全 文 ：第2 3 卷 增刊
2 X (科 年 9月
分析测试学报
FE Nl xCES H I U E xBA O (佃川丑 l` In咖 men回 人 n s映1 5 )
V心通. 2 3
阮 p. 2 《 X )4
液相色谱 一 电喷雾离子阱质谱法
测定贝类中软骨藻酸
卫 锋 ’ , 赵守成 ’ , 李大志 2
( 1
. 辽宁出入境检验检疫局 , 辽宁 大连 1 以x〕l : 2 . 大连化学物理研究所 , 辽宁 大连 1 60 23 )
记忆缺失性贝类毒素 (~ es i C hs el 价 hs to石 n
, 简称 SA P )主要成分软骨藻酸 ( d~ i C ac 记
, 简称 D )A
是一种氨基酸类的生理活性物质 (图 l ) , 因最早从红藻属的树枝软骨藻 ( C h on 面 a a~ at )分离出来而被命名为软骨藻酸 。 自 19 87 年加拿大首次发生集体贝类食品中毒事件后 , 人们从赤潮藻类中的硅
藻属 ( id a omt )的多列尖刺菱形藻 ( in tz cs h pun ge ns f . mu ih se ier s )中检测到了 DA , 随后 , 美国 、 加拿大 、 北
欧一些国家 , 澳大利亚 、 日本等国先后从紫贻贝 ( my ilt u , de iul s ) 、 扇贝 ( ep c ent ~ m us )
、 文蛤 ( ca il ast
ch ion e) 等贝类体内以及鳍鱼和石蟹的内脏中检测到了 DA 。 鱼 、 贝通过滤食毒藻 , 将 D A 富积在体
内 , 人类因食用被 DA 污染的鱼 、 贝而中毒 , 中毒症状包括恶心 、 呕吐 、 腹痛 、 腹泻等 , 同时有晕眩 、
昏迷等类似神经性中毒症状 , 永久性丧失部分记忆是此类中毒后的典型特征 , 因此它被称为记忆缺
失性贝类毒素 。 美国 印A 将它确定为 4种主要海洋生物毒素之一 , 加拿大首先制定了 DA 的安全剂
量为 20 . 0 拼g电 贝肉川 , 随后 , 欧洲 、 日本也相继将该种毒素列为贝类常规检测项目 。
本文在高效液相色谱法 [ 2 ]和毛细管电泳法 「3 }测定贝类中软
骨藻酸方法的基础上 , 采用电喷雾离子阱质谱法定量和确认分析
贝类中 DA 。 该方法既可定量又可做结构确认 , 是检测贝类中 DA
的理想方法 。
1 实验部分
,
.
, 试剂与材料
山厂co OH 一丫` -
} {
图 l 软骨藻酸的分子结构
试剂 : iM il 一 Q纯水 。 色谱纯甲醇 、 乙腊 。 优级纯三氟乙酸 ( TFA , nE gl an d ) 。 3 mL 忧 一 SXA 柱
( uS eP l e o
,
U SA )
。
DA e S
一
I C 校正液 (以 , 10 拼g / mL ) 由 N a it o n a l Re~ h oC
u cn il e an ad a 提供 。 0 . 5
onI L几柠檬酸溶液 ( p H 二 3 . 2) : 40 , 4 9 一水柠檬酸和 14 , 。 g 柠檬酸三按溶解于 4仪〕mL 水中 , 以浓氨水
调声 二 3 . 2 , 加入 50 mL 乙睛 , 完全混合溶解后 , 以水定容至 s o mL 。 软骨藻酸标准溶液 : 以乙腊 -
水 (体积比 1 : 9) 稀释 DA CS 一 lC 校正液为含 DA 1 . 0 、 2 . 5 、 10 . 0 、 25 . 0 此m/ L 标准溶液 。 软骨藻酸样
品添加溶液 : 称取固体软骨藻酸 (纯度大于 90 % , iS 邵an hC俪械 , C o . )以乙腊 一 水 (体积比 l : 9) 配成
约 2 0 拜gm/ L 溶液 (准确浓度以 DACs 一 lC 校正溶液校正 ) 。
1
.
2 仪器与设备
美国 iF n igan 公司比Q 型液相色谱 一 质谱联用仪 , 配有 ES (I 电喷雾离子化 )源及 CL QI
.
2 数据处
理系统 ; 美国安捷伦高效液相色谱仪 ( PH l o 系列 ) ; ZJ 一 1 型组织均质器 (铁道部电气化设计研究院
四方电器设备厂 ) , 兀 L一 1酩 型台式高速离心机 (上海医用分析仪器厂 ) , DL S 一 2A 型离心机 (北京医用
离心机厂 ) , X W 一 80A 型涡旋混合器 (上海精科实业有限公司 ) , 明 一 25 0 型超声波清洗器 (昆山市淀山
湖检测仪器厂 ) 。
,
.
3 测定方法
1
.
3
.
1 提 取 称取样品 5 . 0 9 (精确到 0 . 1 9 )于 50 mL 加盖离心管中 , 加入 10 mL 甲醇 一 水 (体积比
1 : l) 溶液 , 涡旋混匀 1而 n , 超声提取 5 而 n , 以每分钟 4 以刃转离心 20 而 n , 使固液两相彻底分离 。
移取上清液至 25 mL 容量瓶中 , 残渣再加入 s mL 甲醇 一 水 (体积比 l : l) 重复提取两遍 , 上清液移入
25 mL 容量瓶中 , 以水定容至刻度 , 混匀 。
1
.
3
.
2 净 化 取上述粗提取液 5 . O rnL 移入依次经 6 mL 甲醇 , 3 mL 水 , 3mL 甲醇 一 水 (体积比 l : l)
处理过的 砚 - SAX 柱上 , 待液体以 1滴 /秒的速度流出后 , 再依次用 s .ml 乙腊 一 水 (体积比 1 : 9) ,
一 2 2 0 一
第 5 期 卫 峰等 : 液相色谱 一 电喷雾离子阱质谱法测定贝类中软骨藻酸 增刊
o
.
s mL 柠檬酸洗脱液以 1滴 /秒的速度过柱 , 弃去流出液 , 最后用 Z mL 柠檬酸洗脱液洗脱吸附在柱
子上的软骨藻酸 , 待测 。
注意 : 在液体过柱时 , 当液体凹液面下端与柱填料上端水平时 , 停止液体流出 , 避免 CL 一 SAX
柱填料与空气接触 。
,
.
4 测 定
1
.
4
.
1 色谱条件 色谱柱 : z O RB xA BS C 18, 150 x 2 . l ~ i(
.
d
.
)
,
5 拼m 。 流动相 : 乙睛 一 0 . 1%三氟
乙酸 (体积比 13 : 8 7) 。 流速 : 0 . Z .ml m/ ion
,
.
4
.
2 质谱条件 ESI 源 ; 源电压 4 . O k;v 正离子检测 ; 毛细管温度 24 0 ℃ , 毛细管电压 12 ;V 鞘气
( N
Z
)流速 : 50 a ht ; 辅助气流速 : 5 a ht 。 采用一级全扫描质谱 , 二级全扫描质谱 ( m / : 31 2一令 m / : 2 94 ,
26 6
, 抖 s ) , 三级全扫描质谱 ( n `八 2 6 we 少m / : 2 4 5 , 2 20 , 19 3 ) 3种方式分别检测准分子离子 ( M + H ) 十 和
碎片离子 ; 相对碰撞能 : 2 % ; 质谱采集范围 : 150 一 4 0 u 。
2 结果与讨论
2
.
1 OA 的质谱研究
2
.
1
.
1 O A 的全扫描质谱 在 ( + ) E SI 一 M S全
扫描一级质谱条件下对 DA 进行质谱分析 , 观测
到准分子离子峰 m / : 3 12 (M + H ) 十和 DA 分子加
钠离子峰 m 众 3 34 ( M + N a ) + 。 见图 a2 。
2
.
1
.
2 D A 的二级串联质谱 采用优龙 SI 一 M S “
离子阱技术对准分子离子 。 : 众 3 12 (M + H ) +进行
M S 一 M S 分析 , 得到 M S Z质谱图 (相对碰撞能量
2 % )
。 见图 bZ M S 一 M S 质谱分析得到 m z/ 2 94
(M + H 一 H必 ) 十 , m / : 26 6 (M + H 一 H CO O H ) 十和
m / : 24 8 (M
+ H 一 ZH Co o H )
+ 。 这 3个离子的加
合量用于 DA 的定量分析 。
2
.
1
.
3 O A 的三级串联质 谱 采用 CL / E SI 一
M S
“ 离子阱技术对 m / : 2 6 ( M + H 一 H C 0 0 H ) 十
离子进行 M S 一 MS 一 MS 分析 , 得到 MS 3质谱图
(相对碰撞能量为 2 % ) 。 见图 c2 。 M S 3质谱分
析得到 m / : 24 8 (2 6 一 H刃 ) 十 , m / : 2 20 ( 2 6 -
HC OO H )
十 和 n 乙 / : 19 3 ( 2 6 6 一 CO OH一 CH= N H ) + ,
MS
3质谱图用于样品中 DA 的确认分析 , 如果浓
度相当的标准和样品中 m / : 24 8 , 220 , 193 离子
的丰度比一致 (相差 20 % 以内 ) , 可以确认样品
中 DA 的存在 。
2
.
2 方法的专属性
将空白贝类样品色谱图与空 白样品加入 DA
得到的色谱图进行比较 , 表明贝类样品基体不
干扰测定 , SAX 柱有效去除了基体的干扰 。
2
.
3 工作曲线和线性范围
取空白贝类样品 , 加入 DA 系列标准溶液 ,
配成以 含量为 0 . 2 , 1 . 0 , 5 . 0 , 10 . 0 , 20 . 0 拜gg/
的贝类样品 , 按 1 . 3 项操作 , 建立标准曲线 , 结
果表明 , DA 在 0 . 2 一 20 , 0 产g乍范围内含量与峰
~撰鲤琪羚座
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2 , . 。 ” ,、杯’ l!l 溉 . .lt,.t :ilI 菇淞 , ! , 。 ,。
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320 3 60
图 2 10 拼 g / nIL D a ( CA S: 14 27 7 一 97 一 5 , MW3 1 1
.
3 )
标准溶液正离子电喷雾一级质谱图 (a) 、 二级质谱图
( 。八 3 12~ m八 2叭 , 2肠 , 对 s ) (b )及三级质谱图 ( m八
2台宁卞 m八 24 8 , 2 2 0 , 1 93 )
一 2 2 1 一
第2 3 卷 分析侧试学报 增刊
面积有良好的线性关系 , 回归方程 Y = 1 . o x l护 x 一 1 . 69 x 10 5 , r 二 0 . 9 9 40
2
.
4 回收率 、 精密度和检出限
本实验进行 3个添加水平的试验 , 空白样品加标后按 1 . 3方法处理样品 , 每一水平测定 6 次 , 平
均回收率为 % . 87 % , 相对标准偏差为 2 . 76 % 。 见表 1。 本方法样品检出限为 0 . 2 拜眺。
表 1 方法的回收率和精密度
加人量
切 ^ / 10 一 6
测定量
切 r / 10 一 6
平均回收率
R / % RS
D sr / %
1
.
0
5
.
0
10
.
0
0
.
97
士 0 . 03
4
.
84 士 0
.
13
9
.肠 士 0 . 25
3
.的
2
.的
2
.
59
97卯
参考文献 :
11 ] LA 双下巴 NCE J F , 认 U B P , CLE OR XU C , et 以 . 伽m详` so n Of VU 曲印印 it o n an d e lo t or s p ar y ~
s衅 tm me 匀 for the
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e
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19 4
,
659 ( l )
: 1 19 一 126
.
「2] 卫 锋 , 程 防 , 宫静宏 , 等 . 高效液相色谱法测定贝类中丧失记忆性贝类毒素 一 软骨藻酸 . 色谱 , 2X() l , 19 ( 3) :
24 8 一 25 0
.
汇3] 卫 锋 , 王竹天 . 毛细管电泳法分析贝类食品中软骨藻酸 . 中国食品卫生杂志 , 20 3 , 巧 ( 2) : 107 一 I的 .
L i q u id Ch mma ot g 甩Ph y w it h E l
e e tor s Par I
o n
一
t ar P M as s fo r ht e D e t e mr i
n a t i o n
o f D o 们n o ie A e id in Sh e l价 s h
桃1 eF n g l , ZHA O Sh ou 一 e h明 J , 1 n a 一 hz i Z
( 1
.
U ao in 昭 E n yt 一助 t Isn卿 t fo n a司 印助叮烈 i二 B~ of p RC
,
alD汕 1 1以 x〕l , C h i na : 2 . alD ian Inst i tut e of
hc 俪cal hP isr cs , hc i~ A c a d , y of 冤 cen se , Dal ian l 以刀3 , Chi na )
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,
se le ict ve an d se sn it ve 枕 / ES I 一 MS ” m e ht ed ~ de ve l叩记 for ht e qU an it at ive de t e r in ant ion
of do咖 ic ac 记 in hs el 价hs . Saln p les we er e x it 习 c edt 杭ht me ht an o l 一 w a te r fo ll o we d 坊 e lean 一叩 of ht e e x t阳 c st iw ht
s tor n g an ion e xc h an g e so ild phase
e x t拍 c iot n c a rt ir d罗 ( Sp E 3 mL 优 一 SXA ) . A 二ve 倪 d 户ase Hp l刀 us 吨 a
伽 bi le 户ase of ac e to in iltr e 一 w a te卜 itr flu ~
at ic ac 记 ( 13 : 86 . 9 : 。 . 1% 场 v o l~ ) 朋 d an e lec tosr p扭 y i ,
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qu an it以 ion . aD at of d o om ic ae id ofr CL 了佗 5 1一 MS 3~
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(上接第 2 19 页 )
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.
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, 氏巧i ng l 。义犯9 , C hi na ; 2 · C ha 卿h un Inst it uet of
Ap lP ied C he 而 s卿 , C hi nes A
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