全 文 ：第 20卷 第 4期
19 9 2年 1 1月
河南师范大学学报 (自然科学版 )
Jo认 rna lo f He na n No rm a lU ni e v r si ty伽 a tu ra l Se i e e e n)
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199 2
黄槐叶片组织培养及植株再生的研究
冯 莉 张嘉宝
(生物系 )
摘 要 :以黄槐 (e a s si u :a : r t te n si : Bu m r . r.) 幼嫩 叶片为材料 , 分别接 种 于 附加
N A A l p p m
.
2
,
4一D l p p m 、 6一 B A Z p pm 的不 同基本培养基 M s 、 B , 、 N it sc h 、 ’ B la y d e s 、
5 5一 B一 s 、 P e 一 L : 诱导愈伤组织 , 结果表明 , M s + N A A l p p m + 2 , 4一D l p p m + 6一 B A Zp p m 诱导
愈伤组织效果最好 . 将愈伤组织转移到 M S十 N A A lp m + 6一B A ZP m 的分化培养基上 , 培养 30
天后 , 即可形成大量的芽苗丛 . 蔗糖浓度的高低影响芽的分化和苗的正常生长 , 以 2 % 的蔗糖
浓度较适宜 , 切取幼苗转移到 M s (无机盐减半 ) +I B A ZP p m 的生根培养基上 , 培养 10 天后 ,
在幼苗茎基部长根而形成完整植株 . 愈伤组织经过多次继代培养仍保留增殖和器官分化的能
力 .
关键词 : 黄槐 ; 叶片培养 ; 愈伤组织诱导 , 器官发生 ; 镇株再生 .
分类号 : Q 94 5 ·
豆科植物是种子植物中的第三大科 , 其植物分布于全世界 , 以生长于热带和亚热带的
种类最多 , 其中包括很多重要经济树种 , 与人类生活密切相关 , 且有不少种类还具有固氮
能力 , 其用途之大不亚于禾本科 , 因此 , 豆科植物组织和细胞培养的研究一直受到国内外
学者的重视 , 特别是在草本经济作物方面 , 国内外己有不少报道 .1 21, 而木本豆科植物由
于培养过程中存在外植体培养初期褐变 , 以及植株再生能力低 , 生根较困难 l3] 等问题 , 所
以通过组织培养的方法获得再生植株的为数不多 .14 5 , 6] . 本文以豆科决明属木本观赏树种
黄槐 C[ as is a : ur at tcn is s B u r m . .f1 为材料 , 在世界上首次通过叶片离体培养 , 成功获得再生
植株并且移栽后开花 . 本研究期望为快速繁殖豆科的树种提供参考 , 通过本实验可以获得
大量生长旺盛的愈伤组织和芽苗丛 , 为更深人研究黄槐原生质体培养提供材料来源 .vl
1 材料和方法
L l 材料来源 : 实验材料取自北京植物园 、 温室栽培的黄槐幼嫩枝条 .
L Z 材料处理
L 2
.
1 愈伤组织的诱导 : 材料经 70 %酒精灭菌 3 0一 60 秒 , 再经 8% 次氯酸钠溶液灭菌 7一9
分钟 , 用无菌水清洗 3 次 , 以后沿 叶片中脉切成 l x 0 . c5 m 2 的切块 , 接种于附加
N A A l p pm
、
2
,
4一 D l p p m , 6一 B A Z p p m 的 不 同 基 本 培 养 基 M s 、 N i t s e h 、 B S 、
文稿收到 日期: 19 91 刁 6一 1 .5
DOI : 10. 16366 /j . cnki . 1000 -2367. 1992. 04. 015
90 河南师范大学学拟自然科学们 ” 刃年
Bl a州 es sf] 、 P c 一L罗. 5 5一B一810 】, 于 26 ℃培养箱中暗培养 , 诱导愈伤组织 .
L 2 .2 芽分化 : 待诱导出的愈伤组织长到黄豆粒大小时 , 转移到 M S 附加不同植物激素组
合的分化培养基上 , 于 25 士 2℃ , 每天光照 1 0一 12 小时 、 光强度 1 50 lu x 的培养室中培
养 , 诱导芽分化 .
L .2 3 诱导生根 : 愈伤组织分化出大量的芽苗丛后 , 切取 cZ m 左右的苗转移到 M S (无机
盐减半 ) 附加 I B A 不同浓度的生根培养基上 , 诱导生根 .
2 观察结果
.2 1 诱导愈伤组织的形成
2
.
1
.
1 基本培养基的选择
根据以往豆科植物组织培养的资料 , 选用了在豆科植物组织培养中较常用的六种基本
培养基 , 分别附加 N A A IP m . 2 , 4一D IP pm , 6一 B A ZP pm , 蔗糖 3% . 由实验结果 (表
l) 可以看出 , M s . N ist hc , B , 较适合作为黄槐组织培养的基本培养基 , 但从形成愈伤组
织的形态和生长速度来看 , M S 诱导效果最好 。
表 1 不同基本培养基诱导愈伤组织效果的对比
基本 接种叶片 产生愈伤组 诱导率 开始出现愈 20 天
培养基 块数 织叶片块数 (% ) 伤组织天数 生长情况
十什+91420
9 2
.
0
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B ,
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2
.
1
.
2 愈伤组织的生长状况
接种于 M S 基本培养基中的黄槐叶片 , 培养 7 天 , 叶片凸凹不平 , 9 天 , 叶片切 口处
出现少量愈伤组织 , 20 天 , 叶片诱导形成愈伤组织团块 , 已看不出原来叶片的形态 。 将
愈伤组织转到光下培养 , 一周后 , 明显形成两种类型的愈伤组织 : A ,致密深绿色愈伤组
织 , 表面有许多平滑光亮的球状突起 (图 1) . B .疏松浅绿色愈伤组织 , 表面呈雪花状
(图 2 ) 。
.2 1
.
3 影响愈伤组织诱导的一些因素
2
.
1
.
3
.
1 接种方式 : 在诱导愈伤组织形成的过程中 , 发现接种叶片的方式不同 , 诱导效果
明显不同 . 叶片外植体相互重叠接种于培养基上 , 和叶片单块接种相比 , 前者诱导率和愈
伤组织生长速度明显提高 , 且以 3一4 块叶片外植体相互重叠 , 诱导效果最好 .
2
.
1
.
.3 2 材料来源 : 利用试管苗的叶片、 茎段和原植株叶片进行对比 , 发现愈伤组织的诱
导率和生长速度为 : 试管苗的茎段 > 试管苗的叶片 > 原植株叶片二
.2 2 芽的分化和生长
.2 .2 1 不定芽的发生和生长过程
外植体经过诱导 , 形成两种类型的愈伤组织 , 转移到分化培养基上 , 结果明显不同 .
第 4 期 冯 莉等
: 黄槐叶片组织培养及植株再生的研究
A 愈伤组织在分化培养过程中 , 球状突起不断增加 培养 10 天
, 有芽状体分化 (图 3) ,
继续培养 20 天 , 不定芽形成 (图 4)
,
30 天后 , 大量的芽苗丛形成 (图 5) . B 愈伤组织
在分化培养过程中 , 一般只增殖不分化
速增殖的愈伤组织所掩没 。
, 即使有个别芽点出现 , 生长很缓慢 , 不久就被迅
.2 2
.
2 激素对芽分化的影响
M S 基本培养基中附加 6一 B A Zp p m 或
一, Zp p m 分别组合
效果最好 。
, 观察结果 (表 2) 表明
6一 B A Zp p m 与 I A A 、 N A A 、 2 , 4一D 各 0 . 5 ,
,
6一B A Zp p m 与 N A A l p pm 配合使用 , 分化
2 -6 B A 与不同生睑丝塑且
激素浓度 愈伤组织
奎巡撇影鲍
分化芽的愈 分化率
i I匕兰一一一牛一一一导一一一塔于一一三气丁一一犷一一一一丁一一一一
—一华一一一一夸一一一书井一— 一不厂一一一万了一一一一一 一 20 “ .67N A A 1 2 8 2 6 9 2 . 92 3 2 1 4 4 3 . 8
一 , ` 5 1 _ 50
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2 2 9
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4 13
.名
2
.
2
.
3 不同蔗糖浓度对芽分化的影响
降低或提高 M S + 6一 B A Zp p m + N A A I P Pm 培养基中蔗糖浓度
, 对于芽分化与生长 ,
以及愈伤组织褐变程度都有明显影响 (表 3) 。 蔗糖浓度为 2%较适宜
, 愈伤组织易分化出
芽 , 且生长为有效苗多 , 易诱导生根 .蔗糖浓度业丝鱼塑道到缕遇丛通
蔗糖浓度
(% )
l
表卫
愈伤组织
褐变程度
轻
一般
较重
严重
严重
愈伤组织
生长状况
透明疏松
平滑 ,瘤状
致密 ,干燥
坚硬老化
坚硬老化
苗生长平
均高度 (c m)
苗生长
情 况
0
.名
4
.
5
4
0
.
6
0
.
5
茎叶浅绿 ,苗小
苗健壮 ,有效苗多
茎较健壮
苗小 ,叶深绿色
苗小 ,叶深绿色
蕊藻丽转人分化培养基上 2 : 天的记录 . 2 . 有麒即易诱导生根渺的苗
不定根诱导及再生植株移栽
.2 .3 1 不定根诱导及再生植株移栽
切取 2c ” 左右的无根苗抽人生根培养基中 ,一周早,日,继续培养 ,根生长迅速 ,二周后 ,平均长 cI m 左右 , 每株
在苗茎基部直接长出白色根尖 (图
-2 3条 (图 7) , 此时移栽成活率
河南师范大学学报 (自然科学们1 99 2年
较高 .若不移栽 , 继续在原培养基上培养 , 根易变褐老化 , 移栽成活率将大大降低 . 再生
植株移栽 7 个月后开花 (图 8) , 所得再生植侏在叶
形 、 叶色 、 叶的结构以及花形 、 花色 、 花的结构等方
面和原植株相同 。
1 1 2 不同 I B A 浓度对生根的影响
M S (无机盐减半 ) 附加不同浓度的 I B A , 诱导 1 . _ - 一 一
生根效果不同 (图 l) , 附加 I B A ZP p m 时 , 对诱导生根有利 ,
易形成较多的愈伤组织 , 生根率降低 , 而且根细弱 , 易变褐色 ,
1 2 3 4
若 BI A 浓度过高 ,
移栽成活率低 .
茎基部
图 放 祝 明
1
.
2 外植体经诱导形成两种类型的愈伤组织 :
1
. 致密型愈伤组织 , 表面形成许多球状突起 . 2 、 疏松型愈伤组织 , 表面呈雪花状 .
.3 4
.
5 愈伤组织转人分化培养基中培养 :
第 4 期 冯 莉等: 黄槐叶片组织培养及植株再生的研究
3
. 致密型愈伤组织部分突起形成芽状体. 4 . 继续培养 , 不定芽形成 . 5 . 芽苗丛形成 .
无根幼苗在生根培养基中培养 :
6
. 在苗茎基部分化出白色根尖 . 7 . 继续培养 , 二周后 , 根可达平均 cI m 左右 , 每株 2一 3条 , 此时移栽成
活率最高 .
8 再生植株移栽成活 , 在温室中生长 7 个月后开花 .
3 讨 论
3
.
1 组织培养的成功在一定程度上依赖于对基本培养基的选择 , 豆科植物组织培养所用
的基本培养基种类较多 [ , , 2] , 而 M s , N i t s e h , B S 、 B la y d e s 、 P e 一 L Z 、 5 5一B一 s 这 J’L 种基
本培养基在豆科植物组织培养中较常用 . 不同的培养基有其不同的特点 , 各种基本培养基
的不同元素的浓度高低相差可达 3一20 倍 l[ ’】, 所以有必要通过实验筛选出黄槐组织培养的
最适基本培养基 . 本实验证明 , 对黄槐来说 , M S 为基本培养基最适宜 .
.3 2 强调从幼态组织获取外植体是多年生木本植物离体培养成功的一个关键因素 . 木本
植物在其发育过程中都要经过幼年型和成年型两个阶段 , 这两个阶段在树形 、 解剖结构 ,
细胞生物学等方而 [’ 2]均存在很大差异 。 研究表明 , 多年生的木本植物随着年龄的增加 ,
分生组织 、 茎尖和茎的培养越困难 , 特别是成年树较幼态树培养要困难得多 13 . 法国森
林一一纤维素协会研究所进行的研究也表明 , 由成年森林树木得到的外植体在离体培养
时 , 常常生长很慢或完全不能生长 , 除非它们是选 自复壮的组织 t l4] . 本实验通过对试管
苗叶片和原植株叶片诱导能力的对比 , 发现试管苗叶片有较强的再生能力 . 这一点同
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,
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.
R 的结果 91[ 与赵成章等研究的结果 15[ 】一致 , 这可能是离体培养使多年生木
本植株体细胞复壮的结果 , 从而使再生植株具有较强的再生能力 , 其机理还有待进一步研
究 。 因此 , 我们认为在组织培养获得再生植株以后 , 利用再生植株进行大量繁殖 , 建立无
性系是较好的一种方法 , 它具有再生能力强 , 取材方便 、 不易污染等优点 。
.3 3 通过多次重复实验证明 , 利用 3 至 4 块仆卜片相互重叠接种对愈伤组织形成和生长非常
有利 。 这可能由于外植体在培养早期 , 细胞脱分化起动时 , 细胞内代谢状况都在发生剧烈
变动 , 重叠接种的方式改善了培养基与材料之间的通气性 , 从而有利于细胞内代谢活动的
进行 , 致使愈伤组织诱导率相对提高 , 另外可能存在象花粉萌发一样的群体效应 , 使愈伤
组织生长速度亦相对提高 , 这仍需进一步研究和探讨 。
参 考 文 献
l 张谦 . 植物生理学通讯 . 19 86 : ( s ) : 6 6一 76
2 H a m m a t t
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C E L L C U L T U R E A N D S0 M A T IC C E L L G EN En C S 0 F P L A N T S
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39 7一4 07
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13 陈维伦 . 植物生物技术 .科学出版社 . 19 87 :7
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P la n t B io t e e h n o l o盯 C a m b ir d g e U n iv e r s i t y P比 5 5 . 19 83 : 14 6一 1 57 (朱激等
讯
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S T U D I E S O N T I S SU E C U L T U R E A N D P L A N T L E T F O R M A T I O N O F
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fr o m t h e ca l li o n M S十N A A I P Pm 十6一B A Z PP m
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T h o er id 爪 r比 t ia it o n ft e q u en 叮 an d gt ow t h r at e o f b u d s
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k e P t t h e e a P a e it y o f p r o l讹 r a t io n a n d o r g a n o邵 n s is a ft e r s o m e g e n e r a t i o n s o f s u b e u l t u er .
K e y w o r d s : C a s s ia su r a t et n s is B u mr
. 几 L e a v e s e u lt u er ; C a u u s i n d u e ti o n ; O 铭a n o邵 n e is s ; P la n t le t
fo t r o at i o n
.
(责任编辑 任 汁 )