全 文 ：·研究简报 Note·
花叶千年木花序梗愈伤组织直接再生花芽的初步研究
李学东　常　青
(首都师范大学生物系　北京　100037)
陆文
(中国科学院植物研究所　北京　100093)
关键词　花叶千年木 ,花芽再生 , 组织培养
A Preliminary Study on Direct Regeneration of Flower Buds from
Peduncle Calli in Dracaena fragrans
cv.massangeana
LI Xue-Dong　CHANG Qing
(Department of Biology , Capital Normal University , Beijing 100037)
LU Wen-Liang
(Institute of Botany , The Chinese Academy of Sciences , Beijing 100093)
Abstract　Flower buds were directly regenerated from calli in vitro in the woody plant Dracaena fragrans cv.
massangeana Hort.On modified MS medium supplemented with 1.0 mg/L 6_BA and 1.0 mg/L IBA , two
kinds of calli , A and B , were formed from the peduncle explants cultured for 5 months.Calli A were loose and
on their surface there were many irregular granule_like structures(GLC);Calli B were compact and had bigger
tumor_like structures (TLC)on their surface.When the GLC and TLC were transferred onto the medium
respectively with 0.4 mg/L 6_BA and 1.0 mg/L IBA , flower buds were differentiated directly from the GLC
but only vegetative buds and roots were differentiated from the TLC after culturing for 4 weeks.The GLC could
be partly transformed into TLC in the continuous passage culture.Assays on hormones revealed that at a fixed
IBA concentration of 0.4 mg/L the defferentiation frequency of flower budding was increased as the 6_BA
concentration was decreased from 2.0 mg/L to 10 mg/L.Alternatively , at a fixed 6_BA concentration of 2.0
mg/L , the flower budding frequency was increased when the IBA concentration was changed from 0.4 mg/L to
1.0 mg/L.Moreover , the addition of 2.0 mg/L zeatin to the culture medium containing 2.0mg/L 6_BA and
0.4 mg/L IBA was favorable to the regeneration of the flower buds.Nevertheless supplementing 1.0 mg/L
GA3 into the medium on which the calli had differentiated into flower buds , the flower buds would gradually
wither after 2 weeks in culture.
Key words　Dracaena fragrans cv.massangeana , Regeneration of flower buds , Tissue culture
　　在离体条件下 ,诱导愈伤组织或外植体直接再
生花芽已经在许多草本植物上取得成功[ 1～ 7] ,而就
木本植物来说 ,迄今尚未见到成功的报导。诱导愈
伤组织或外植体直接再生花芽所形成的离体培养实
验系统将十分有利于研究雌 、雄性器官分化和发育
所必需的条件[ 8]和找到所需条件之间的差异 。利用
这种差异目前已经成功地控制了雌 、雄性器官中任
何一种器官的发育和败育 ,从而控制了植株形成雌
花或雄花[ 9] 。木本植物性别控制的研究具有十分重
要的意义 ,在离体条件下诱导花芽直接再生的成功
将为木本植物性别控制的研究开创一条新的途径。
1　材料和方法
花叶千年木(Dracaena fragrans cv.massangeana
Hort.),盆栽于首都师范大学生物系植物实验室。
以花叶千年木花刚刚开谢的花序梗为外植体。在
0.1%HgCl2溶液中表面消毒 8 min ,无菌水冲洗 4 ～
5次后切成厚度为 5 mm 的切段 ,接种到培养基上。
所用培养基在MS 原有成分[ 10]基础上增加170 mg/L
收稿日期:1998-07-17　接受日期:1998-12-24
植　物　学　报　1999 , 41(6):672～ 674
Acta Botanica Sinica
KH2PO4 , 0.6 mg/L VB1 ,并附加 0.2 mg/L 生物素 ,
5.0 mg/L 抗坏血酸 , 0.5 mg/L 叶酸 。根据实验需要
附加不同种类和不同浓度的外源激素。实验材料在
LRH_250_G型光照培养箱中培养 。每天光照(3 000
lx)13 h ,黑暗 11 h;诱导愈伤组织及花芽再生的温
度为(24 ±1)℃;诱导再生花芽开花的温度为
(16±1)℃。Olympus实体显微镜被用于观察和照
相。
2　实验结果
2.1　愈伤组织的诱导
花后的花序梗虽已经进入程序化死亡阶段 ,但
是在附加 1.0 mg/L 6_BA和 1.0 mg/L IBA的培养基
上仍可诱导愈伤组织形成 。接种 4 ～ 5个月后 ,外植
体已经变成褐色 ,切面中央也已裂开 ,在裂口基部可
观察到正在形成的愈伤组织 。愈伤组织初期白色 ,
表面聚集许多细小的灰白色略透明的结晶颗粒。随
着培养时间的延长愈伤组织由内向外逐渐变成绿
色。这种愈伤组织经过多次继代培养后最终形成了
两种类型:一种在整体体积增加的同时 ,外部细小的
结晶颗粒体积也增加(达 2 ～ 3倍), 愈伤组织质地
疏松 ,并且在表面形成不规则的颗粒状突起(质地致
密 ,直径 0.5 mm),我们称之为表面颗粒状愈伤组织
(granule_like callus , GLC)(图版 Ⅰ , 1_A 、2)。另一种
在整体体积增加的同时原有结晶状物逐渐消失 ,并
逐渐形成质地坚硬的肿块状结构 ,它表面较光滑 ,边
界明显 ,直径 5 mm左右 ,我们称之为肿块状愈伤组
织(tumor_like callus ,TLC)(图版 Ⅰ , 1_B)。表面颗粒
状愈伤组织在不断的继代培养过程中会逐渐向肿块
状愈伤组织转化 。实验表明(表 1)在培养 15 d时 ,
所有愈伤组织都是表面颗粒状的 ,但是当继代培养
40 d时 ,有 20%的表面颗粒状愈伤组织已经转变为
肿块状的。当继代培养到 70 d时已有 25%的表面
颗粒状愈伤组织发生了转化。
表1　在继代培养中表面颗粒状愈伤组织(GLC)向肿块状愈
伤组织(TLC)转化的频率
Table 1　The frequency of transformation on granule_like callus(GLC)transformed toward tumor_like callus(TLC)in subculture
Times of subculture
(Day)
　No.observed
(Piece)
No.of GLC
transformed
into TLC(Piece)
Frequency of
transformation
(%)
15 7 0 0
25 25 2 8.0
40 15 3 20.0
55 11 2 19.2
70 8 2 25.0
2.2　从愈伤组织诱导花芽的直接再生及诱导开花
将在上述培养基上继代培养了 2个月的愈伤组
织转移到附加 0.4 mg/L 6_BA和 1.0mg/L IBA 的培
养基上 ,温度为(24±1)℃, 培养 2 ～ 3周后 ,肿块状
愈伤组织(TLC)表面出现白色的突起并不断生长 、
伸长 ,最后形成营养芽或不定根。表面颗粒状愈伤
组织(GLC)表面的颗粒状结构一部分萎缩 ,另一部
分生长形成突起 。突起长至 2 mm 后 ,逐渐分化出
花芽(图版Ⅰ , 3)。在花芽分化过程中 ,首先分化的
是花被 。一周后 ,花芽转变成绿色 ,在花被基部出现
花梗 。当花芽的长度达到 6 ～ 7 mm (花梗长 3 ～ 4
mm)时 ,可观察到花芽具 6 个花被片 ,分为内外两
轮 ,各 3个(图版Ⅰ ,3 、4)。随着花芽的长大 ,外轮花
被的顶端逐渐分开 ,每个花被上部 1/3处向中轴方
向弯曲 ,以下部分较直 。内轮花被顶端除个别分开
外其余的始终连接 。花芽在此条件下停止了生长发
育 ,颜色不变 ,也不开花 。
为了探索开花的条件 ,我们进行了赤霉素试验
和温度试验 。赤霉素试验是把在 2.0 mg/L 6_BA 和
0.2 mg/L IBA 的培养基上已经分化了花芽的外植体
转移到 2.0 mg/L 6_BA 、0.2 mg/L IBA和 1.0 mg/L
GA3的培养基上 ,观察其变化 ,结果是 2周后原有花
芽并未生长 ,而是发生了不同程度的萎缩退化 ,有的
甚至全部退化。温度试验是将花芽分化早期的愈伤
组织由(24±1)℃转入(16±1)℃的条件下 , 培养
观察其变化 , 3 ～ 4周后 ,花芽逐渐长大 ,由黄绿色转
为淡紫色 ,其中出现明显的紫红色条纹 , 长度达 15
mm(图版 Ⅰ , 3 、4),与自然状态下的花芽大小颜色
接近 ,完成了正常发育过程 。开花历时1周 ,初期花
被顶端粘连 ,中部裂开(图版 Ⅰ , 3←),随后 6枚雄
蕊(S)紧贴花被一起外翻 ,露出雌蕊(P)的柱头 、花柱
和子房 ,通常为 1枚雌蕊 ,也有多个雌蕊的现象(图
版 Ⅰ ,3 、4),更细致的结构还有待进一步研究。
2.3　外源激素对愈伤组织再生花芽的影响
6_BA 与 IBA 不同浓度的组合对愈伤组织分化
花芽影响的实验表明(表 2):当 0.4 mg/L 6_BA 、1.0
mg/L IBA 时 ,花芽分化频率最高(73.3%)。当 IBA
浓度固定在 0.4 mg/L 时 ,花芽分化频率随 6_BA浓
度的升高而降低 ,表明在生长素浓度较低的情况下 ,
高浓度的细胞分裂素不一定有利于花芽的分化 。当
6_BA固定在2.0 mg/L时 ,花芽分化频率随 IBA浓度
的升高而升高表明细胞分裂素处于一个较高的浓度
水平时 ,生长素浓度的升高可能对花芽分化有利。
玉米素实验表明 ,当 2.0 mg/L 6_BA 、 0.4 mg/L IBA
6 期 李学东等:花叶千年木花序梗愈伤组织直接再生花芽的初步研究 673　
时 ,再向培养基中加入 2.0 mg/L zeatin ,花芽分化的
频率从11.8%提高到 41.7%,表明玉米素可能对花
芽分化有促进作用。
表 2　外源激素对愈伤组织再生花芽的影响
Table 2 　 The effect of exogenous hormones on regeneration of
flower buds from calli
Exogenous
hormones(mg/ L)
6_BA IBA zeatin
No.of calli
(Piece)
No.of calli dif-
ferentiating into
f lower buds
(Piece)
Frequency of
flower bud dif-
f erentiation(%)
0.4 1.0 15 11 73.3
1.0 0.4 20 13 65.0
2.0 2.0 11 5 45.5
2.0 0.4 17 2 11.8
2.0 0.4 2.0 12 5 41.7
3　讨论
离体培养中由培养物直接形成花芽有两条途
径。一条是外植体首先发育形成愈伤组织 ,然后由
愈伤组织直接分化花芽[ 11] 。另一条是外植体不经
过愈伤组织阶段直接发育形成花芽[ 2] 。前者在进一
步研究中应用更为广泛。这不但是因为愈伤组织可
以不断地继代培养以扩大其数量 ,而不受季节限制 ,
并且在愈伤组织阶段引入外源遗传物质也较为容
易。再者愈伤组织通过悬浮培养分散成单细胞后 ,
还可以从事原生质体融合等项研究 。然而此途径的
不足之处正如本实验所揭示的那样(表 1),在愈伤
组织继代培养中容易失去其花芽分化的能力 。本实
验中继代培养 70 d 以后 ,25%的表面颗粒状愈伤组
织已转变为不能分化花芽的肿块状愈伤组织 。花芽
分化能力丢失的原因很复杂 ,除了基因型的原因之
外可能还与培养基中外源激素的种类与浓度配比以
及培养条件的调控直接有关。因此 ,建立和完善经
愈伤组织直接分化花芽的系统的关键是必须做进一
步的实验以防止愈伤组织继代培养中花芽分化能力
的丢失。
参 考 文 献
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Taihangia rupestris─Different temperature requirements for
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图 版 说 明
图版Ⅰ 　1.花叶千年木花序梗外植体形成的两种愈伤组
织。A.疏松的表面颗粒状愈伤组织(GLC)。 B.致密的肿块
状愈伤组织(TLC )。 ×0.5　2.疏松的表面颗粒状愈伤组织
放大。 ×30　3.疏松的表面颗粒状愈伤组织(GLC)分化形
成的花芽刚刚开花。 ×6　4.花盛开时 , 示雄蕊(S)和多枚
雌蕊(P)。 ×6
Explanation of Plate
Plate Ⅰ 　Fig.1.The two calli derived from peduncle explant of
Dracaena fragrans cv.massangeana Hort.A.Loose calli with
granule_like structures on surface(GLC).B.Compact calli with
tumor_like structures (TLC).×0.5　Fig.2.Enlargement of the
GLC.×30　Fig.3.The blooming flower buds differentiated from
the GLC.×6 　Fig.4.The flowers were in full bloom , showing
stamens(S)and pistils (P).×6
674　 植　　　物　　　学　　　报 41 卷
李学东等:花叶千年木花序梗愈伤组织直接再生花芽的初步研究 图版Ⅰ
LI Xue-Dong et al.:A Preliminary Strdy on Direct Regeneration of Flower Buds from
Peduncle Calli in Dracaena fragrans cv .massangeana Plate Ⅰ
See explanation at the end of text