全 文 ：华西医大学报
J W C U孔叹 S 19 9 5
; 2 6 ( l )
1
3 3~ 3 7
中华贝母幼茎培养及器官与体细胞胚的发生 `
张 浩 陈泽彬` ’ 杨亮先”
药学院
内容摘要 以中华贝母 ( F rti li a ri a : i ni ca 5 . C . C he n) 初萌发幼茎为外植体 , 在 M S 培养基上 用
N A A
、
2
,
4
一
D
、
6 B A
、
Kt 等四种植物激素不同组合对其进行诱导 ,并以 M S + N A A lm g / L + 6 B A 0 . s m g /
L 为继代培养基 ,进行再生小鳞茎 , 器官分化及体细胞胚形成的研究 。 结 果表 明 : 组织培养中 , 中华贝母
再生鳞茎可通过三种方式产生 。
关键词 中华贝母 再生鳞茎 愈伤组织 体细胞胚
中华贝母 (尸 r i t i zz a r i a , i , , i c a 5 . C . C h e n ) 是
生长于 中国西南高寒 山 区 的一种珍贵药用植
物 ,其干燥鳞茎作为中药川 贝母中的 “ 炉 贝 ” 供
药用 ,功能清热润肺 、 止咳化痰 「` j 。 由于 自然生
长环境高达海拔 3 0 0 Om 以上 ,野生资源现 已十
分稀少 ,其生长所依赖的特殊气候 、 温度 、 土壤
条件 ,使人工引种受到了诸多限制 。 近年来 , 利
用植物组织培养技术 , 已对多种植物的不同器
官进行了离体培养研究 , 建立了快速繁殖的无
性 系 , 这为资源 的保存和开发利用开辟 了新的
途径「’ 二。 我们特以中华贝母初萌发幼茎为材料 ,
进行了再 生鳞茎和愈伤组 织诱导及培 养的研
究 , 并对器官分化及体细胞胚形成进行 了宏观
和微观的观察 。
1 材料和方法
取洪雅 山区药农移植野生鳞茎于住房附近
山坡竹林下生长 3 年 , 3 月上 旬在土 中萌发为
2~ 3
.
cs m 的半野生幼茎为材料 。 洗净幼茎 , 置
7 5% 乙醇中浸 3 。 秒 , 0 . 1% 升汞溶液 中消毒 15
分钟 ,无菌水冲洗 5 次 , 无菌操作下将茎段切成
3 m m 厚 小 块 , 接 种 于 M t , r a s h i g e a叼 S k o o g
( M )S 固体培养基 ,植物激素组 合见附表 . 培 养
基附加蔗糖 3% ,琼脂粉 1% , p H S . 8 ,置于 23 士
1℃下暗培养 。
接种 7 周时 ,统计诱导率并进行继代培养 ,
继代培养基采用 M S 十 a 一蔡 乙酸 ( N A A ) l m g /
L + 6
一节 基氨基嗦吟 ( 6B A ) 。 . s m g / L , 以后每
隔 3 。一 4。 天转代一次 。 取生长旺盛的培养材
料 , 用 F A A 液 固定 , 石 蜡包埋 , 亮绿 染色 、 制
片 , 光学显微镜下观察 。
, 国家 自然科学基金资助项目
, * 本院 1 9 9 3 届毕业生
2 实验结果
.2 1 愈伤组织的诱导及鳞茎的产生
幼茎接种 l 周时 ,体积明显膨大 , 紧裹茎段
的幼 叶由于膨大而从茎段上脱落入培养基 ,并
发生卷曲 。 接种 2 周时 ,外植体体积已增大到接
种时的几倍至十几倍 , 切 口处产生肉眼可见的
粗糙突起 , 突起物半透明 , 此后可观察到如下现
象 。
.2 L I 小鳞 茎的 直接产生 切口 处粗糙 突起
物数量较少 , 每一外植体上有 1一 13 个不等 , 初
起时为半透明状小圆点 , 继而增大变白 ,到接种
3 周时 , 白色小点 已明显发育成小鳞茎 , 直径可
达 2一 3 m m 。 接种 7 周转代前观察 ,大的鳞茎直
径达 6 一 7 m m , 小的 仅有 l 一 Zm m , 悬殊 很大
(照 片 l a ) 。 在整个诱导期间 . 不断有新的小鳞
茎从外植体上产生 ,后产生的个体直径较小 ,而
在同期长出的鳞茎 中 , 如一个外植体上鳞茎 个
数少 , 则单个鳞茎的体积则相对较大 。 卷曲的幼
华西医大学报
JW CU孔叹 S1 9 9 5
; 2 6 ( l)
1
3 3 ~ 37
中华贝母幼茎培养及器官与体细胞胚的发生 `
张 浩 陈泽彬` ’ 杨亮先”
药学院
内容摘要 以中华贝母 ( Fi rti la i ra :i i na c5 . C . Ce h) n初萌发幼茎为外植体 , 在 M S 培养基上 用
N A A
、
2
,
4
一
D
、
6 B A
、
Kt 等四种植物激素不同组合对其进行诱导 ,并以 M S + N A A lm g / L + 6 B A 0 . s m g /
L 为继代培养基 ,进行再生小鳞茎 , 器官分化及体细胞胚形成的研究 。 结 果表 明 : 组织培养中 , 中华贝母
再生鳞茎可通过三种方式产生 。
关键词 中华贝母 再生鳞茎 愈伤组织 体细胞胚
中华贝母 (尸 r i t i zz a r i a , i , , i c a 5 . C . C h e n ) 是
生长于 中国西南高寒 山 区 的一种珍贵药用植
物 ,其干燥鳞茎作为中药川 贝母中的 “ 炉 贝 ” 供
药用 ,功能清热润肺 、 止咳化痰 「` j 。 由于 自然生
长环境高达海拔 3 0 0 Om 以上 ,野生资源现 已十
分稀少 ,其生长所依赖的特殊气候 、 温度 、 土壤
条件 ,使人工引种受到了诸多限制 。 近年来 , 利
用植物组织培养技术 , 已对多种植物的不同器
官进行了离体培养研究 , 建立了快速繁殖的无
性 系 , 这为资源 的保存和开发利用开辟 了新的
途径「’ 二。 我们特以中华贝母初萌发幼茎为材料 ,
进行了再 生鳞茎和愈伤组 织诱导及培 养的研
究 , 并对器官分化及体细胞胚形成进行 了宏观
和微观的观察 。
1 材料和方法
取洪雅 山区药农移植野生鳞茎于住房附近
山坡竹林下生长 3 年 , 3 月上 旬在土 中萌发为
2~ 3
.
cs m 的半野生幼茎为材料 。 洗净幼茎 , 置
7 5% 乙醇中浸 3 。 秒 , 0 . 1% 升汞溶液 中消毒 15
分钟 ,无菌水冲洗 5 次 , 无菌操作下将茎段切成
3 m m 厚 小 块 , 接 种 于 M t , r a s h i g e a叼 S k o o g
( M )S 固体培养基 ,植物激素组 合见附表 . 培 养
基附加蔗糖 3% ,琼脂粉 1% , p H S . 8 ,置于 23 士
1℃下暗培养 。
接种 7 周时 ,统计诱导率并进行继代培养 ,
继代培养基采用 M S 十 a 一蔡 乙酸 ( N A A ) l m g /
L + 6
一节 基氨基嗦吟 ( 6B A ) 。 . s m g / L , 以后每
隔 3 。一 4。 天转代一次 。 取生长旺盛的培养材
料 , 用 F A A 液 固定 , 石 蜡包埋 , 亮绿 染色 、 制
片 , 光学显微镜下观察 。
, 国家 自然科学基金资助项目
, * 本院 1 9 9 3 届毕业生
2 实验结果
.2 1 愈伤组织的诱导及鳞茎的产生
幼茎接种 l 周时 ,体积明显膨大 , 紧裹茎段
的幼 叶由于膨大而从茎段上脱落入培养基 ,并
发生卷曲 。 接种 2 周时 ,外植体体积已增大到接
种时的几倍至十几倍 , 切 口处产生肉眼可见的
粗糙突起 , 突起物半透明 , 此后可观察到如下现
象 。
.2 L I 小鳞 茎的 直接产生 切口 处粗糙 突起
物数量较少 , 每一外植体上有 1一 13 个不等 , 初
起时为半透明状小圆点 , 继而增大变白 ,到接种
3 周时 , 白色小点 已明显发育成小鳞茎 , 直径可
达 2一 3 m m 。 接种 7 周转代前观察 ,大的鳞茎直
径达 6 一 7 m m , 小的 仅有 l 一 Zm m , 悬殊 很大
(照 片 l a ) 。 在整个诱导期间 . 不断有新的小鳞
茎从外植体上产生 ,后产生的个体直径较小 ,而
在同期长出的鳞茎 中 , 如一个外植体上鳞茎 个
数少 , 则单个鳞茎的体积则相对较大 。 卷曲的幼
华西医大学报
J W C U孔叹 S 19 9 5
; 2 6 ( l )
1
3 3 ~ 3 7
中华贝母幼茎培养及器官与体细胞胚的发生 `
张 浩 陈泽彬` ’ 杨亮先”
药学院
内容摘要 以中华贝母 ( F rti li a ri a : i ni ca 5 . C . C he n) 初萌发幼茎为外植体 , 在 M S 培养基上 用
N A A
、
2
,
4
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、
6 B A
、
Kt 等四种植物激素不同组合对其进行诱导 ,并以 M S + N A A lm g / L + 6 B A 0 . s m g /
L 为继代培养基 ,进行再生小鳞茎 , 器官分化及体细胞胚形成的研究 。 结 果表 明 : 组织培养中 , 中华贝母
再生鳞茎可通过三种方式产生 。
关键词 中华贝母 再生鳞茎 愈伤组织 体细胞胚
中华贝母 (尸 r i t i zz a r i a , i , , i c a 5 . C . C h e n ) 是
生长于 中国西南高寒 山 区 的一种珍贵药用植
物 ,其干燥鳞茎作为中药川 贝母中的 “ 炉 贝 ” 供
药用 ,功能清热润肺 、 止咳化痰 「` j 。 由于 自然生
长环境高达海拔 3 0 0 Om 以上 ,野生资源现 已十
分稀少 ,其生长所依赖的特殊气候 、 温度 、 土壤
条件 ,使人工引种受到了诸多限制 。 近年来 , 利
用植物组织培养技术 , 已对多种植物的不同器
官进行了离体培养研究 , 建立了快速繁殖的无
性 系 , 这为资源 的保存和开发利用开辟 了新的
途径「’ 二。 我们特以中华贝母初萌发幼茎为材料 ,
进行了再 生鳞茎和愈伤组 织诱导及培 养的研
究 , 并对器官分化及体细胞胚形成进行 了宏观
和微观的观察 。
1 材料和方法
取洪雅 山区药农移植野生鳞茎于住房附近
山坡竹林下生长 3 年 , 3 月上 旬在土 中萌发为
2~ 3
.
cs m 的半野生幼茎为材料 。 洗净幼茎 , 置
7 5% 乙醇中浸 3 。 秒 , 0 . 1% 升汞溶液 中消毒 15
分钟 ,无菌水冲洗 5 次 , 无菌操作下将茎段切成
3 m m 厚 小 块 , 接 种 于 M t , r a s h i g e a叼 S k o o g
( M )S 固体培养基 ,植物激素组 合见附表 . 培 养
基附加蔗糖 3% ,琼脂粉 1% , p H S . 8 ,置于 23 士
1℃下暗培养 。
接种 7 周时 ,统计诱导率并进行继代培养 ,
继代培养基采用 M S 十 a 一蔡 乙酸 ( N A A ) l m g /
L + 6
一节 基氨基嗦吟 ( 6B A ) 。 . s m g / L , 以后每
隔 3 。一 4。 天转代一次 。 取生长旺盛的培养材
料 , 用 F A A 液 固定 , 石 蜡包埋 , 亮绿 染色 、 制
片 , 光学显微镜下观察 。
, 国家 自然科学基金资助项目
, * 本院 1 9 9 3 届毕业生
2 实验结果
.2 1 愈伤组织的诱导及鳞茎的产生
幼茎接种 l 周时 ,体积明显膨大 , 紧裹茎段
的幼 叶由于膨大而从茎段上脱落入培养基 ,并
发生卷曲 。 接种 2 周时 ,外植体体积已增大到接
种时的几倍至十几倍 , 切 口处产生肉眼可见的
粗糙突起 , 突起物半透明 , 此后可观察到如下现
象 。
.2 L I 小鳞 茎的 直接产生 切口 处粗糙 突起
物数量较少 , 每一外植体上有 1一 13 个不等 , 初
起时为半透明状小圆点 , 继而增大变白 ,到接种
3 周时 , 白色小点 已明显发育成小鳞茎 , 直径可
达 2一 3 m m 。 接种 7 周转代前观察 ,大的鳞茎直
径达 6 一 7 m m , 小的 仅有 l 一 Zm m , 悬殊 很大
(照 片 l a ) 。 在整个诱导期间 . 不断有新的小鳞
茎从外植体上产生 ,后产生的个体直径较小 ,而
在同期长出的鳞茎 中 , 如一个外植体上鳞茎 个
数少 , 则单个鳞茎的体积则相对较大 。 卷曲的幼
华 西 医 科 大 学 学 报 2 6卷
不是 由单个细胞发育而成的 。 从切 片看 ,体细胞
胚既有外起源 ,又有内起源 , 大多数体细胞胚是
由近表皮薄壁细胞分裂而形成 。 少数是由愈伤
组织 内部小的分生细胞团在薄壁细胞群中不断
分裂增大 ,形成球形胚 , 并使周围薄壁细胞发生
破裂 (照片 2。 ) 。
从致密团块状愈伤组织的切片观察 ,先 由
近表皮薄 壁细胞分裂形成一些小型细胞 ,这些
细胞初期与形成胚状体的细胞无 区别 , 质浓核
大 , 随细胞团分裂增大而突出于愈伤组织表面 ,
形成 不定芽 ,发育成鳞茎 , 此种细胞团在分化过
程 中不造成母体薄壁细胞破裂 ,并与之紧密联
系在一起 。
3 讨论
3
.
1 中华贝母初萌发幼茎通过组织培养再生
鳞茎有 3 种方式 : ①外植体上直接产生鳞茎 ;②
先形成致密团块状愈伤组织 , 通过不定芽方式
形成鳞茎 ;③先形成松散颗粒状胚性愈伤组织 ,
通过体细胞胚发育而形成鳞茎 。 组织培养的鳞
茎生长速度很 快 , 3 个 月就 可长成 自然环境下
种子繁殖鳞茎生长 3一 4 年的大小 。 从便于大规
模无性繁殖来看 ,胚性愈伤组织是理想的选育
材料 。
3
.
2 中华贝母的两种愈伤组织 , 多在同一种诱
导培养基上形成 ,经过 同种培养基 8 次继代培
养后 , 没有发生转化 现象 , 愈伤组织 生长较迅
速 , 产生体细胞胚或形成小鳞茎 的能 力均无减
弱迹象 , 同样培养条件下 , 愈伤组织按两种类型
发展 ,其 内部机理 尚有待探讨 。
3
.
3 关于体细胞胚的发生 , 许多研究工作者认
为是愈伤组织的表面 细胞产生 . 即外起源 “ 一 ` 。
我们观察 中华 贝母切片 , 体细胞胚既有从表面
发生 , 又有从愈伤组织内部产生 , 胚性细胞团发
育到一定阶段后 , 开始有了分化 ,形成了自身的
表皮 , 周围薄壁细胞发生解体 ,形成隔离 , 并进
而与母体分离 , 这与宋献报道 的胚状体与愈伤
组织间形成边缘细胞隔离层相吻合「5 · `二。 因此 ,
我们认为 中华贝母体 细胞胚既有外起源 , 又有
内起源 。 体细胞胚可通过类似于正常 合子胚发
育阶段 形成小鳞茎 与根 , 又可通过启动近表层
细胞而形成次级体细胞胚 , 控制这一切的相关
因素是什么尚不清楚 。 小鳞茎产生和体细胞胚
形成之关系为研究贝母休眠习性和胚胎发生提
供了有价值的手段 。
3
.
4 贝母属植物在萌发出地上茎之前 ,均需经
过形态后熟和生理后熟阶段 ,这要通过低温才
能满足 , 在组织培养中 , 由培养物萌发出再生植
株也须经过低温阶段 ,许多研 究报道证实了此
点 。 但本实验所涉及的愈伤组织 ,未经低温即产
生了地上茎和根 , 形成试管小植株 ,这虽属于个
别现象 , 但提示我们 ,通过培养条件和体细胞无
性系的筛选 ,有可能打破其冬眠习性 。
参 考 文 献
许 介眉 . 四川植 物 志 . 第 7 卷 . 成都 : 四 川 民族 出版社 ,
1 9 9 1 : 5 5 ~ 8 2
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e a , 19 9 0 ; 5 6 ( 4 )
: 4 2 1
周朴华 , 胡继金 ,范鸿芝 . 从黄花 芽诱导 出胚状体和植株
再生的研究 . 园艺学报 , 19 83 ; 10 ( 4 ) : 2 73
罗紫娟 . 甘蔗叶 培养不 定芽 和胚状体的发生 . 植物生理
学通 iR , 1 9 8 4 ; 2 : 29
韩碧 文 . 胚状体 发生的 细胞 学和生 理学研究 . 植物学通
报 . 1 9 8 9 : 6 ( l ) : l
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19 7 9 ; 9 3
( 1 9 9 4 一 (巧 一 1 3 收稿 , 19 94 一 0 8一 2 6 修回 )
编辑辑 苏长锥
1期 张 浩等 。 中华贝母幼茎培养及器官与体细胞胚的发生
O r g a n R e g e n e r a t i o n a n d S o m a t i e E m b r y o g e n e s i s
f r o m Y o u n g S t e m s o f F ri t i l l a ri a s in ie a
赞
Z h a n g H a o C h e n Z e b in Y a n g L i a n g x ia n
S c无 0 1 fo P h a r , a卿
A b s tr a e t R
e g e n e r a t e d b u l b s a n d e m b r y o g e n e t ie m a t i e e m b r y o g e n e s is w e r e s u b e u l t u r de
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五, ic a e u l t u r de o n M u r a s h i g e a n d Sk o o g ( M S ) m e d i u m 0
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e m e n t de 认 t h a 一 n a p h t h a l e 一 n e a e e t ie a e id ( N A A ) , I n g e n e r a l , t h e b u lb s e a n b e o b t a in e d f r o m e u l -
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4一 ie h lo p h e n e x y 一a e e t i n a e id ( 2 , 4一D ) , 6 一 be n z y 一 t u r e d F汀一i l l a 八a s i n ic a t h r o u g h t h r e e w a y s : ( 1 ) in d u e -
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a m in o p u r in e ( 6B A ) a dn k
e n e t i n ( K t ) r e s p e e t iv e ly
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T h e t io n f r o m e x p la n t s ; ( 2 ) p r o d u e t i o n o f a d v e n t i t io u s
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K e y 灿 r ds F ir t i l al r i a s in i c a uB l b r e g e n e r a t io n C a l lu s oS m a t i e e m b r y o
一
T h e P or je e t S u p p o rt e d b y N a t i o o a l N a t u r a l cS i
e n e e F o u n d a t i o n o f C h i n a
[ 9 4 0 5」 肺癌病人免疫功能的研究及其临床应用
成果完成单位 华西 医科大学附属第一医院
主研人员 周清华 杨振 华 张 怀斌 杨俊杰 肖远康 伍 伫
主持鉴定单位 四川省卫 生厅
鉴定日期 1 9 9 4 年 4 月 l尹 日
获奖情况 获 1 9 9 4 年度四川省科技进 步三等笑 , 获 1 9 9 4 年度 成都 市科技进 步三 等奖
成果简介 在国内外首先建立一种新的免疫抑制
实验方法 , 并首次阐明 了肺癌病 人细胞免疫功能障碍
的机理 。 在国内外首先发现肺癌病人有严重细 胞免疫
功能障碍 和手术前后的动态变化规律 , 首先提出了“ 外
科治疗是最有效的免疫治疗 ” 和 “ 外科手术在肺癌免疫
中有双重作用 ” 的新概念 , 以 及肺癌手术后的放 、 化疗
应在术后 3 0 天开始的建议 。 本系列研究还首先发现测
定肺 癌病 人的胃泌 素的临床意 义 。 研究的方法和结果
对肺癌的诊断 、术前估计肺癌的可切除性 、监 测预后都
有较好的临床应用价值 。 研究论文 已被国内外学者引
用和应用 , 产生了良好的社会效益和国际影响 , 属国际
先进水平 。