全 文 ：药 物 研 究
The medicine study
台湾特产牛樟芝滴丸护肝功效实验研究
刘典谟 段俊国
成都中医药大学，四川 成都 610037
【摘 要】 目的:研究台湾特产牛樟芝滴丸的护肝功效。方法:采用以自动生化分析仪检测肝功能 GOT、GPT 生化指数;抗氧化功
能相关产物麸胱甘、麸胱甘过氧化酶、超氧化物歧化酶及蛋白质浓度活性分析，以评估肝功能效价。结果:血中肝功能生化指数检测结果
显示，大白鼠腹腔注射 APAP会升高血中 GOT及 GPT指数，肝脏细胞的 GSH浓度也会减少，SOD及 GPx的酵素活性也都下降。牛樟芝滴
丸可降低 GOT及 GPT指数，升高 GSH浓度;本产品可回复 SOD及 GPx等相关抗氧化酶的酵素活性的表现，对于保护肝脏功能确有帮助。
结论:本项产品具有肝脏保护效果。
【关键词】 牛樟芝滴丸;三萜组分 Antcin B
【中图分类号】R965. 2 【文献标识码】A 【文章编号】1007 － 8517 (2012)08 － 0055 － 02
牛樟芝 (Antrodia camphorata)为仅生长在台湾特有的
牛樟树上，为台湾珍贵特有的真菌，经常被应用于养生保
健上。早期台湾原住民用来治疗因饮酒过度所造成的肝脏
病变，被原住民视为珍宝。樟芝子实体和一般的食药用蕈
菇类一样具有复杂的成分，包括多醣体、三帖类 (triterpe-
noids)、超氧歧化酵素 (superoxidedismutase)。这些成分的
生理活性功能包括:抗肿瘤 、提升免疫能力 、抗病毒 、
抗过敏、抗高血压 、抑制血小板凝集 、降血醣、降胆固
醇、抗细菌及保护肝脏。目前对牛樟芝的研究方向以樟芝
子实体甲醇萃取物或液态发酵菌丝甲醇或水萃取物之抗氧
化、抗癌、及保护肝脏为主。前期研究采用滴丸制剂改善
牛樟芝水不溶性成分吸收研究，本研究将继续探讨其新剂
型的护肝功效。
1 方法
1. 1 实验设计
将每组 12 只以上雄性 BALB /c小鼠 (20 － 25 克)分为
6 组，分别为:
A. 正常对照组:生理食盐水 (I. P. ) + d. d. H2O
(P. O.) ;
B. 负对照组 (肝损伤组) :400mg APAP /kg bw (I. P.)
+ d. d. H2O (P. O.) ;
C. 正对照组 (N － acetylcysteine (NAC)治疗对照组) :
400mg APAP /kg bw (I. P.) + 600mg NAC /kg bw (P. O.) ;
D. 牛樟芝滴丸一倍剂量 (1X)实验组:400mg APAP /
kg bw (I. P.) + 牛樟芝滴丸 (20 颗 /kg bw) (P. O.) ;
E. 牛樟芝滴丸 3 倍剂量 (3X)实验组:400 mg APAP /
kg bw (I. P.) +牛樟芝滴丸 (60 颗 /kg bw) (P. O.) ;
F. 牛樟芝滴丸 5 倍剂量 (5X)实验组:400 mg APAP /
kg bw (I. P.) +牛樟芝滴丸 (100 颗 /kg bw) (P. O.)。
1. 2 步骤
A组腹腔注射生理食盐水 (0. 6ml /30g bw for mice) ，B
－ F 组腹腔注射 400mg APAP /kg bw (0. 6ml /30g bw for
mice) ，每周两次 (星期一及四)于样品灌喂前一小时进行
肝炎诱导，减少药物及样品互相影响;并在 A、B组每日灌
胃 d. d. water，在 C 组灌喂 NAC (600 mg /kg bw for mice) ，
在 D － F组则分别灌以试验样品，共为期八周。所有实验动
物每周投予试验样品 (d. d. H2O 或 NAC)后 4 小时，以尾
部采血方式检测肝脏的生化功能:GOT (AST)、GPT
(ALT)。最后于第八周结束时全部牺牲，并剖腹取肝脏标
本 ，秤重后将最大右叶肝割取一半固定于 10 %的中性福
尔马林 (formaline)液中，石蜡包封切片后分别作苏木紫
－伊红染色 (haematoxylin － eosin stain，HE stain)来进行病
理学观察外，并做胶原蛋白的特殊染色 (Masson’ stri-
chrome stain) ，以便评估肝纤维化程度。另外将其余肝脏分
别进行检测抗氧化成分 glutathione (GSH)、glutathione per-
oxidase (GSH Px)、glutathione reductase (GSH Rd)、glutathi-
one S － transferase (GST)、superoxide dismutase (SOD)与
catalase等酵素活性。
实验数据统计分析采用 SAS 计算机统计软件包 (SAS
institute，Cary，NC)进行变异数分析 (analysis of variance，
ANOVA) ，并以 Duncantest来测试不同处理间显著差异效
果 (P ＜ 0. 05)。
1. 3 肝功能生化指数的检测
所有小鼠血液样品在室温下放置一小时以使其凝结。
再以冷冻离心机于 4℃下每分钟 12，000 rpm 离心 5 分钟，
来分离血清。再以自动生化分析仪检测肝功能生化指数，
如 GOT、GPT等。
1. 4 抗氧化功能相关产物及酵素活性之分析
(1)麸胱甘 (Glutathione，GSH)浓度之分析
Glutathione浓度的分析系采用 Cayman Chemical 公司生
产的分析试剂组 (glutathione assay kit)测定之，其检测方法
简述如下。取肝组织，以均质液 (50 mmol / l MES，1 mmol /
l EDTA，1 mmol / l DTT，pH 6 － 7)均质之，在 10，000 g，
4℃下离心 15 分钟。取上清液以等体积的方式加入 1 mol / l
之 metaphosphoric acid 溶液混合之，于室温下反应 5 分钟后
离心 (3，000 g，2 分钟) ，取上清液加入 4 mol / l之 trietha-
nolamine (20:1，v /v)混合。取此混合液 50μl 加入 150μl
之 assay Cocktail (MES，reconstituted Cofactor Mixture，recon-
stituted Enzyme Mixture，reconstituted DNTB) ，反应开始后，
以 plate reader读取每 5 分钟 405 nm波长的吸光值至反应进
行至 30 分时为止，计算 GSH之浓度。
(2)麸胱甘过氧化酶 (glutathione peroxidase，GPx)活
性之分析
GPx酵素的活性系使用 Cayman Chemical 公司生产的分
析试剂组 (glutathione peroxidase assay kit)测定之，其检测
方法简述如下。取肝脏细胞，以均质液 (50 mmol / l Tris －
HCl，5 mmol / l EDTA，1 mmol / l DTT，pH 7. 5)均质之，在
10，000 g，4℃下离心 15 分钟。取上清液 20μl 加入 100μl
的 assay buffer (50 mmol / l Tris － HCl，5 mmol / l EDTA，pH
7. 6)、50μl 的 co － substrate 液 (lyophilized NADPH，gluta-
thione，glutathione reductase)混合后，加入 20μl 含 Gumene
hydroperoxide的溶液开始反应。每分钟以 plate reader 分析
340 nm波长的吸光值并纪录之，最后分析 GPx 酵素的活性
(specific activity)。
(3)超氧化物歧化酶 (superoxide dismutase，SOD)活
性之测定
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中国民族民间医药
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SOD酵素的活性系使用 Dojindo Molecular Technologies
公司生产的分析试剂组 (SOD assay kit － WST)测定之，其
检测方法简述如下。取肝组织加入适量缓冲液 (0. 32 mol / l
Sucrose、l mmol / l EDTA、10 nmol / l Tris － HCl，pH 7. 4)均
质之。以 1，400g离心 5 分钟，取上清液，再以 4，500 g
离心 10 分钟，下层之沈淀物加入缓冲液测 Cu /Zn － SOD
(cytosolic SOD) ，上清液再以 11，000 g离心 60 分钟，取沈
淀物加入缓冲液分析 Mn － SOD (mitochondrial SOD)。每
20μl的检体，加入 200μl的 Reagent Solution及 20 μl 的 En-
zyme Working Solution，于 37℃反应 20 分钟，再读取 450 nm
波长的吸光值并计算 SOD的活性。肝组织 SOD活性，以每
单位蛋白质所含 SOD单位量表示 (U/mg protein)。
(4)蛋白质浓度之测定
实验参照 Lowry 之方法进行 (Lowry et al.，1951)。取
适量蛋白质样品，并以 1 N NaOH 来调整使其最终体积为
100 ml，加入 200 ml去离子水及 100 ml 反应混合液 (25%
Na2CO3 :2% Na － K － tartarate :1%CuSO4 = 8 :1 :1，v /
v /v) ，然后在室温下静置 10 分钟，加入 1 ml Folin reagent
(Folin :H2O = 1 :19. 5)后于 37 ℃水浴 20 分钟，并在室
温下冷却，最后在分光光度计以 660 nm下测其吸光值 (25
℃)。然后将标准曲线做线性回归，得一方程式，将所得样
品之吸光值代入此一元一次方程式，换算后即可得知样品
之蛋白质含量。
1. 5 实验数据统计分析
所有的数据均以平均值 ± 标准差来表示 (mean ±
SD)。不同药物处理的组别以变异数分析 (ANOVA)计算，
并以 Duncan’s post － hoc test评估其统计上之差异;p 值小
于 0. 05 者表示具有显著的差异。
2 结果与结论
2. 1 牛樟芝滴丸对肝功能相关酵素活性的影响
从西医的角度，当肝脏受到疾病或及他因素导致肝细
胞的损伤时，可以由血中的肝功能生化指数上升来进行初
步的检测。一般而言，指的就是血液中 GPT及 GOT两种酵
素的活性上升。因此，对于药物或是健康食品是否具有疗
效或是保护肝功能的作用，可以由该药物或健康食物是否
能回复其肝功能着手 (Wonget al.，2000;Hase et al.，
1996)。
负对照组的小鼠经腹腔注射乙酰胺基苯酚 (APAP)
后，其血清 GOT、GPT 的指数，在处理后的第一周，显著
的较正常对照组为高，显示 APAP 在一周时己对小鼠的肝
脏产生损坏，同时，GOT 及 GPT的指数到实验结束前仍维
持显著上升的现象。因此，本项实验动物模式确实为慢性
肝损伤动物，可供药物或健康食品进行护肝功效的评估。
正对照组除注射 APAP 之外，同时也以口服的方式给
予小鼠 N －乙酰半胱胺酸 (N － acetylcysteine，NAC)治疗。
与正常对照组相较，处理一到八周的 GOT及 GPT的指数均
显著的较高，然而与负对照组相较，则明显的降低。治疗
组的 GOT及 GPT指数，在实验过程中虽显著的较正常对照
组为高，然而经口服给予牛樟芝滴丸的治疗后，与负对照
组相较，其 GOT 及 GPT 指数可随着牛樟芝滴丸剂量的增
加，呈现剂量相关性的降低。
2. 2 牛樟芝滴丸对小鼠肝脏中各种抗氧化功能相关成份及
酵素活性的影响
机体组织中有一系列有效的抗自由基损伤系统，其中
最重要的酵素有超氧化物歧化酶 (superoxide dismutase，
SOD)。SOD是一种金属酶，Cu /Zn － SOD 主要存在于真核
细胞的细胞浆内，由两个亚基组成，每个亚基含 1 个铜和 1
个锌;Mn － SOD存在于真核细胞的粒腺体，由 4 个亚基组
成，每个亚基各含 1 个锰;这两种 SOD 皆能清除体内自由
基，减轻自由基对细胞的损伤 (Wells et al.，1997，Gut-
teridge ＆ Halliwell，2000)。其它的自由基清道夫 (scaven-
ger) ，如麸胱甘过氧化酶 (glutathione peroxidase，GPx)在
清除氧自由基也有其重要性 (Arthur，2000)。GSH 是体内
抵抗外来有害物质最强的防御物质 (Ketterer，1998) ，而
SOD及 GPx清除自由基的能力与酵素活性成正比。
小鼠经 8 周的不同处理后，其肝脏细胞 glutathione
(GSH)的浓度，以经过 APAP处理八周后的负对照组小鼠
为最低。NAC或牛樟芝滴丸处理后之组别，其 GSH浓度则
较负对照组显著的提高;同时，牛樟芝滴丸的此项作用并
具剂量相关性。
经过 APAP处理八周后的负对照组小鼠，其肝脏细胞
GPx 活性显著的较正常对照组为低。NAC 处理八周后之正
对照组小鼠的 GPx活性，与正常对照组相较则没有显著差
异;而且，也显著的较负对照组为高。小鼠经口服给予牛
樟芝滴丸治疗后，与负对照组相较，其 GPx 活性可随着牛
樟芝滴丸剂量的增加，逐渐地恢复;与正常对照组相较无
显著异差。
负对照组小鼠肝脏超氧化歧化酶 (SOD)的活性检测
结果显示，APAP 处理八周后，其 SOD 的活性，包括铜 －
锌型 SOD (Cu /Zn － SOD)及锰型 SOD (Mn － SOD)均较正
常对照组为低。经过 NAC处理八周后的正对照组，小鼠肝
脏的两种 SOD活性均显著的较负对照组为高。口服牛樟芝
滴丸八周后的小鼠，不论是 Mn － SOD的活性或是 Cu /Zn －
SOD的活性皆会随着牛樟芝滴丸剂量的增加而逐渐的提高。
由此可知，牛樟芝滴丸和 NAC 具有雷同的效果，能使
因被 APAP损坏之肝细胞其粒腺体及网状内皮组织系统恢
复正常，对于肝功能指数或是抗氧化酶具有回复作用。
综上所述，由血中肝功能生化指数检测结果显示，大
白鼠腹腔注射 APAP会升高血中 GOT及 GPT指数，肝脏细
胞的 GSH浓度也会减少，SOD 及 GPx 的酵素活性也都下
降。牛樟芝滴丸可降低 GOT 及 GPT 指数，升高 GSH 浓度;
并且，本产品可回复 SOD及 GPx等相关抗氧化酶的酵素活
性的表现，对于保护肝脏功能确有帮助。因此，本产品具
有肝脏保护效果。
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(收稿日期:2012. 02. 23)
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