全 文 ：第 36 卷 第 4 期
2014 年 7 月
北 京 林 业 大 学 学 报
JOUＲNAL OF BEIJING FOＲESTＲY UNIVEＲSITY
Vol． 36，No． 4
Jul．，2014
DOI:10． 13332 / j． cnki． jbfu． 2014． 04． 021
百子莲 CONSTANS同源基因的克隆及表达分析
石玉波1 张 荻2 申晓辉2 王 玲1 卓丽环1，3
(1 东北林业大学园林学院 2 上海交通大学农业与生物学院 3 上海农林职业技术学院)
摘要:根据前期百子莲转录组测序分析的结果，获得了 1 个与光周期调控开花途径关键基因 CONSTANS(CO)同源
性较高的核心片段。采用 cDNA 末端快速扩增(ＲACE)方法得到了百子莲 CO 基因 cDNA 全长序列，命名为
ApCOL，GenBank登录号为 KF683287。序列分析表明，百子莲 ApCOL基因 cDNA全长 1 648 bp，5非编码区(5UTＲ)
和 3非编码区(3UTＲ)分别为 126 和 355 bp，开放阅读框(OＲF，127 ～ 1 293 bp)1 167 bp，编码 388 个氨基酸。
ApCOL具有 CO蛋白典型的结构域:氨基末端有 2 个 B-box结构域，羧基末端有 1 个 CCT保守结构域。氨基酸同源
性比对发现，ApCOL与葡萄(XP_002274384. 2)、可可(EOX99181. 1)和大豆(NP_001241023. 1)等植物的 CO蛋白有
很高的相似性，同源性均在 50%以上。系统进化树分析表明，ApCOL与小麦 CO(EMS51329. 1)聚类关系最近。实
时荧光定量 qＲT-PCＲ结果表明:叶片中 ApCOL的表达量在花芽分化 3 个时期均高于花芽中的表达量，且叶片中的
最高表达量和花芽中最低表达量均出现在花芽诱导期;在整个初花期内，各器官中 ApCOL 表达量由高到低依次是
花梗、叶片、幼果、子房、花瓣、茎和花葶，花梗中表达量分别为叶片和茎中的 2. 68 和 114. 3 倍;不同光周期处理的叶
片中 ApCOL基因表达模式相近，均在暗处理时期呈现高表达。说明该基因的表达具有明显的时空差异性和生物钟
调节特性，推测 ApCOL在百子莲成花过程中以及花发育过程中发挥着一定的作用。
关键词:百子莲;ApCOL;克隆;基因表达
中图分类号:S682 文献标志码:A 文章编号:1000--1522(2014)04--0113--08
收稿日期:2013--10--12 修回日期:2013--12--24
基金项目:中央高校基本科研业务费专项(DL13EA07)、上海市科技兴农重点攻关项目(沪农科攻字(2010)第 6--2 号)、黑龙江省博士后
科研启动金项目(LBH-Q12168)。
第一作者:石玉波，博士生。主要研究方向:园林植物分子生物学。Email:shiyubo2000@ 163． com 地址:150040 黑龙江省哈尔滨市和兴
路 26 号东北林业大学园林学院。
责任作者:王玲，教授，博士生导师。主要研究方向:园林植物种质资源与应用。Email:wanglinghlj@ 126． com 地址:同上。卓丽环，教授，
博士生导师。主要研究方向:园林植物种质资源与应用。Email:zhuolihuan@ 263． net 地址:同上。
本刊网址:http:journal． bjfu． edu． cn
SHI Yu-bo1;ZHANG Di2;SHEN Xiao-hui2;WANG Ling1;ZHUO Li-huan1，3 ． Molecular cloning and
expression pattern analysis of a CONSTANS homolog from Agapanthus praecox ssp． orientalis．
Journal of Beijing Forestry University (2014)36(4)113--120［Ch，21 ref．］
1 College of Landscape and Architecture，Northeast Forestry University，Harbin，150040，P． Ｒ． China;
2 School of Agriculture and Biology，Shanghai Jiaotong University，200240，P． Ｒ． China;
3 Shanghai Vocational Technical College of Agriculture and Forestry，210699，P． Ｒ． China．
A core fragment highly homologous with the key gene of photoperiodic regulatory blossoming
pathway，CONSTANS (CO)was obtained on the basis of preliminary Agapanthus praecox ssp． orientalis
transcriptome sequencing results． The full length sequence of cDNA，the CO gene of A． praecox ssp．
orientalis was gained by the ＲACE method，which was named as ApCOL with the GenBank accession
number of KF683287． The results of sequence analysis showed that the full length of cDNA was 1 648
bp，which was composed of one open reading frame of 1 167 bp，388 encoded amino acids，uncoded
region (UTＲ)5 and 3 with the length of 126 and 355 bp，respectively． The ApCOL had the typical
domain of CO proteins:two B-box domains were boned at both of the hydroxy ends and a conserved
domain CCT was located at the amino end． The results of homology comparison indicated that the ApCOL
was highly homologous with the CO proteins of some plants such as Vitis vinifera (XP_002274384． 2) ，
Theobroma cacao (EOX99181. 1)and Glycine max (NP_001241023. 1) ，with the homology of 50% or
more． On the basis of phylogenetic analysis，it was demonstrated that ApCOL had the closest genetic
北 京 林 业 大 学 学 报 第 36 卷
relationship with clustering Triticum urartu (EMS51329. 1)． The real-time quantitative PCＲ results
suggested that the expression of ApCOL in leaves was obviously higher than that in blossom bud in the
whole period of flower bud differentiation，and the highest and lowest expression of ApCOL in leaves and
blossom bud were both happened in the period of flower bud induction;in the beginning-flower stage，the
expression of ApCOL in the various organs from high to low was pedicel，leaf，young fruit，ovary，petal，
stem and scape，the ApCOL expression in the pedicel was 2. 68 and 114. 3 times of that in leaf and stem;
during different light cycle treatment，ApCOL gene expression patterns were similar，and were higly
expressed during the dark treatment in A． praecox ssp． orientalis leaves． The results show that the ApCOL
expression has obvious time and space difference and circadian regulation characteristics，and may play a
crucial role in the processes of flowering and flower development．
Key words Agapanthus praecox ssp． orientalis;ApCOL;clone;gene expression
光周期是影响植物花发育的重要环境因子，
CONSTANS(CO)基因是光周期途径中的关键基因，
它通过诱导 FLOWEＲING LOCUS T(FT)、TWIN
SISTEＲ OF FT (TSF )和 SUPPＲESSOＲ OF
OVEＲEＲEXPＲESSION OF CONATANS 1(SOC1)的表
达而促进植物开花。目前已在许多植物中发现了编
码有 N端类锌指结构 B-box 和 C 端 CCT 保守结构
域的 CONSTANS-LIKE(COL)基因，但它们的功能却
不尽相同。CO是通过拟南芥(Arabidopsis thaliana)
突变体克隆研究获得的一个光周期反应途径中关键
的转录调控因子［1］，在长日照条件下是光周期信号
的最终输出者，它的上调表达促进成花素基因 FT
的表达，随后 FT蛋白转移到顶端分生组织处与 FD
蛋白结合激活花分生组织基因 AP1 的表达，进而促
进植物开花［2
--3］。在拟南芥中短日照条件下，CO 对
开花的促进作用并不大，而水稻(Oryza sativa)的
CO-LIKE基因 Hd1 在短日照条件下促进开花，在长
日照条件下反而抑制开花［4
--7］。由此可见，CO 及其
同源基因在不同植物和不同条件下的作用可能
不同。
百子莲(Agapanthus praecox ssp． orientalis)为百
子莲科百子莲属单子叶多年生根茎类草本花卉，
原产非洲南部亚热带地区，其花色多为蓝色或白
色，因花色淡雅而深受人们的喜爱，既可用于园林
配置，也可用于盆栽、切花生产以及干燥花的艺术
创作。CO作为光周期调控开花途径中的关键基
因，在单子叶植物百子莲的研究中未见报道。本
文首次克隆得到了百子莲光周期调控开花途径
CO的同源基因 ApCO-LIKE(ApCOL) ，并利用实时
荧光定量分析的方法，对百子莲不同发育时期各
组织中的 ApCOL 进行了相对定量表达分析，为进
一步了解 ApCOL在百子莲中的表达模式和成花转
变中的作用奠定基础，可为今后利用分子手段调
控百子莲花期，扩大其在园林上的应用以及鲜切
花生产奠定基础。
1 材料与方法
1. 1 试验材料与试剂
以 4 年生百子莲盆栽实生苗为试材，各组织表
达分析样品分别取自营养生长期(2012 年 11 月 20
日)、花芽诱导期(2012 年 12 月 20 日)、花芽分化期
(2013 年 3 月 16 日)的茎尖和叶片组织，以及初花
期的根、茎、叶、花葶、花梗、花瓣、子房和幼嫩果实，
液氮中速冻后置于 － 80 ℃冰箱中保存备用。
光周期处理:将营养期植株移入人工气候箱中，
设定短日照(昼 /夜:8 h /16 h，08:00—16:00 光培
养，16:00—08:00 暗培养)和长日照(昼 /夜:16 h /8
h，08:00—24:00 光培养，24:00—08:00 暗培养)处
理，光照强度 10 000 μmol /(m2·s) ，湿度 70%左右，
处理两周后，分别于 06:00、13:00、20:00 取叶片组
织，液氮中速冻后置于 － 80 ℃冰箱中保存备用。
利用植物 ＲNA 小量提取试剂盒(上海莱枫生
物科技有限公司)提取各组织中的 ＲNA。工程菌与
载体分别为 DH5α大肠杆菌、pMD18-T载体，均购自
TaKaＲa公司;SanPrep 柱式 DNA胶回收试剂盒购自
生工生物工程(上海)有限公司;Taq 酶、反转录酶、
ＲACE试剂盒 SMAＲTerTMＲACE cDNA Amplifi-cation
Kit购于 Clontech 公司。所用引物由生工生物工程
(上海)有限公司合成，测序由上海英骏(Invitrogen)
生物技术有限公司完成。
1. 2 试验方法
1. 2. 1 目的基因片段获得
根据前期百子莲转录组测序分析结果，得到百
子莲 CO 同源基因的核心序列片段 344 bp，使用
Primer5 软件设计引物 CO-F1 和 CO-Ｒ1，以百子莲营
养期叶片的 cDNA 为模板进行目的片段扩增，引物
序列见表 1。反应程序为:94 ℃预变性 3 min;94
℃变性 30 s、65 ℃退火 30 s、72 ℃延伸 30 s，35 个
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第 4 期 石玉波等:百子莲 CONSTANS同源基因的克隆及表达分析
循环;72 ℃保持 3 min，使产物延伸完整。反应程序
结束后，经 1%琼脂糖凝胶电泳检测，回收目的片
段，连接 pMD18-T 载体，转化大肠杆菌 DH5α 的感
受态细胞，蓝白斑筛选阳性克隆并测序。
表 1 引物序列名称及说明
Tab． 1 Sequence of primers and description
引物 序列(5-3) 说明
UPM CTAATACGACTCACTATAGGGCAAGCAGTGGTATCAACGCAGAGTCTAATACGACTCACTATAGGGC
ＲACE-PCＲ通用引物
NUP AAGCAGTGGTATCAACGCAGAGT
CO-F1 ATGGATCCCGTGTGCGACTCGTGTG
CO-F2 GCCTCCAGTGCCACCTCTCCGAC 3 ＲACE
CO-F3 TCACGAAAAGCCAGAGCAGATACGC
CO-Ｒ1 GAACGTCGGAGAGGTGGCACTGG
5 ＲACE
CO-Ｒ2 CAGAGGAGGGATCGTAGGTGGCG
CO-F1 ATGGATCCCGTGTGCGACTCGTGTG
扩增 CDS序列
CO-Ｒ3 TCAGCTATTTCTTGATAGAAGAGGT
Actin-F CAGTGTCTGGATTGGAGG
内参
Actin-Ｒ TAGAAGCACTTCCTGTG
qCO-F CTTCTTCTTCGGCACAAC
实时荧光定量分析
qCO-Ｒ TCCTCATAATCAGCAACACT
1. 2. 2 ApCOL基因全长克隆
以提取百子莲叶片和茎尖混合组织的总 ＲNA
为模板，采用 SMAＲTerTM ＲACE cDNA Amplification
Kit(Clontech)扩增试剂盒进行 3 ＲACE和 5 ＲACE
cDNA文库的构建。以 CO-F1、UPM 和 CO-Ｒ1、UPM
作为 3 ＲACE和 5 ＲACE扩增的第一轮引物，根据
获得的目的片段序列，使用 Primer 5 软件设计
3 ＲACE巢式 PCＲ引物 CO-F2 和 CO-F3，以百子莲
3 ＲACE cDNA 文库(1 μL)为模板，按 SMAＲTerTM
ＲACE cDNA Amplification Kit(Clontech)扩增试剂盒
说明书进行操作，获得 3端序列。将获取的目的片
段序列和 3 ＲACE序列拼接后，设计 5 ＲACE 巢式
PCＲ引物 CO-Ｒ2，按上述扩增试剂盒说明书操作，
获得 5端序列。将 3端序列、中间目的片段序列和
5端序列拼接后，设计 ApCOL 基因全长特异性引物
CO-F1 和 CO-Ｒ3，通过 PCＲ 扩增，克隆、测序，获得
该基因全长序列。
1. 2. 3 生物信息学分析
利用 NCBI 网站上的 BLASTx 程序进行序列相
似性分析;使用 GenBank OＲF finder(http:www．
ncbi． nih． gov /gorf /gorf． html)和在线网站(http:
www． expasy． org / tools /protparam． html)进行开放阅
读框的预测以及蛋白一级结构(理论等电点和分子
量)的分析;应用 DNAman 软件进行同源性比较分
析以及蛋白疏水性、亲水性分析;利用 ExPaSy 工具
中的 SOPMA 软件在线预测分析 α-螺旋(α-helix，
H)、β-转角(β-turn，T)、无规则卷曲(random coil，
C)以及延伸链(extendedstrand，E) ;利用瑞士模型预
测网站(http:swissmodel． expasy． org /)进行蛋白三
级结构预测分析;使用 MEGA4 软件进行系统进化
树的构建。
1. 2. 4 荧光定量 PCＲ
通过实时荧光定量 qＲT-PCＲ 方法分析 ApCOL
在不同发育阶段不同组织中的表达情况。使用
Beacon Designer 7 软件设计 qＲT-PCＲ引物 qCO-F和
qCO-Ｒ，片段长度为 193 bp。利用 FTC-3000TM
SYSTEM实时荧光定量 PCＲ 仪进行荧光定量 PCＲ
反应，反应体系为:SYBＲ Premix Ex Taq Ⅱ(2 ×)10
μL、引物(10 μmol /L)各 0. 5 μL、cDNA 2. 0 μL、
ＲNase-free H2O 定容至 20 μL。反应程序设置 94 ℃
预变性 60 s;94 ℃变性 10 s，56 ℃退火 15 s，72 ℃延
伸 25 s，共 40 个循环。反应完成后计算平均值和标
准差，采用 2 － ΔΔCt法［8］进行数据分析，所用百子莲内
参基因为 Actin，片段大小为 117 bp［9］。所有样品重
复 3 次。
2 结果与分析
2. 1 百子莲 ApCOL基因的全长序列获得
根据前期转录组测序结果分析得到的百子莲
CO同源基因核心序列，设计特异性引物 CO-F1 和
CO-Ｒ1，以百子莲叶片 cDNA为模板进行 PCＲ扩增，
得到一条约 230 bp左右的条带(图 1，1 泳道) ，目的
片段经回收测序为 229 bp，序列经 BLASTp 分析表
明，该片段与多种植物的 CO 基因具有很高的同源
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北 京 林 业 大 学 学 报 第 36 卷
图 1 百子莲 ApCOL基因 ＲT-PCＲ及 ＲACE扩增电泳图谱
Fig． 1 Agrose electrophoresis of ApCOL ＲT-PCＲ and ＲACE products
性，初步认定它是百子莲 CO基因的片段。
通过 3 ＲACE 第一轮 PCＲ，在 1 200 ～ 1 300 bp
处呈弥散条带(图 1，2 泳道) ，第二轮和第三轮巢式
PCＲ分别获得 1 282 bp(图 1，3 泳道)和 457 bp(图
1，4 泳道)的 cDNA片段，拼接后得到 3 ＲACE 1 522
bp的 cDNA 片段。5 ＲACE 经第一轮 PCＲ 在 300
bp左右呈弥散带(图 1，5 泳道) ，巢式 PCＲ 扩增后
获得 269 bp(图 1，6 泳道)的 cDNA 片段。将
3 ＲACE序列、核心序列和5 ＲACE获得的序列进
行比对拼接后，得到 1 648 bp 的 ApCOL cDNA 全长
序列，其中 A、T、G、C 4 种碱基含量分别为 26. 94%
(A)、27. 00%(T)、23. 48%(G)和 22. 57%(C)。
经 NCBI 的 OＲF Finder 分析，ApCOL 基因开放
阅读框(OＲF)为 1 167 bp，编码一个含有 388 个氨
基酸的蛋白质(图 2) ，全长 cDNA 序列还包含 126
bp的 5非翻译区(5UTＲ)和 355 bp 的 3非翻译区
(3UTＲ)。根据 OＲF序列，在其两端设计全长引物
CO-F1 和 CO-Ｒ3，分别以 cDNA与基因组 DNA 为模
板进行 PCＲ扩增，扩增片段经测序分别为 1 167 bp
(图 1，7 泳道)和 3 280 bp(图 1，8 泳道)。2 条序列
经比对后发现，百子莲 ApCOL 基因的基因组序列中
包括 4 个外显子和 3 个内含子(图 3) ，2 条序列分别
登陆 NCBI，命名为 ApCOL，其 cDNA 登录号为
KF683287，gDNA登录号为 KF683288。
图 2 ApCOL核苷酸序列和推测的氨基酸序列
Fig． 2 cDNA sequence and deduced amino acid sequence of ApCOL
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第 4 期 石玉波等:百子莲 CONSTANS同源基因的克隆及表达分析
图 3 ApCOL基因示意图
Fig． 3 Schematic diagram of ApCOL gene
2. 2 ApCOL氨基酸序列分析
通过 Protparam对百子莲 ApCOL进行理化性质
分析，推测 ApCOL 蛋白质分子质量为 42. 51 ku，等
电点(pI)为 5. 22。对预测的 ApCOL 蛋白序列(图
4)分析发现，在氨基末端有 2 个锌指结构域 B-box
(5 ～ 42 bp、48 ～ 85 bp) ，羧基末端有 1 个 CCT 结构
域 45 bp(332 ～ 376 bp)。对 ApCOL基因编码蛋白的
疏水性和亲水性分析，结果表明 ApCOL属于亲水蛋
白。二级结构预测结果显示，ApCOL 中含有丰富的
ɑ-螺旋(24. 74%)和无规则卷曲(63. 14%) ，β-转角
(3. 61%)和延伸链的含量较少 (8. 51%)。对
ApCOL 蛋白三维结构进行在线分析发现，百子莲
ApCOL 与水稻 Hd1(AFK31609. 1)和二穗短柄草
(Brachypodium distachyon) (XP _ 003570474. 1)
CONSTANS蛋白有相似的三维结构(图 5)。
图 4 ApCOL基因推测的氨基酸序列与其他植物 CO蛋白的多序列比对
Fig． 4 Comparison between the inferred amino acid sequence of ApCOL and the CO peotein of other plants
2. 3 ApCOL的同源性比较与进化树分析
通过 BLASTx对 ApCOL进行同源性序列比对，
以及用 DNAman 软件进行氨基酸序列同源性分析
发现，百子莲 ApCOL蛋白序列与其他植物的 CO 蛋
白具有很高相似性，与可可(Theobroma cacao)
(EOX99181. 1)和 葡 萄 (Vitis vinifera) (XP _
002274384. 2 )、大 豆 (Giycine max ) (NP _
001241023. 1)等植物蛋白序列的相似性可达到
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北 京 林 业 大 学 学 报 第 36 卷
图 5 百子莲 ApCOL(A)、水稻 Hd1(B)和二穗短柄草 CO(C)的蛋白三维结构模型
Fig． 5 Three-dimensional models of protein structure，ApCOL in A． praecox ssp． orientalis (A) ，Hd1 in
Oryza rufipogon (B)and CO in Brachypodium distachyon(C)
50%以上(图 4)。在多重比对的基础上，利用
MEGA4 软件对 ApCOL蛋白序列和其他植物 CO 蛋
白序列进行系统发育树的构建，从进化树(图 6)中
可以看出，百子莲 ApCOL 与小麦(Triticum urartu)
(EMS51329. 1)亲缘关系最近，与二穗短柄草(XP_
003570474. 1 )、 文 心 兰 (Erycina pusilla )
(AGI62030. 1)和鹰嘴豆(Cicer arietinum) (XP _
004502110. 1)等植物亲缘关系较近，与 番 茄
(Solanum lycopersicum) (NM _001246910. 1)、甘蓝
(Brassica napus) (AF016011. 1)、玉米(Zea mays)
(NM _ 001155249. 1)、烟草 (Nicotiana tabacum)
(JN022535. 1)等植物亲缘关系相对较远，与苜蓿
(XP_003597033. 1)、水稻(AFK31609. 1)和牵牛花
(Ipomoea nil) (AAG24863)亲缘关系最远。
图 6 不同植物 CO氨基酸序列的系统树分析
Fig． 6 Phylogenetic tree analysis of the CO amino
acid sequences in different plants
2. 4 ApCOL基因的表达分析
对百子莲营养期、花芽诱导期和花芽分化期叶
片和茎尖中 ApCOL 基因进行实时荧光定量表达分
析，结果(图 7)表明，整个花芽分化过程中，叶片中
ApCOL表达量均高于茎尖中的表达量，3 个时期中
叶片的表达量分别是茎尖中的 1. 53、5. 66 和 2. 57
倍。ApCOL在叶片中表达量呈先升后降的趋势，花
芽诱导期表达量最高，分别是营养生长期和花芽分
化期的 1. 85 和 2. 10 倍;在茎尖的表达呈先下降后
上升的变化趋势，营养生长期的表达量分别为诱导
期和花芽分花期的 1. 99 和 1. 89 倍。推测该基因可
能在调节花芽分化过程中发挥一定的作用。对百子
莲不同组织中 ApCOL基因进行时空表达分析，结果
(图 8)表明，ApCOL在各组织中均有表达，且存在一
定的差异。花梗中 ApCOL的表达量最高，其次是叶
片，根、果实、子房和花瓣中表达量较低，茎和花葶中
有微量表达，花梗中ApCOL的表达量是叶片中的
图 7 百子莲不同发育阶段 ApCOL基因的表达分析
Fig． 7 Expression analysis of ApCOL gene in different growth
periods in A． praecox ssp． orientalis
图 8 ApCOL在不同组织中的差异表达
Fig． 8 The different expression of ApCOL in various tissued
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第 4 期 石玉波等:百子莲 CONSTANS同源基因的克隆及表达分析
2. 68 倍。说明该基因的表达具有明显的空间差异
性。不同光周期处理条件下，ApCOL 在叶片中表达
模式相同，均在暗处理时期呈现高表达，而在光处理
时期下调表达，其中短日照处理的最高表达量为最
低表达量的 7. 38 倍，长日照处理的最高表达量为最
低表达量的 10. 64 倍(图 9)。由此可见，ApCOL 的
表达呈现明显的生物钟调节特性，光周期对其表达
趋势影响不大。
图 9 不同光周期条件下 ApCOL基因的表达分析
Fig． 9 Expression analysis of ApCOL gene in under
different photoperiods
3 结论与讨论
本研究首次从百子莲中克隆得到 CO 同源基因
cDNA 全长序列，并命名为 ApCOL。利用生物信息
学软件进行多序列比对分析结果显示，ApCOL 与其
他植物中已分离的 CO基因有较高的同源性。预测
蛋白保守性分析表明，ApCOL具有 CONSTANS 家族
典型的 B-box 和 CCT 结构域，ApCOL 蛋白与可可
CONSTANS一致性高达 42. 09%，与模式植物拟南
芥 CONSTANS 蛋白的一致性也达 34. 96%。就 B-
box结构域进行比较，ApCOL 与拟南芥 CONSTANS
一致性达到 43. 90%，而 CCT 结构域一致性达到
86. 67%。由此可初步推断，ApCOL 属于 CONSTANS
家族成员之一，与拟南芥 CONSTANS 基因为同源基
因。拟南芥中 CONSTANS 蛋白家族成员有 17
个［10］，水稻中这个基因家族共有 16 个成员［11］。根
据 N末端 B-box结构特征分 3 类:第一类是在 N 末
端具有 2 个 B-box 结构;第二类是在 N 末端只有 1
个 B-box;第三类是在 N末端有 1 个正常的 B-box和
1 个二级结构改变的 B-box 锌指结构。本研究克隆
得到的 ApCOL基因推测蛋白含有 2 个完整的 B-box
结构，可以认为 ApCOL 属于 CO 家族成员中的第一
类。目前，已经从水稻［7］、拟南芥［10］、大麦［11］、番
茄［12］、马铃薯(Solanum tuberosum)［13］、牵牛花［14］等
植物上克隆得到了 CO的同源基因。这些同源基因
在矮牵牛、小麦、大麦、玉米和甜菜(Beta vulgaris)等
植物中也存在着与拟南芥相似的转录模式［14
--19］;其
中小麦、大麦和玉米等作物中都已经证明存在着与
拟南芥相似的光周期调控途径，但 CO 基因在各个
植物中的作用不尽相同，因此各种植物 CO 基因的
结构、调控和功能还有待深入研究。
通过实时荧光定量分析可以看出，ApCOL 基因
有一定时空表达差异，在百子莲不同发育时期不同
组织器官中都有表达。从发育时期来看，ApCOL 在
叶片中呈现高表达，在茎尖中低表达，且叶片中的最
高表达量和茎尖中的最低表达量均出现在成花诱导
期，由此推测 ApCOL基因对百子莲的成花转变具有
一定的促进作用，与在拟南芥中的研究结果相一
致［6］。对各器官组织表达分析显示，ApCOL 在花梗
和叶片中表达量较高，在茎中表达量最低，推测其在
百子莲开花过程中也发挥重要作用。拟南芥中 CO
基因作用的主要部位是叶片，本研究在花梗中也呈
现高表达，与拟南芥中研究结果既有一致性也存在
差异性［6，20］，与叶雪凌等［21］研究的番茄 SlCO1 基因
的表达模式相近。不同光周期处理条件下，叶片中
ApCOL基因在暗处理时期呈现高表达，ApCOL 蛋白
含有 CO 类似蛋白的保守结构域和保守氨基酸，其
表达受生物钟调节。拟南芥中，CO基因作为转录调
控因子和光依赖调控蛋白，在光周期节律和生物钟
调节方面发挥重要的作用，可在特定的日照长度下，
诱导和调控 FT 基因的表达，从而促进开花。本研
究中推测 ApCOL 也是具有生物功能的 CO 类似基
因，具体怎么调节百子莲开花，需要做进一步的功能
验证。
根据前期研究结果，结合百子莲 ApCOL 全长
cDNA 的成功克隆，对进一步探讨其表达调控特征
和分析表达产物的生化特性提供理论依据，为在分
子水平上研究百子莲开花调控途径和花期调控等方
面的尝试奠定了基础，此研究对深入探讨百子莲成
花机制，揭示植物开花机制多样性具有重要意义。
参 考 文 献
［1］ PUTTEＲILL J，ＲOBSON F，LEE K，et al． The CONSTANS gene
of Arabidopsis promotes flowering and encodes a protein showing
similarities to zinc finger transcription factors［J］． Cell，1995，
80:847--857．
［2］ SAMACH A，ONOUCHI H，GOLD S E，et al． Distinct roles of
CONSTANS target genes in reproductive development of Arabidopsis
［J］． Science，2000，288:1613--1616．
［3］ SUAＲEZ-LOPEZ P， WHEATLEY K， ＲOBSON F， et al．
CONSTANS mediates between the circadian clock and the control
of flowering in Arabidopsis［J］． Nature，2001，410:1116--1120．
［4］ YANOVSKY M J，KAY S A． Molecular basis of seasonal time
measurement in Arabidopsis［J］． Nature，2002，419:308--312．
911
北 京 林 业 大 学 学 报 第 36 卷
［5］ VALVEＲDE F，MOUＲADOV A，SOPPE W，et al． Photoreceptor
regulation of CONSTANS protein and the mechanism of
photoperiodic fowering［J］． Science，2004，303:1003--1006．
［6］ WIGGE P A，KIM M C，JAEGEＲ K E，et al． Integration of
spatial and temporal information during floral induction in
Arabidopsis［J］． Science，2005，309:1056--1059．
［7］ YANO M，KATAYOSE Y，ASHIKAＲI M，et al． Hd1，a major
photoperiod sensitivity quantitative trait locus in rice，is closely
related to the Arabidopsis flowering time gene CONSTANS［J］．
Plant Cell，2000，12:2473--2484．
［8］ LIVAK K J， SCHMITTGEN T D． Analysis of relative gene
expression data using real-time quantitative PCＲ and the 2 － ΔΔCt
method［J］． Methods，2001，25:402--408．
［9］ 张荻． 百子莲花芽分化及开花机理研究［D］． 哈尔滨:东北林
业大学，2011:113--114．
［10］ ＲOBSON F，COSTA M M，HEPWOＲTH S Ｒ，et al． Functional
importance of conserved domains in the flowering-time gene
CONSTANS demonstrated by analysis of mutant alleles and
transgenic plants［J］． Plant Journal，2001，28:619--631．
［11］ GＲIFFITHS S，DUNFOＲD Ｒ P，COUPLAND G，et al． The
evolution of CONSTANS-Like gene families in barley，rice，and
Arabidopsis［J］． Plant Physiology，2003，131(4) :1855--1867．
［12］ BEN-NAIM O，ESHED Ｒ，PAＲNIS A， et al． The CCAAT
binding factor can mediate interactions between CONSTANS-like
proteins and DNA［J］． Plant Journal，2006，46(3) :462--476．
［13］ DＲIBYAZINA P E，KHAVKIN E E． A structural homolog of
CONSTANS in potato［J］． Ｒussian Journal of Plant Physiology，
2006，53(5) :698--701．
［14］ LIU J，YU J，MCLNTOSH L，et al． Isolation of a CONSTANS
ortholog from Pharbitis nil and itsrole in flowering［J］． Plant
Physiology，2001，125:1821--1830．
［15］ HAYAMA Ｒ，IZAWA T，SHIMAMOTO K． Isolation of rice genes
possibly involved in the photoperiodic control of flowering by
afluorescent differential display method［J］． Plant and Cell
Physiology，2002，43:494--504．
［16］ NEMOTO Y，KISAKA M，FUSE T，et al． Characterization and
functional analysis of three wheat gene with homology to the
CONSTANS flowering time gene in transgenic rice［J］． The Plant
Journal，2003，36:82--93．
［17］ TUMEＲ A，BEALES J，FAUＲE S，et al． The pseudo-response
regulator Ppd-H1 provides adaptation to photoperiod in barley［J］．
Science，2005，310:1031--1034．
［18］ MILLEＲ T A，MUSLIN E H，DOＲWEILEＲ J E． A maize
CONSTANS-like gene，conz1，exhibits distinct diurnal expression
patterns in varied photoperiods［J］． Planta，2008，227(6) :
1377--1388．
［19］ CHIA T Y，MULLEＲ A，JUNG C，et al． Sugar beet contains a
large CONSTANS-LIKE gene family including a CO homologue that
is independent of the early-bolting (B)gene locus［J］． J Exp
Bot，2008，59(10) :2735--2748．
［20］ ABE M，KOBAYASHI Y，YAMAMOTO S，et al． FD，a bZIP
protein mediating signals from the floral pathway integrator FT at
the shoot apex［J］． Science，2005，309:1052--1056．
［21］ 叶雪凌，刘志勇，王孝宣，等． 番茄 CONSTANS类似基因的克
隆与表达分析［J］． 园艺学报，2008，35(11) :1607--1612．
( 责任编辑 董晓燕)
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