全 文 ：第 3卷 第 4 期
2 0 0 3年 8月
过 程 工 程 学 报
Th eC h n i
es e J o帅a l o fP re oes s Eng n ie e rig n
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.
4
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.
2 0 0 3
产烃葡萄藻在气升式光生物反应器中的分批补料培养
王 军 , 杨素玲 , 丛 威 , 蔡昭铃
仲 国科学院过程工程研究所生化工程国家重点实验室 , 北京 10 0 08 0)
摘 要 : 在 3 L 气升式光生物反应器中进行了产烃葡萄藻的培养 . 批式培养时 , 葡萄藻消耗氮 、 磷
的速度较快 , 培养液中氮 、 磷营养盐的缺乏限制了藻细胞进一步生长和增殖 . 采取分批补料方式 ,
使培养液中 K N 0 3和 姚 H P认浓度分别维持在 10 和 30 m叭 , 可克服氮 、 磷限制问题 . 与批式培
养相比 , 生物量从 1 3 岁L 增加到 1 . 9 叭 , 烃含量从占细胞干重的 2 %提高到 290/ , 从而使烃产量从 0 . 286 gl L增加到 o . 55 l gL/ , 提高了 92 . 60,0 .关键词 : 葡萄藻归口介” c oc us bar un i) ; 气升式光生物反应器 ; N : P ; 分批补料中图分类号 : Q94 .9 21 文献标识码 : A 文章编号 : 10 9 - 6o 6x (2 003 )0 4 - 0 3 6 一。
1 前 言
呈串状集落生的葡萄藻叨口了尽口 co c us b ar un “ , 又译丛粒藻 )是一种世界性广布的淡水单细胞绿
藻 , 其含烃量占细胞干重的 15% 一75 % (因藻种和培养条件而异 l)[ ] , 大大高于其它微生物的产烃量 ,
在一些石油沉积中几乎全部的有机质都是该藻形成的21[ , 故又被称为 “ 油藻 ” . 鉴于该藻有可能提
供无污染 、 可再生的替代能源 , 自 20 世纪 70 年代石油危机爆发后 , 日益受到重视 , 美 、 日、 法
等国家相继开展了利用该藻生产可再生能源的研究.ls
对葡萄藻生理生化的研究表明 , 氮和磷是细胞的重要组成成份 , 活跃参与细胞的许多生理生
化反应 4[, 51 . 氮源和磷源的浓度对葡萄藻生长有显著影响 , 在一定范围内适当增加培养基中硝酸盐
和磷酸盐的起始浓度 , 可加快葡萄藻的生长 , 提高最终生物量和产烃量 6[, 71 . 但初始硝酸盐和磷酸
盐浓度过高不仅会对藻细胞产生一定的抑制 8I] , 而且还易与其它无机盐相互作用形成沉淀 . 目前对
葡萄藻的研究主要处于摇瓶培养阶段 , 反应器中氮 、 磷对葡萄藻生长和产烃的影响至今尚未有报
道 . 本文于 3 L 气升式光生物反应器中培养葡萄藻 , 考察了氮 、 磷营养盐的供给和消耗对葡萄藻生
长 、 叶绿素积累和产物生成的影响 , 并采取分批补料方式补充氮 、 磷源 .
2 材料与方法
2
.
1 藻种与培养基
葡萄藻叨例柳口co c us b ar un l’i 35 7) 由中国科学院水生生物研究所提供 .
培养基采用改进的 c hu 13 xZ 培养基 9[] , 用 K o H 调节 pH 到 .7 .5
2
.
2 3 L 气升式光生物反应器
反应器由罐体 、 气体提升管 、 气体分布器组成 . 整体是由耐热耐压的硅硼玻璃制成 , 可进行
高压蒸汽灭菌 . 罐体直径 10 ~
, 高 4 50 ~
, 提升管与外罐体同心 , 直径 70 ~
, 高 360 ~
.
反应器底部为弧形构造 , 气体分布器由孔径约 80 林m 的玻砂制成 , 设置于底部正中央 . 反应器总
体积 3 L , 工作体积 2 . 8 L . 培养过程中 , 整个反应器置于 H PG 一2 80 B 光照培养箱中 (哈尔滨东联技
收稿 日期 : 2 0 3一 l一场 , 修回日期 : 2 0 3刁牛 03
作者简介: 王军 ( 19 76 一 , 女 , 四川省宣汉县人 , 硕士研究生 , 生物化工专业 : 丛威 , 通讯联系人 .
4期 王军等 : 产烃葡萄藻在气升式光生物反应器中的分批补料培养 36 7
术开发有限公司 )以控制光强 、 温度及光照时间 . 空气和 c q 定量混合后经孔径为 .0 2 林m 的空气过
滤器除菌 , 通过气体分布器进入反应器 .
2
.
3 培养方法
藻种培养 : 3 0 m l三角瓶中装入 20 0 m l C hu 13x Z 培养基 , 灭菌后挑单藻落置于摇床培养 25 d,
摇床顶部自设荧光灯提供光照 . 培养条件 : 温度 25 ℃ , 三角瓶瓶 口处光强为 .2 5 m w /c时 (持续光照 ) ,
转速 120 r/ m i.n
批式培养 : 将藻种液低速离心浓缩至 10 m l 后 , 接到装有 .2 7 L Chu 13 x Z 培养基的气升式反
应器中 , 使反应器中培养初始细胞干重在 .0 01 叭 左右 . 培养温度 2 5o c , 反应器外壁光强为 .4 2
m w / c m Z(持续光照 ) , 通空气量为 4 0 m F m i n , 其中含 l% (初c o 2 . 定时取样分析 .
一次补料培养 : 批式培养过程中 , 当培养液中 K N o 3浓度降到低于 50 m叭 , 且 暇 H Po 4浓度降到 O m叭 时 , 补加 50 耐 K N o 3和 K ZPH仇 混合溶液 , 使此时培养液中 K N 0 3和 K Z H P仇浓度分
别提高到 6 0 和 Zo m叭 左右 . 其它培养条件同批式培养 .分批补料培养 : 批式培养过程中 , 当培养液中 K N O 3浓度降到 50 m留L 、 而 K ZIH, o ; 浓度降到
o m叭时 , 开始补加 20 m l K N 0 3和 K ZHP 0 4混合溶液 , 隔 l d补加 1次 , 使培养液中 K N 0 3和 K ZHP o 4
浓度分别保持在 10 和 30 m叭 左右 . 其它培养条件同批式培养 .
2 4 分析方法
细胞干重的测定 : 取 10 m l培养液于 4 0 0 r /m in 离心 10 m in , 用蒸馏水洗涤后 , 于 80o C 干燥
2 4 h
, 称其干重 .
叶绿素含量分析 : 取一定量的藻液离心 , 弃上清液 , 加入 90 %的丙酮超声波破碎后离心 , 收
集丙酮提取液 , 测其在 7 30 , 6 64 , 647 , 6 30 nl 处的光吸收值 , 按公式 10 1计算叶绿素 a , b 的浓度 , 两
者之和即为总的叶绿素含量 .
烃的测定 : 取一定量的藻液于 4 0 0 0 r /m in 离心 10 而 n , 用蒸馏水洗涤后 , 于 6 o0 C 干燥 24 h ,
加 50 m l 正己烷超声破碎 30 m in 后离心 , 收集正己烷提取液 , 在旋转蒸发仪上于 3 o0 C 蒸发掉正己
烷 , 余下即为烃 , 称其质量 l[ .]
N街浓度测定 : 参照文献「12] , 绘出 N o 丁浓度标准曲线 . 取一定量藻液以 4 0 0 r /m l n 离心 5 而 n ,
上清液适当稀释后测定 2 2O unI 吸光值 , 对照标准曲线得出 N O了浓度
.
HP o呈一浓度测定 : 用比色法 l3[ 〕绘出 H P次一浓度标准曲线 . 取一定量藻液以 4 0 0 mr/ in 离心 5
m in
, 上清液适当稀释 , 加入显色剂 , 测定 8 85 ilm 吸光值 , 对照标准曲线得出 HP 次一浓度 .
3 结果与讨论
3
.
1 葡萄藻在气升式光生物反应器中批式培养
在 3 L 气升式光生物反应器中批式培养葡萄藻 , 细胞生长 、 叶绿素积累和氮 、 磷营养盐浓度
变化情况如图 1所示 . 由图可看出 , 在气升式反应器中 , 葡萄藻经过较短的延滞期后在第 3 d进入
对数生长期 , 在第 s d进入减速生长期 , 在第 13 d 细胞干重达到最大值 1 . 30 9几 , 此时烃产量为
.0 28 6叭 , 占细胞干重的 2 % . 随后细胞开始衰亡 , 生物量迅速下降 . 与细胞生长相对应 , 培养液中叶绿素浓度在前 3 d 无明显变化 , 随后迅速增加 , 在第 l o d 达到最大值 6 0 0 林叭 , 此后叶绿素
浓度稍有下降 . 与典型摇瓶培养 l4[ 相比 , 气升式光生物反应器培养葡萄藻 , 培养周期从 30 d 缩短
至 巧 d 左右 , 生物量从 .0 95 叭 提高到 1 . 3 g/ L , 产烃量从 0 . 19 9几 提高到 .0 2 86 9几 , 表明气升式
光生物反应器适合大规模培养葡萄藻 . 由图 1b() 可看出 , 在气升式光生物反应器中培养葡萄藻 , 氮
过 程 工 程 学 报 3卷
源 、 磷源的消耗均较快 , 在前 10 d , N o 至以 5 m g/ (L d) 的速率迅速被消耗 , 在第 13 d , 当生物量
达到最大值时 , N O至浓度降到最小值 , 后期由于细胞的破裂导致培养液中氮含量略有上升 ; HP O牙-
在前 6 d 以 2 m创(L d) 的速率迅速消耗 , 此后消耗速率减慢 , 到第 13 d , 培养液中 HP 端一几乎降
为 0 . 整个培养过程中 , 由于通气中配入的 Cq 对培养液的 p H 有调节和缓冲作用 , pH 一直维持
在 7 .卜 .7 7 , 变化不大 . 以上结果表明 , 由于葡萄藻在气升式反应器中生长较快 , 相应地对氮 、 磷
的利用也加快 , 培养液中氮 、 磷营养盐浓度迅速降低 , 当生长进行到一定时间 , 氮 、 磷营养盐的
缺乏可能成为限制藻细胞进一步生长和增殖的原因 .
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图 1葡萄藻在气升式反应器中批式培养
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u n i i in ia -r li ft Pho ot b io er ac for
3
.
2 一次性补充氮源和磷源对葡萄藻生长的影响
为证实缺乏氮源 、 磷源是引起葡萄藻迅速衰亡的原因 , 在葡萄藻进入减速生长期后期时 , 向
培养液中加入高浓度的 K N 0 3和凡PH o4 溶液 , 其对葡萄藻生长和叶绿素积累的影响以及氮 、 磷营
养盐的消耗情况如图 2 所示 .
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图 2 一次性补加氮源和磷源对葡萄藻生长的影响
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在培养的第 13 d , 葡萄藻进入减速生长期后期 , 细胞干重为 1 . 30 g/ L , K N 0 3浓度低于 50 m g 工 ,
凡 H P认浓度接近 O, 此时补充 K N 0 3和狡HP 认 , 使培养液中 K N O 3和 凡HP 0 4浓度分别提高到 60
和 20 0 m gI L 左右 . 3 h 后取样测定 , 培养液中叶绿素浓度和细胞干重均明显增加 . 在第 1s d 细胞干
4 期 王军等 : 产烃葡萄藻在气升式光生物反应器中的分批补料培养
重和叶绿素浓度达到最大值 , 分别为 1 . 75 g/ L 和 9 0 0 0 林留L , 均高于补料前的数值 , 随后细胞开始
衰亡 , 而此时培养液中氮磷的浓度仍在较高水平 . 以上结果表明 , 在细胞生长进入减速生长期后 ,
向培养液中加入适量氮 、 磷营养盐 , 已经停止生长的葡萄藻细胞恢复了活力 , 又开始生长 , 证实
了缺乏氮 、 磷营养是引起葡萄藻过早衰亡的原因 ; 补氮 、 磷后 , 藻液中叶绿素浓度和生物量迅速
提高 , 叶绿素是含氮光合色素 , 这表明补加氮源和磷源后 , 氮 、 磷立即被细胞同化 , 合成组成细
胞成份的有机物质 ; 培养后期一次性补加高浓度的氮源和磷源 , 虽能提高葡萄藻的生物量 , 但提
高的幅度不大 , 并且氮 、 磷利用也不完全 .
3
.
3 葡萄藻在气升式反应器中分批补料培养
采取分批补料方式培养葡萄藻 , 使培养液中氮 、 磷盐浓度维持在 1 个相对恒定水平 , 结果如
图 3所示 . 在培养的第 10 d , 葡萄藻进入减速生长期后期 , 此时第 1次补加氮源和磷源 , 以后每隔
l d 补加 1次 , 使 KN O 3和 凡 H P认分别维持在 10 和 30 m叭 左右 . 从图 3可看出 , 自补加氮 、磷开始 , 培养液中叶绿素浓度和细胞浓度持续上升 , 在第 16 d达到最大值 , 叶绿素浓度为 10 0 0
林留L , 细胞干重为 1 . 9 9几 . 从图 3 还可看出 , 每次补加氮源和磷源后 , 隔 3 h 取样测定 , 叶绿素浓
度和细胞干重明显增加 , 这与前面的结果相符合 , 表明葡萄藻对氮源和磷源的利用不经过一个适
应期 , 氮和磷迅速被同化 .
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图 3 分批补料培养葡萄藻
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分批补料与批式培养的最大生物量和产烃量的比较如表 1 所示 . 与批式培养相比 , 分批补料
培养使生物量从 1 . 3 g/ L 增加到 1 . 9叭 , 烃含量从占细胞干重的 2 %提高到 29 % , 从而使烃产量从
.0 2 86 叭增加到 .0 5 51 叭 , 提高了 9.2 6% . 由此可见 , 氮 、 磷分批补料培养可在一定程度上解决
葡萄藻在气升式反应器中培养氮 、 磷源限制问题 , 提高培养密度和细胞含烃量 , 从而较大幅度提
高产烃量 .
表 1 不同培养方式对葡萄藻生物量和产烃量的影响
B a t e h cu l奴止 e
F ed 七 a t e h cu l奴 ir e
1
.
3
1
.
9
0
.
2 8 6
0
.
55 1
22
2 9
结 论
产烃葡萄藻在气升式光生物反应器中培养 , 藻细胞生长较快 , 相应地对氮 、 磷营养的利用也
7 30
.一 . _.… _ _ _ 生鱼全全剑生一一一一一一一一一一加快 , 培养液中氮 、 磷营养盐浓度迅速降低 , 当生长进行到一定时间 , 氮 、 磷营养盐的缺乏限制
了藻细胞进一步生长和增殖 ; 采取分批补料培养方式 , 使培养液中氮 、 磷浓度维持在适当的水平 ,
可在一定程度上解决葡萄藻在气升式反应器中培养氮 、 磷源限制问题 , 提高生物量和细胞含烃量 ,
从而大幅度提高产烃量 .
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