附法即 ELISA 法利用抗软骨藻酸抗体
和抗原之间的特异反应，来测定样品中 DA的浓度，
自 Newsome等［13］于 1991 年开发了 DA的 ELISA方
法之后，ELISA法得到了很大的发展．在国外该方法
的准确度、精密度都有了很大的改善，检出限已经能
够达到 0. 1 ng·mL －1［14］． 在国内，对于软骨藻酸
ELISA 方法的研究还较少，还没有开发出成熟的
ELISA试剂盒．成熟的 ELISA 试剂盒，便于携带，样
品前处理相对简单，但是目前所开发的试剂盒多为
间接竞争 ELISA试剂盒，需要制备 DA 与蛋白质的
偶联物并进一步加入酶标二抗，检测时间一般在 2
～ 3 h 之间，因此开发出更加快速、操作简单、准确
的试剂盒已经成为了软骨藻酸快速检测的主要
趋势．
DOI:10.13227/j.hjkx.2012.02.049
环 境 科 学 33 卷
本研究基于前期制备软骨藻酸单克隆抗体的基
础上［15］，利用蛋白质偶联技术将 DA 与辣根过氧化
物酶(HRP)偶联，直接利用抗体和酶标抗原的特异
性免疫反应，建立直接竞争 ELISA 法快速检测 DA，
检测时间相较于间接竞争 ELISA法能够提高 1 h 左
右，为我国记忆缺失性贝毒监测提供更加快速、稳定
的分析方法．
1 材料与方法
1. 1 试剂与仪器
辣根过氧化物酶(HRP)购于上海生工、明胶购
于中国国药集团、软骨藻酸单克隆抗体为本实验室
自制．
其他试剂与仪器同本课题组刘元媛［16］的研究．
1. 2 实验方法
1. 2. 1 酶标抗原的制备
DA为小分子，本身并不能产生免疫反应． 本研
究将 DA与标记物 HRP偶联制得酶标抗原，采用碳
化二亚胺法［17，18］合成酶标抗原，取 200 μg 软骨藻
酸(DA) ，分别加入 0. 4 mg EDC，0. 3 mg NHS［19］，
25℃反应 2 h，随后置于 4℃的冰箱里过夜．次日，取
出反应液加入 500 μg HRP，25℃反应 3 h，使用截留
分子量为10 000的超滤管离心． 用移液枪取出离心
后的内管液体，PBS 稀释，分装． 考马斯亮蓝法测定
其蛋白质浓度．
1. 2. 2 棋盘滴定法确定酶标抗原和抗体最佳使用
浓度
将制得的单克隆抗体用包被缓冲液分别按 1∶ 200、
1∶ 400、1∶ 800、1∶ 1 600倍数稀释，每孔加入100 μL，同时
加入一列生理盐水作空白对照，一列阴性血清做阴性
对照，4℃包被过夜．次日倒出孔内液体，洗涤液洗涤 3
次，拍干．再在各孔中加入满孔 0. 5 % BSA，37℃封闭
1 h．将制得的 DA-HRP 稀释后，顺序加入，稀释比为
1∶ 200、1∶ 400、1∶ 800、1∶ 1 600，每孔加100 μL，37℃包被
1 h．洗涤拍干．每孔加新鲜配置的底物溶液 100 μL，室
温显色 10 min．每孔加终止液 50 μL．在 450 nm及 630
nm处测定D值．
1. 2. 3 最佳封闭液、封闭时间和封闭温度的选择
包被 100 μL抗体稀释液(浓度为 1. 2. 2 节确定
的最佳抗体使用浓度)至酶标板中，加入一列生理
盐水作空白对照，一列阴性血清做阴性对照，4℃包
被过夜．次日倒出孔内液体，洗涤液洗涤 3 次，拍干．
分别加入 1% BSA、0. 5% BSA、0. 1%明胶、1%明胶
作为封闭液封闭 1 h，倒出拍干，加入最佳工作浓度
的 DA-HRP 100μL，温育 1 h，洗涤拍干，每孔加新鲜
配置的底物溶液 100 μL，室温显色 10 min． 每孔加
终止液 50 μL．在 450 nm及 630 nm处测定 D值，选
定最佳封闭液．并在最佳封闭液的条件下，分别测定
封闭 30、60、90 min 时，在 25、37、43℃ 这 3 种不同
温度下的 D值．
1. 2. 4 最佳温育时间和温度的选择
包被、封闭过程同上，加入酶标抗原，在 25、37、
43℃条件下分别温育 30、60、90、120 min，选定最佳
温育时间和温度．
1. 2. 5 直接竞争 ELISA方法的建立
每孔加入 100μL最佳使用浓度的抗体稀释液，
4℃，包被过夜． 次日倒出孔内液体，洗涤液洗涤 3
次，每次 3 min，拍干．加入最佳封闭液，按 1. 2. 3 节
所确定的最佳封闭时间和温度封闭，加入最佳工作
浓度的 DA-HRP 50 μL，将 DA 用 PBS 配成 0、1、
10、50、250、500、1 000 ng·mL －1的系列溶液，每孔
加入 50 μL，按 1. 2. 4 节所确定的温育时间和温度
温育，洗涤拍干，显色测定．
1. 2. 6 加标回收率的测定
在样品中分别添加 1、5、10 和 50 ng·mL －1的
DA，按照 1. 2. 5 节的建立的 ELISA 方法测定浓度，
计算样品加标回收率．
2 结果与讨论
2. 1 酶标抗原浓度的测定及鉴定
图 1 软骨藻酸、HRP、酶标抗原紫外扫描图
Fig. 1 UV scanning of DA，HRP，DA-HRP
反应完成后，通过考马斯亮蓝法测定反应物蛋
白质 浓 度，为 8. 36 mg·mL －1，稀 释 至 大 约 1
mg·mL －1 ． 将 反 应 物 (1 mg·mL －1 )、DA (1
mg·mL －1)、HRP(1 mg·mL －1)用紫外光谱进行特征
扫描．扫描结果如图 1 所示． 从中可以看出，DA 的
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2 期 王茜等:软骨藻酸直接竞争 ELISA方法的建立及优化
最大吸收波长为 242 nm，HRP 在 403 nm 处有一个
特征吸收峰，DA-HRP 的紫外扫描图像与 DA、HRP
有很大的区别，因此可以判断 HRP成功的偶联到了
DA分子上．
2. 2 酶标抗原和抗体最佳使用浓度的确定
通过酶标板的包被、封闭、显色等过程测定各孔
D值，结果如表 1 所示．
选取 P /N值≥2. 1 的且 D 值在 0. 8 ～ 1. 2 之间
的那一组数值作为抗原抗体最佳工作浓度［20］．表 1
显示，当酶标抗原稀释比为 1∶ 400，抗体稀释度为 1∶
200 时，D值为0. 905 0，P /N = 7. 39，≥2. 1，抗体稀释
比 1∶ 200 和酶标抗原稀释比 1∶ 200 这组浓度的 D值
与 P /N值也符合要求，但是抗原浓度较高，会使非
特异性结合增强，本底值相对偏高［21］，P /N值减小，
另外酶标抗原 1∶ 400 的稀释度更能节约抗原，降低
成本，因此选用抗体1∶ 200，酶标抗原1∶ 400为最佳
表 1 酶标抗原和抗体最佳使用浓度的确定
Table 1 Optimal concentration of DA-HRP and antibody
抗原稀释浓度
抗体稀释浓度
1∶ 200 1∶ 400 1∶ 800 1∶ 1 600 阴性对照 空白
1∶ 200 0. 827 5 0. 362 0 0. 108 5 0. 079 5 0. 106 0 0. 064 5
1∶ 400 0. 905 0 0. 224 5 0. 096 0 0. 100 5 0. 113 0 0. 063 0
1∶ 800 0. 519 0 0. 231 5 0. 125 0 0. 081 5 0. 125 0 0. 064 0
1∶ 1 600 0. 460 0 0. 406 5 0. 107 5 0. 131 5 0. 097 0 0. 075 0
工作浓度．
2. 3 最佳封闭液、封闭时间、封闭温度的确定
图 2 不同封闭液对于 P /N和 D值的影响
Fig. 2 Influence of blocking solution
在 1∶ 400 的酶标抗原稀释度和 1∶ 200 的抗体稀
释度的条件下，本研究比较了 1% BSA、0. 5% BSA、
0. 1%明胶、1%明胶这 4 种封闭液的效果，结果如图
2 所示．在抗原或抗体包被后，常加入封闭液以去除
微孔表面残留的吸附位点． 经封闭液处理后酶标板
非特异性结合位点被封闭，可以降低非特异性的背
景显色，提高特异性和灵敏度． 通过图 2 可以看出，
使用 1%的明胶时 D值较接近于 1，P /N值≥2. 1，同
时明胶做封闭液的阴性对照的 D值为0. 099 0，对阴
性值的影响不大，所以选用 1%明胶作为封闭剂．
另外封闭时间和温度对封闭效果也有重大影
响．如图 3 所示．
当封闭温度为 25℃时，随封闭时间增加 P /N值
随之也增加，但是当封闭时间过长时会造成封闭液
的难于清洗与能源的浪费;当温度为 37℃时，封闭 1
h效果最佳，当封闭温度增加到 43℃时，封闭 30 min
效果较佳，当封闭时间加长时，显色效果明显下降，
因为较高温度较长时间的封闭，抗体抗原的敏感度
下降．通过比较选择 37℃封闭 1 h．
图 3 封闭时间和温度对 P /N的影响
Fig. 3 Influence of blocking time and temperature
2. 4 最佳温育时间和温度的选择
本研究通过控制温育温度和温育时间，确定了
温育时间和温度(图 4)．酶对热变温度很敏感，酶免
疫测定中常用的反应温度 25 ～ 37℃，随着温度的升
高，酶促反应速度加快．当温度较低为 25℃时，则需
要较长的温育时间，因为要使液相中的抗原或抗体
与固相上的特异抗原或抗体完全结合，必须在一定
的反应条件下反应一定时间［22］;当温度升高至为
43℃时，酶促反应速度较快，在 30 min 时就可以达
到较好的效果，当在 43℃情况下温育 2 h时，显色效
果较差，可能是较长时间的高温温育使液体蒸发，非
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环 境 科 学 33 卷
特异性结合紧附于反应孔周围，难以清洗彻底［23］，
另外较高的温育温度也可使部分酶失活．
图 4 温育时间与温育温度对 P /N的影响
Fig. 4 Influence of incubation time and incubation temperature
2. 5 直接竞争 ELISA方法的建立
加入不同浓度的 DA标准物质后，DA与其酶标
图 5 ELISA酶联免疫吸附试验 DA浓度与 D值变化关系图
Fig. 5 Relationship between DA concentration and D
记物 DA-HRP 竞争与抗体结合，加入的 DA 浓度越
高，与抗体竞争结合的 DA-HRP 就越少，显色后的 D
值就越低，因此以 DA 浓度做为横坐标，D 值做为纵
坐标，得到 D值随 DA浓度变化的关系，如图 5所示．
同时，以结合率 B /B0 为纵坐标，DA 浓度的对
数为横坐标优化了酶联免疫吸附法的标准曲线，如
图 6，可以看出结合率和 DA 浓度的对数呈线性关
系，线性回归方程为 y = － 0. 156 08 x + 0. 986 6，R2
= 0. 982 97，根据标准曲线求得半数抑制率 IC50为
1. 32 μg·mL －1，从中可以看出该直接竞争 ELISA 法
的线性范围为 5 ～ 1 000 ng·mL －1，以抑制率为 90%
时的浓度作为最低检出限，约为 3. 58 ng·mL －1 ．
图 6 ELISA酶联免疫吸附试验标准曲线
Fig. 6 Standard curve of cdELISA
2. 6 加标回收率的测定
取阴性样本经添加一定浓度的标准 DA，回收
率和变异系数如表 2 所示，可以看出变异系数小于
15%［24］，在正常范围内，可知本研究的直接竞争
ELISA法一般检测要求．
表 2 加标回收率和变异系数
Table 2 Sample recovery and coefficient of variation
样品添加值
/ng·mL －1
样品数
/个
平均值
/ng·mL －1
加标回收率
/% 孔间变异系数(Cv)/%
1 10 1. 14 114. 40 10. 90
5 10 4. 75 95. 10 12. 30
10 10 10. 98 109. 80 8. 23
50 10 44. 36 88. 70 8. 94
3 结论
(1)本研究利用碳化二亚胺法成功将辣根过氧
化物(HRP)与软骨藻酸(DA)偶联，制得 DA-HRP，
将 DA-HRP作为固相包被在酶标板上，加入 1%明
胶做封闭液，37℃封闭 1 h，洗涤，加入抗 DA单克隆
抗体和 DA，37℃温育 1 h，使固相 DA-HRP和游离的
DA竞争与抗体发生特异性结合，加入显色液显色，
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2 期 王茜等:软骨藻酸直接竞争 ELISA方法的建立及优化
测定 D值，相应得到一条标准曲线:y = － 0. 156 08x
+ 0. 986 6，R2 = 0. 982 97，方法的加标回收率在
88% ～120%之间，变异系数在 8% ～ 20%之间，检
出限 为 3. 58 ng·mL －1，符 合 国 际 规 定 的 20
μg·g －1［25］安全限值的测定要求．
(2)本研究基于直接竞争 ELISA，因此检测时间
比间接竞争 ELISA法短，成熟的直接竞争 ELISA 试
剂盒检测时间可缩短至 1. 5 h 左右，大大缩短了检
测时间．因为本方法携带方便，检出限低，适用于现
场快速监测，具有较好的发展潜力．
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