全 文 ：品中斑蝥素的含量，结果见表 1。
表 1 斑蝥转化前后斑蝥素含量变化比较
品种 产地 称样量/g
转化前
含量 /%
转化后
含量 /%
安徽 0. 2504 0. 70 1. 29
南方大斑蝥 安徽 0. 2509 0. 69 1. 29
湖南 0. 5004 1. 15 2. 01
4 讨论
4. 1 转化机理的探讨 斑蝥素在斑蝥体内呈两种
形式存在，分别为游离型及结合型，通过红栓菌发酵
后使斑蝥素溶出率增加可能有以下两种原因:红栓
菌中含有的微生物酶可以降解这种结合方式，从而
增加斑蝥素的溶出率;红栓菌中的微生物酶可以与
斑蝥体内斑蝥素的结合物竞争结合斑蝥素，从而增
加斑蝥素的溶出率。
4. 2 对斑蝥资源的合理利用 随着人们生活环境
的变化，癌症的发病率有增高的趋势，中药斑蝥作为
较强的抗肿瘤药得到了广泛的应用〔4〕，应用量不断
增加，而其来源主要靠自然资源，这就为斑蝥的使用
带来了资源紧张的压力。目前斑蝥的人工养殖处于
起步阶段，所以提高斑蝥的使用效率显得非常必要。
本实验利用红栓菌同斑蝥进行生物转化，红栓菌通
过深层次发酵培养，其自身产生的红栓菌胞外多糖
也具有很好的抑制肿瘤作用，同样具有很好的研究
利用价值〔3〕。实验结果显示通过红栓菌进行生物
转化的方法使斑蝥素的溶出率可以提高 2 倍左右，
从而使斑蝥得到更合理的利用。本方法对于提高与
拓宽斑蝥临床药用价值，节约成本，缩短转化周期都
具有重要的意义。
参 考 文 献
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·资源·
侵染浙贝母的百合斑驳病毒 CP基因
的原核表达及抗血清制备
韦传宝1，2，姚厚军1，杨 宇1，刘春云1
(1. 皖西学院生物与制药工程学院，安徽 六安 237012;2. 安徽仿生传感与检测技术实验室，安徽 六安
237012)
摘要 目的:制备抗百合斑驳病毒(Lily mottle virus，LMoV)CP血清，为研究侵染不同植物 LMoV之间的血清学
关系以及大田检测 LMoV奠定基础。方法:根据 Genbank报道的百合斑驳病毒 CP基因序列设计引物，扩增其外壳
蛋白基因并分析序列。将 LMoV CP基因插入表达载体 pSBET，转化大肠杆菌 BL21(DE3)Plys E菌株，通过 IPTG诱
导表达。经 12% SDS-PAGE和 5% ～20%梯度 SDS-PAGE两次纯化 CP，免疫小鼠获得抗 CP血清，采用Western blot
分析抗体的特异性，采用 ELISA分析抗体能否与天然 LMoV 病毒结合。结果:LMoV 的 CP 与目前已报道的 LMoV
不同分离物 CP基因核苷酸序列同源性为 95% ～99%，氨基酸序列同源性为 98% ～100%。制备的抗体对 CP具有
高度特异性，且能够与天然 LMoV病毒离子结合。结论:本研究制备的抗血清可以作为百合斑驳病毒的检测。
关键词 浙贝母;百合斑驳病毒;CP基因;原核表达;抗血清制备
中图分类号:Q785 /S436. 421 文献标识码:A 文章编号:1001-4454(2011)08-1182-05
收稿日期:2011-02-15
基金项目:安徽省教育厅自然科学基金重点项目资助(KJ2010A328;KJ2011A272)
作者简介:韦传宝(1961-) ，男，博士，副教授，主要从事中药生物技术研究;E-mail:weichuanbao@ sina. com。
Prokaryotic Expression of LMoV CP Gene and Preparation of Its Antiserum
WEI Chuan-bao1，2，YAO Hou-jun1，YANG Yu1，LIU Chun-yun1
(1. Biological and Pharmaceutical Engineering College，Western Anhui University，Luan 237012，China;2. Anhui Provincial Labora-
·2811· Journal of Chinese Medicinal Materials 第 34 卷第 8 期 2011 年 8 月
DOI:10.13863/j.issn1001-4454.2011.08.004
tory of Biomimetic Sensor and Detecting Technology，Luan 237012，China)
Abstract Objective:To prepare antiserum against the CP of Lilg mottle virus(LMoV). Methods:Specific primer was designed
according to Genbank to amplify CP gene of LMoV of Fritillaria thumbergii and its sequence was analyzed. Then the CP gene was in-
serted into pSBET and expressed in Escherichia coli BL21(DE3)plys E strain. The objective protein was purified by 12% SDS-PAGE
firstly and subsequently 5% -20% gradient SDS-PAGE. The antiserum against the CP was raised in mouse and their specificity was de-
termined by Western blot. The ability to combine with nature LMoV particles was confirmed by ELISA analysis. Results:LMoV CP
gene shared 95% -99% nucleotide identities and 98% -100% amino acid identities with the CP genes reported on Genbank. The antise-
rum was special to LMoV CP and IgG against LMoV could combine LMoV particles. Conclusion:The antiserum prepared in this study
is suitable for LMoV detection.
Key words Fritillaria thunbergii Miq.;Lily mottle virus;CP gene;Prokaryotic expression;Antiserum preparation
药用贝母是重要的中药材，包括川贝、浙贝、平
贝和皖贝等，以球茎入药。贝母虽然有种子，但用种
子繁殖要 5 年鳞茎才能采收，用球茎繁殖仅仅需要
1 ～ 2 年，因此贝母多用球茎繁殖。长期营养繁殖导
致种质退化、产量低且品质下降。虽然导致贝母种
质退化的原因可能是真菌、细菌和病毒〔1〕，但病毒
侵染导致减产已经被证实〔2〕。笔者首先在有花叶
和斑驳症状的浙贝母叶片中发现一种病毒，暂命名
为浙贝母花叶病毒(Thunberg fritillary mosaic virus，
TFMV)〔3〕，随后又在浙贝母中分别发现了另外 2 种
病毒，一种暂命名为浙贝母 Y病毒(Fritillary virus Y，
FVY)〔4〕，另一种为百合斑驳病毒(Lily mottle virus，
LMoV)〔5〕。3种病毒均为马铃薯 Y病毒属成员，基因
组为单链正性 RNA，约 10 kb。侵染贝母的 3 种病毒
可以单独侵染，也有复合侵染的情况〔4〕。笔者前期已
经原核表达并制备了 TFMV-CP 的抗血清(另文发
表) ，本研究对 LMoV的 CP 基因进行克隆、原核表达
并制备抗 CP血清，为研究侵染不同植物 LMoV之间
的血清学关系以及大田检测 LMoV奠定基础。
1 材料和方法
1. 1 材料 从浙江宁波采集有明显花叶症状的贝
母叶片置 － 80 ℃冰箱保存。大肠杆菌 TG1 菌株和
表达菌株 BL21(DE3)Plys E 购自 Pharmacia 公司;
pGEM-T和 pSBET 载体为 Promega 公司产品;AMV
Reverse Transcriptase、Ribonuclease Inhibitor、Ex Taq
DNA聚合酶、T4 DNA Ligase、Bam HI、Nde I、和 DNA
Ligation Kit ver. 2 为 TaKaRa 公司产品;1 kb DNA
Marker为 MBI公司产品;QIAquick Gel Extraction 试
剂盒、羊抗鼠 IgG(共价结合碱性磷酸酶)、5-溴-4-
氯-3-吲哚磷酸(BCIP)和氮蓝四唑(NBT)为 Sigama
公司产品;低分子量标准蛋白为中国科学院上海生
物化学研究所产品;其它试剂均为进口分装的分析
纯;引物合成以及测序由上海生工完成。
1. 2 植物病叶总 RNA 提取与 cDNA 合成 按照
RNeasy Plant mini(QIAGEN)试剂盒提供的方法提取
浙贝母病叶总 RNA，LMoV 基因组 RNA 含在其中，
－80 ℃保存。以 M4-T(5-GTTTTCCCAGTCACGAC
(T)15-3)为起始引物，采用禽源逆转录酶体系，20
μL反应体系包括:10. 5 μL 模板 RNA;4. 0 μL 5 ×
逆转录反应缓冲液;0. 5 μL RNase Inhibitor (40 U /
μL) ;2. 0 μL 起始引物(100 μmol /L) ;2. 0 μL
(dNTPs) ;1 μL AMV (5 U /μL)。42 ℃水浴合成
1. 5 h后于 － 30 ℃冰箱备用。
1. 3 原核表达 根据 Genbank 上已报道的 LMoV
CP序列设计引物，划线处为 Nde I 和 Bam H I 的酶
切位点。
LMoV -CPe(+) :5 -CCATATGAATGAGACACT-
CAATGCTGGAG-3
LMoV-CPe(－) :5-GGGATCCTTACATAGAAAT-
TCCAAGTAAGG-3
以病样第一链 cDNA为模板，PCR扩增采用 LA
Taq DNA聚合酶，反应体系参照厂家说明。PCR 扩
增全长 CP基因，1%(w /v)琼脂糖凝胶电泳分离预
期大小的扩增产物，用 QIAquick Gel Extraction 试剂
盒回收，方法参照厂家说明。纯化产物导入 pGEM-
T载体，转化 TG1 菌，蓝白斑筛选，提取阳性克隆质
粒，PCR检测后测序。将含 CP 基因的质粒用 Nde I
和 Bam H I双酶切后插入到同样双酶切的原核表达
载体 pSBET中，转化大肠杆菌BL21(DE3)plysE
图 1 LMoV CP 基因 RT-PCR 扩
增产物琼脂糖凝胶电泳分析
M. DNA Marker 1. LMoV CP基因 RT-PCR产物
·3811·Journal of Chinese Medicinal Materials 第 34 卷第 8 期 2011 年 8 月
图 2 LMoV浙贝母分离物 CP基因核苷酸序列与已报道的不同分离物序列比对
菌株，IPTG 诱导表达蛋白，12% SDS-PAGE 后用考
马斯亮蓝 G-250 染色检测蛋白表达情况。
1. 4 抗血清的制备和 Western blot 检测 将能正
确表达 CP基因的大肠杆菌与 2 × SDS 上样缓冲液
混合裂解，煮沸 10 min离心去除沉淀，对含 CP的上
清液进行 12% SDS-PAGE分离纯化，电泳完毕后用
0. 25 mol /L 4℃预冷的 KCl 溶液染色。切下目的蛋
白条带，用适量 1 × SDS 上样缓冲液匀浆后离心提
取初步纯化的 CP，上清液进行 5% ～ 20%梯度 SDS-
PAGE二次分离纯化，电泳完毕后用 4 ℃预冷的
0. 25 mol /L KCl 溶液染色。切下目的蛋白条带，加
生理盐水充分研磨后免疫小鼠，每隔 7 d 免疫 1 次，
第 4次免疫3 d后断头取血，制备抗血清。用Western
blot法检测抗LMoV的CP血清的特异性，二抗为羊
·4811· Journal of Chinese Medicinal Materials 第 34 卷第 8 期 2011 年 8 月
图 3 LMoV浙贝母分离物 CP基因氨基酸序列与已报道的不同分离物 CP基因比对
图 4 LMoV CP 转化的 BL21(DE3)plys E 菌经
IPTG诱导表达 2 h后 12% SDS-PAGE检测
M. protein marker 1. IPTG 诱导 BL21(DE3)Plys E 菌(CK-)
2. LMoV CP基因转化并经过 IPTG诱导 2 h的 BL21(DE3)Plys E菌
抗鼠 IgG(共价结合有碱性磷酸酶) ，BCIP /NBT 显
色〔6〕。
1. 5 样品的间接 ELISA 检测 用制备的抗 LMoV
CP血清分别与带 LMoV 病毒浙贝母病叶进行间接
ELISA检测，被测样品孔光密度值 /阴性样品孔光密
度值(P /N)≥2. 1 判断为阳性〔7〕。
2 结果
2. 1 LMoV CP基因的克隆与序列分析 用引物对
LMoV-CP(+)∕ LMoV-CP(－)从样品 cDNA 中扩
增到 1 个预期目的片段，见图 1。经纯化后插入
pGEM-T载体，构建 pGEM-LMoV-3t，转化 TG1 菌，测
序并对序列进行 Blast 比对。分析结果表明，LMoV
浙贝母分离物 CP 基因由 821 个碱基组成，共编码
273 个氨基酸，与 Genbank 上已报道的几种 LMoV
不同分离物 CP基因的核苷酸序列同源性为 95% ～
99%，见图 2。其相应的氨基酸序列同源性均为
98% ～100%，见图 3。从序列分析结果来看，侵染
百合与侵染贝母的百合斑驳病毒变异性极小，其中
LMoV中国分离物之内变异性更小。
2. 2 LMoV外壳蛋白基因的原核表达 LMoV 的
CP基因经 Bam H I和 Nde I双酶切后插入到 pSBET
原核表达载体，转化的大肠杆菌 BL21(DE3)Plys E
菌经 IPTG 诱导表达。12% SDS-PAGE 检测表明
LMoV的 CP基因得到了诱导表达，大小与计算机推
测的 CP分子量(29. 2 kD)大小基本一致，见图 4。
2. 3 抗血清的 Western blot 检测 Western blot 分
析表明，制备的抗 LMoV CP血清能与诱导产物起特
异性反应，与空载体转化诱导的细菌裂解物(CK-)
无显色反应，见图 5。
2. 4 ELISA检测 抗 LMoV CP血清与带 LMoV病
毒的浙贝母病叶(RT-PCR 确定)进行的间接 ELISA
反应呈阳性，P /N = 4. 68。与健康叶(RT-PCR确定)
阴性对照比较，呈阴性。
3 讨论
马铃薯 Y 病毒属(Potyvirus)成员最多、分布最
广，对经济作物的危害也最大，给农业、牧业、园艺和
药材生产造成巨大损失。百合斑驳病毒是马铃薯 Y
·5811·Journal of Chinese Medicinal Materials 第 34 卷第 8 期 2011 年 8 月
图 5 LMoV外壳蛋白抗血清的Western blot分析
M. protein marker 1. IPTG 诱导 BL21(DE3)Plys E 菌(CK-)
2. LMoV CP基因转化并经过 IPTG诱导 2 h的 BL21(DE3)Plys E菌
病毒属的成员之一，在意大利、日本、以色列、荷兰、
中国台湾等地均有报道，该病毒主要侵染百合属植
物〔8〕，也侵染部分郁金香属植物〔8〕和部分石蒜科水
仙属植物〔9〕。
贝母可以被真菌侵染产生锈病、灰霉病和菌核
病〔1〕，但发病率较低，很少大面积爆发，而且可以通
过施加多菌灵等抗真菌药物进行预防与治疗。病毒
引起的花叶病普遍发生，如果用有病贝母鳞茎作种
或者种在有病毒的土地上，花叶病症加剧〔2〕，病毒
病是引起浙贝母减产的主要原因。
解决浙贝母因为病毒积累而品质退化的方法主
要是繁育脱毒或者低毒良种，有效、方便、低成本的
检测病毒方法是关键，制备有效的抗体是进行
ELISA检测的关键。植物病毒抗体的制备，最直接
的方法是用分离纯化的病毒粒子直接免疫实验动
物。浸染贝母的病毒有时呈现 2 种或者 2 种以上复
合侵染，它们都为马铃薯 Y 病毒属成员，其形态、大
小相似，分离、纯化单一病毒的难度很大，纯化的病
毒粒子往往是几种病毒的混合物，抗体能与几种病
毒同时结合。本文采用原核表达 LMoV的 CP基因、
2 次制备电泳纯化 CP并免疫小鼠，成功地制备出能
与天然病毒粒子结合的抗体，因为是通过原核表达
的 CP作为抗原，产生的抗体不与其他病毒产生交
叉反应，为检测 LmoV 和研究侵染不同植物 LmoV
之间的血清学关系奠定了基础。本研究的成果对复
壮贝母种质有指导作用，对其他中药材病毒病的研
究有借鉴意义。
参 考 文 献
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欇
気
気気
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1843-1848.
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·6811· Journal of Chinese Medicinal Materials 第 34 卷第 8 期 2011 年 8 月