全 文 ：·
1 1 08
·
第 二 军 医 大 学 学 报
Aa ed J Se e M ilM
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2 0 03 ( )e t; 24 (1 0)
· 论 著 ·
商陆皂普甲对 自身免疫综合征模型小鼠的疗效
肖振 宇` , 郑钦岳 “ , 张俊平 ’ ` , 陆 峰 2 , 张 大志 “
(1
. 第二军医大学药学院药理学教研室 , 上海 2 0 0 4 3 3 ; 2 . 药学院生化药学教研室 ; 3 药学院有机化学教研室 )
[摘要 ] 目 的 : 研 究商陆皂普 甲 ( E s A )对自身免疫综合征模型小 鼠的疗效 。 方法 : 采用 E LI s A 、 3 H 一 T d R 掺入和病理学检测 3
种方法 , 分别观察 E s A 对模 型小 鼠抗 d s 一 D N A 抗体水平 、 淋巴细 胞转化水平及 内脏炎症的影 响。 结 果 : E s A 在 5一 20 m g k/ g
剂量 范围内能降低模型小 鼠升高的抗 ds 一 D N A 抗体和淋 巴细胞转化水平 , 且 能显著地改善模型小鼠内脏组 织 的炎症 。 结击 :
E s A 对 自身免疫综合征模型小鼠有显著的治疗作用 , E s A 有希望成为治疗 自身免疫疾病的有效药物 。
[关键词习 商陆皂普甲 ; 自身免疫综合征 ; 治疗
仁中图分类号 ] R 5 9 3 . 2 [文献标识码 ] A [文章编号〕 0 2 5 5一 s 7 9X ( 2 0 0 3 ) 1 0 一 1 10 8一 0 4
E f f e c t o f e s c u l e n t o s i d e A o n a u t o im m u n e d i s e a s e m i c e m o d e l
X IA ( ) Z h e n
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m 邢 y , S e e o n d M il it a r y M e d i e a l U n iv e r s it y , S h a n g h a i 2 0 0 4 3 3 , C h in a ; 2 . D e p a r t m e n t o f B io e h e m ie a l p h a r m a -
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.
D e p a r t m
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〔A B S T R A C T 〕 o b j e e t i v e : T o in v e s t ig a t e t h e e f f e e t o f e s e u le n t o s id e A ( E s A ) o n a u t o im m u n e d i s e a s e m ie e m o d e l · M e t h o d s :
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r u g f o r a u t o im m u n e d i s e a s e
.
[ K E Y w O R D S〕 e s e u le n t o s id e A ; a u t o im m u n i t y S y n d r o m e ; t r e a t m e n t
仁A e a d J S e C M il M e d U n iv , 2 0 0 3 , 2 4 ( 1 0 ) : 1 1 0 8 一 1 1 1 1〕
商陆皂昔甲 ( e s C u l e n t o s i d e A , E S A )是从中国商
陆 (尸勺 t o za e e a 。 s c u ze n t a V a n H o u t e )的块根 中提取
的一种三菇皂昔类化合物 [ ’二。 本实验室以前的工作
表明 , E s A 对多种急慢性动物炎症模型 均有明显的
抑制作用 , 且作用持久「2 〕 ; E S A 对体液免疫和过度激
活的巨噬细胞有显著的抑制作用 ,能使巨噬细胞吞
噬能力下降 ,分泌 N O 减少 ,抑制巨噬细胞释放 11_ -
1
、
P G E Z
、
P A F 仁习 、 T N F 〔` 〕 , 抑制 C a Z+ 内流 和 l x一 l
m R N A
、
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一
6 m R N A 及 T N F m R N A 的表达 。 这些
结果提示 E s A 有抗炎和抑制免疫作用 , 可能对一些
免疫炎症性疾病有治疗作用 , 特别是与巨 噬细胞激
活有关 的疾病 ,如 自身免疫性疾病 (类风湿性关节
炎 、 系统性红斑狼疮 、 银屑病 、 重症肌无力 、 1 型糖尿
病等 ) 。 因此 ,本研究考察了 E s A 对 自身免疫综合征
模型小鼠的疗效 。
1 材料和方法
购 自 iS g m a 公司 。 3H 一 T d R 购 自中国科学院上海原
子核研究所 , 比活度为 1 . 18 又 1 01 2 B q /m m ol 。 甲醛
化空肠弯曲菌 C J一 5 1 3 ,菌悬液购 自上海卫生防疫站 ,
用无菌生理盐水洗 3 次 , 每次离心 4 0 0 0 / m in 又 20
m in
,再用无菌生理盐水在分光光度计旧 本岛津 )
5 40 n m 波 长 下 , 将 细 菌 悬 液 调 至 D 值 为 1 . 25
( 3
.
6 火 1 0 9 C F U / m l ) , 一 ZO C保存备用 。
1
.
2 模型 小鼠的建立曰 取 C J一 5 13 ;细菌悬液与等
量弗氏完全佐剂混匀 , 完全乳化后 , 取 50 川 给小 鼠
左侧足历注射 。 免疫第 15 天后 , 取上述 细菌悬液
0
.
2 m l
,给小鼠尾静脉注射 ,加强免疫 1 次 。 设正常
对照组 、 阳性对照 (模型组 ) , E s A 治疗组 (大 、 中 、 小
3 个剂量亚组 ) 。 从第 2 次免疫注射开始 ,每天腹腔
注射给予 E s A 治疗 (剂量分别为 5 、 10 、 20 m g / k g ) 。
治疗 4 周后 , 进行各项指标的检测 。
1
.
3 脾细胞悬液的制备及淋 巴 细胞转化 实验 小
鼠颈椎脱臼处死 ,无菌取脾 ,剪碎 , 过 10 目筛制成
1
.
1 实验动物 、 药品和试剂 B A I一 B / c 小 鼠 , 清洁
级 ,医动字第 02 一 2 5一 7 号 , 4一 6周龄 ,雌雄兼用 , 由第
二军医大学实验动物中心提供 。 E s A 纯度 > 9 % ,
用培养液溶解 。 R P M I 1 6 4 0 培养基 、 C o n A 、 L P S 均
[基金项目」 国家自然科学基金 ( 3 01 0 0 2 4 3 ) .
[作者简介口 肖振宇 ( 1 97 3一 ) ,男 (汉族 ) ,博士 ,讲 师 .
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第 1 0期 . 肖振宇 , 等 . 商 陆皂昔 甲对 自身免疫综合征模型小鼠的疗效 · 1 1 0 9 ·
单细胞悬液 , 双蒸水破坏红 细胞 , 用 R P M I 1 6 4 0 培
养液将细胞洗 2 次 , 制 成 l x l 。丫m l 细胞悬 液 , 取
1 0 闪 细胞悬液加入 9 6 孔培养板 ,加入一定浓度的
有丝分裂原 ( C o n A 或 L P S ) , 每组设 4 个复孔 ,总体
积 2 0 0 风 /孔 ,置 37 ’ C 、 5% C O Z 中培养 72 h , 于培养
结束前 6 h 加人 3H 一 T d R 1 8 5 0 0 B q /孔 , 培养 终止
后 , 用多头细胞抽滤仪收集细胞 ,滤膜烘干后用液体
闪烁计数仪记录数据 。
1
.
4 血清 自身抗体测 定 用 1 0。 川包被液 (含 ds -
D N A 2
.
5 拼g / rn l 的 0 . 01 m o l / I J T r i s 和 0 . 1 5 m o l / L
和 N a CI 配制 )包被紫外灯照射过的酶标板 。 4 ` C过
夜 , 倾去上 清液 , 经 P B S 一 T w e n 20 洗 涤液 洗涤 3
次 , 吸干孔 内液体 。 待测血清经 1 : 1 0 稀释 ,取 1 0
川 加入酶标板中 , 置 37 C条件下反应 Z h , 再加人
1 0 讨 羊抗小鼠 Ig G 辣根过氧化物酶标记的兔抗小
鼠 I g G 抗体 ( 1 : 2 0 0 ) 3 7 ` C 作用 Z h , 最后加人 10 0
沁 邻 苯二 胺 溶 液 , 37 「C显 色 30 m in , 用 Z m ol /亡
H
Z
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、
50 川 终止反应 , 上述每一反应结束后 ,均用
P B S
一
T w e e n 洗涤液洗 涤 3 次 , 对 照孔 不加待 测血
清 , 加 1 0 0 “ 1 0 . 0 1 m o l / L T r is 一 0 . 1 5 0 0 1/ L N a C I ,
并 以此在酶标仪上调零 , 实验结果在酶标仪上 49 。
n m 处读取光密度值 ( D 49 。 ) , 计算酶标指数 ( IE ) 一
[被测血清 D 4 9。 / (对照血清 刀 4。。 + 3 , ) ] x 1 0 0 。
1
.
5 组织病理学检查 将小鼠的肾组织块用中性甲
醛固定液固定 ,修成 2 m m X 4 m m x 4 m m 大小 , 固
定组织块经脱水 (预冷无水乙醇 4 次 ,每次 l h) 和透
明 (预冷二 甲苯 3 次 , 至透明为止 )用石蜡包埋 , 常规
切片厚 3 拼m , H 一 E 染色 , 高倍显微镜下观察并拍照 。
1
.
6 足肿及体质量的检查 将小 鼠处死之前 ,用毛
细管放大测量改 良法装置测小鼠足肠肿胀情况 。 将
小 鼠双足膝关节 以下的部分浸人测空管 中 , 读取数
据的 2 倍即为小 鼠足肿 的实际情况 。 测定足肿情况
前称量小鼠的体质量 ,并记录数据 。
1
.
7 统计学处理 数据以 王士 ; 表示 ,组 间比较用 t
检验 。
2 结 果
2
.
1 E s A 对 自身免疫模 型小 鼠淋 巴 细胞转化的影
响 无论在有丝分裂原 (C o n A 或 L P )S 或没有有丝
分裂原刺激的情况下 ,模 型小 鼠淋 巴细胞增殖与正
常小 鼠相比都有大幅度 的上升 ( P < 0 . 0 1 ) 。 E s A 能
剂量依赖性地抑制模型小鼠的淋巴细胞增殖 。 在没
有有丝分裂原刺激时 , E s A 在大 、 中 、 小剂量下对模
型小 鼠 的淋 巴 细 胞 增殖 的抑 制 率 分别 为 26 % 、
3 3%
、
4 2%
。 在 C o n A 刺激的情况下 , 中剂量的 E s A
将模型小鼠的淋巴细胞 的异常增殖水平降至正常水
平附近 。 而在 L P S 刺激的情况下 ,经大剂量的 E s A
治疗后 ,小 鼠的淋 巴细胞的增殖水平降至正常水平 。
结果提示 E S A 能显著降低模型小鼠异常增高的淋
巴细胞增殖水平 (尸 < 0 . 0 1 ) 。 见表 1 。
表 1 E S A 对自身免疫小鼠脾淋 巴细胞 增殖和血 清自身抗体的影响
T a b 1 E f f e e t s o f E s A o n s P l e n o e y t e P r o l i f e r a t i o n a n d le v e l o f a n t i
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4 0 5士 6 5△△
2 8士 4
8 6士 1 1△△
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7 0士 0 . 0 4
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.
0 3士 0 . 1 5△△
8 5士 5
1 2 5士 1 8△△
2 7士 6 子 关
22士 3 关 歼
1 7士 4 资 势
2 8 1士 4 0 釜 哭
17 9士 6 “ 讲
7 6士 1 2 开 苦
6 7士 8 书 关
5 3士 9 ” 羌
2 8士 3 卜 各
0
.
9 1士 0 . 0 6 关 釜
0
.
8 0士 0 . 0 6 苍 书
0
.
71士 0 . 1 1 书 若
1 10士 7 关 普
97士 7 各 势
8 6士 1 3 书 补
爷 赘
p < 0
.
0 1 v s c o n t r o l g r o u p ; △△ p < 0
.
0 1 v s n o r m a l g r o u p
2
.
2 sE A 对 自身免疫模型 小鼠血清 自身抗体的影
响 抗 d s 一 D N A 抗体在模 型小 鼠血清 中的含量 比
正 常小 鼠血清中的含量有显著的增 高 (尸 < 。 . 0 1 ) 。
E s A 能剂量依赖性地 抑制模 型小 鼠增高 的抗 d s -
D N A 抗体水平 。 在高剂量 E S A 的治疗下 ,模型小鼠
的增高的抗 d s 一 D N A 抗体水平与正常水平接近 。 结
果提示 E S A 能显著降低模型小鼠异常增高的抗 d 。 -
D N A 抗体水平护 < 。 . 0 1 ) 。 见表 1 。
2
.
3 E s A 对 自身免疫模型 小鼠肾脏炎症的影响
正常小鼠肾切片可见正常肾小球 ,无明显异常 。模型
小 鼠肾小球体积明显增大 , 肾小球内炎症细胞 明显
增多 , 间质充血 、 出血 明显 , 大量淋 巴 细胞浸润 (图
I A
、
I B)
。 经 E s A 治疗后 ,淋 巴细胞浸润显著减少 。
随着剂量的增大 , 肾小球体积有所减小 ,炎症明显缓
解 ( 图 I C一 I E ) 。
.1 1 1 0
· 第二军医大学学报 2 03 0年 1 0月 ,第 2 4 卷
图 1 E s A 对 自身免疫小鼠肾脏炎症的影响
F ig 1 E f f e e t s o f E s A o n i n f la m m a t io n o f k id n e y (H
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:
C o n t r o l g
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: 5 m g / k g E s A ; D
: 1 0 m g / k g E
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A ; D
:
2 0 m g / k g E
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A
.2 4 E
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A 对 自身免疫模型 小鼠足肿及体质量的 影
响 模型小鼠与正常小鼠相 比 ,双侧后肢均有严重
的肿胀 。而且 ,左侧足拓 (注射侧 ) 比右侧足踢的肿胀
程度高 。 E s A 3个剂量组的小鼠后肢的肿胀程度在
整个治疗过程中均 比模型小鼠低 (尸 < 0 . 0 1 ) ,见 图
2
。 另外 ,模型小 鼠的体质量与正常小鼠相比无显著
性差异 。 E s A 作用下 , 体质量也未发生明显变化 。
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a l C o n t r o l 5 m gk/ g l o m g/ kg
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图 2 E s A 对 自身免疫小 鼠足踌肿胀的影响
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0 1 v s e o n t r o l g r o
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△ 八 P < 0
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0 1 v s n o r m a l g
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3 讨 论
自身免疫性疾病是免疫系统对机体自身成分表
现出免疫性增高而导致对 自身组织损害的一种疾
病 ,发病机制复杂 , 严重危害人体健康 , 是当代医学
的一个难题 。 对于 自身免疫性疾病的实验室研究一
般借助于两种模型 : 一种是能 自发产生 自身性免疫
病的小 鼠 (如 N ZB 、 M R I ) ; 另一种是用特异性 自身
抗原辅以佐剂免疫动物 , 人工诱 发的自身免疫性疾
病动物模型 。 有报道 ,一些病毒 、 细菌 、 真菌或寄生虫
感染和自身免疫病的发病有关 ,并认为它们具有与
人体成分相同的交叉抗原 。 本实验选用甲醛化空肠
弯曲菌 CJ一 s , 3 1菌株辅以佐剂免疫小 鼠建立的 自身
免疫性模型 。 此模型小鼠具有 自身免疫性疾病的一
些特征 , 如高滴度的 自身抗体 , T 、 B 细胞的过度激
活 , 多器官炎症等 ,并且具有免疫周期短便于实验室
研究的特点叫 。
自身抗体是 自身 免疫性疾病的重要标 志 , 从
1 9 7 1 年以来 ,各种 自身免疫性疾病的主要 自身抗原
已逐渐被发现 。 抗 d s 一 D N A 抗体是一类对 自身机体
的细胞内抗原发生免疫反应 的自身抗体 , 在许多系
统性风湿性疾病中均被检测到 。 特别是与系统性红
斑狼疮 (S L E )及类风湿性关节炎 ( R A ) 的发病机制 、
临床表现密切相关川 。 另外 ,淋巴细胞的过度激活也
是 自身免疫性疾病的一个特征 。 T 、 B 细胞的过度激
活将导致淋 巴组织增生及免疫系统功能紊乱 〔 7习。 在
系统性红斑狼疮及类风湿性关节炎 中 , T 、 B 细胞的
过度激活卷人了疾病 的发生发展过程 ,从而导致狼
疮的形成和骨关节的损伤 。
本研究结果表明商陆皂昔甲能降低模型小鼠的
高水平 的抗 ds 一 D N A 抗体及抑制 T 、 B 细胞 的过度
增殖 ,这提示 E s A 可能通过抑制 自身免疫反应亢进
的淋巴细胞功能来参与免疫调节作用 ,从而调整机
体内的免疫失衡 。 内脏病理切片表明 , E s A 能够改
善肾脏的炎症 。 模型小鼠的足肿情况也得到了良好
的改善 。 提示 E s A 具有强大的抗炎作用 。 这与以前
的研究结果相符川 。 另外 ,小鼠体质量经治疗后并未
出现的减轻 ,从一个侧面说明了 E s A 的毒性较小 。
以上结果均提示 E S A 通过免疫调节和抗炎作用 ,对
自身免疫性疾病模型小 鼠确有疗效 。
[参 考 文 献 ]
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肿 瘤坏死 因子的抑制作用 〔J」. 第二军 医 大 学学报 , 1卯 7 , 18
飞!司ǐ日ǐ习门lIC弓曰dI/上仁厂一|仁f
第1 0期. 肖振宇 , 等 . 商陆皂 昔甲对 自身免疫综合征模型小鼠的疗效 . 1 1 1 1 ·
( 5 )
: 4 1 5一 4 1 7
.
Z h e n g Q Y
,
F a n g J
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In h 一b i t o r y e f f e e t o f e s e u l e n t o s一d e
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9 5 9一 97 0
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压收稿 日期」 2 0 0 3一。艺一 2 2 〔修 回日期口 艺0 0 3一 。6一。赶
[本文编辑刁 曹 静
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· 研 究简报 ·
干扰素 Y 治疗慢性乙型肝炎肝纤维化的临床观察
C l i n i e a l o b s e r v a t i o n o n i n t e r f e r o n
一
y i n t r e a tm e n t o f e h r o n i c h e P a t i t i s B f i b r o s i s
张文瑾 , 辛绍杰 , 靳雪源 , 陈 国风 (解放军第 302 医院干部病房 , 北京 1。。。 3的
[关键词 ] 干扰素 下 ;慢性 乙型肝炎 ;肝 纤维化
仁中图分类号〕 R 5 2 2 . 6 2 [文献标识码 〕 B 仁文章编号〕 0 2 5 8一 8 7 9X ( 2 0 0 3 ) 1 0 一 2 1 1 1一 0 1
近年来 , 复方鳖甲软肝片等抗肝纤维化药物的治疗作用
得到充分肯定 , 已广泛用于临床治疗川 。 众所周知 ,在我国肝
硬化主要 与乙 型和丙 型病毒性肝炎有关 , 并且 , 在临床上有
许多慢性肝炎及 肝硬化患者同时存在肝纤维化 和活跃的病
毒复制川 。 我们应用干扰素 袱 i nt er f er o n 一劝对 32 例慢性 乙型
肝炎及肝硬化 患者进行 了治疗及 观察 , 兼顾抗 纤维化 、 抗病
毒等多方面作用 ,报道如下 。
资料和方法
京科卫试剂厂提供 , 采用 E LI S A 法及定量 P C R 方法 。 ( 4 ) E
超检查 :治疗前后各检查 1 次 。
1
.
4 疗效判 定 (l )抗 纤维化作用闭 : 显效 : 肝纤 维化 4 项
指标中 2 项下 降 > 40 % ,症状体征明显改善或消 失 , B 超显
示肝 回声改善 1 个级别 , 门脉及脾静脉宽度变窄 , 脾脏缩小 ;
有效 :肝纤维化 4 项指标中 2 项下降> 30 % ;症状体征改善 ;
无效 :未达上述标准 。 ( 2) 抗病毒作用 :疗程结束后 , 观察两组
H B e A g 和 H B V D N A 阴转率 。
1
.
5 统计学处理 组间比较采用 丫检验 。
1
.
1 病例 选择 选 自 1 9 9 9 年 1 月至 2。。 2 年 12 月期间本院
住 院及 门诊患者 , 根据 2 0 0 0 年第 10 次全 国病毒性肝 炎及肝
病学术会议修订的病毒性肝炎 防治方案川 , 均符合慢性 乙 型
肝炎及肝硬化 ( 乙型 )代偿期 , 且血清肝纤 维化指标透 明质 酸
( H A )
、层粘连 蛋白 (I N ) 、 l 型前胶原 ( P C 皿 ) 、 vI 型胶原 ( 份
C ) 4 项 中至少 2 项升高超过 正常 2 倍 , B 超示 肝 回声 异常 ,
门脉及脾静脉增宽 , 脾脏增大 。 共 5 2 例 , 治疗组 32 例 , 男性
2 8 例 , 女性 4 例 , 年龄 ( 4 0 . 2 士 9 . 4 )岁 ;对照组 20 例 , 男性 18
例 , 女性 2 例 , 年龄 ( 41 . 5 士 7 . 8 )岁 。 两组患者肝功能要求丙
氨酸转氨酶 ( A L T ) < 10 U , 胆红 素 ( B IJ _ )正常 ;病毒复制指
标要求为 H B s A g 、 H B e A g 、 H B V D N A 阳性 。
1
.
2 治 疗方法 治疗组 : IF N 一了 1 0 万 U , 肌注 ,每 日 l 次 ,
共 3个月 , 然后隔 日 1 次 , 共 3 个月 , 总疗程 6 个月 。 IF N 一了
由上 海生 物制品研究所 (批号 : 9 9 0 106 )提供 ,批准文 号 : 国药
准字 ( 1 9 9 9 )沪 S 一 02 号 。 治疗期 间辅 以保肝降酶药物 ,治疗前
半年及治疗期间未使用其他抗病毒及免疫调节药物 。 对照
组 : 不使用 IF N 一下 ,其他治疗同上 。
1
.
3 观察指标 ( l) 血 、 尿常规 和肝 、 肾功能 : 每 2一 4 周检
查 1次 。 ( 2) 血清肝纤维化指标 ( H A 、 P C 皿 、 vI C 、 L N ) :治疗前
后各查 1 次 ,均采用放射免疫法 ,试剂由上海 海军医学研究
所 提供 。 ( 3) 乙 肝 病毒 指标 ( H sB A g 、 H sB A b 、 H B e A g 、
H B e A b
、
H B c A b
、
H B V D N A )
:治疗前后各查 1 次 ,试剂由北
2 结 果
结果 显示 , IF N 一 7 抗纤维化作用较强 , 其总有效率明显
高于对照组 (尸 < 。 . 01 ) ;两组抗 乙肝病毒 比较 : H B e A g 阴转
率与对照组 比较有明显差异 ( p < 。 05 ) ; H B V D N A 阴转率
治 疗组高于 对照组 ,但统计学上无差异 ( 尸 > 。 . 05 ) , 说 明
I F N
一下有一定的抗病毒作用 (表 1 ) 。 另外 ,本研究发现 , 治疗
组 32 例患者除注射初期发热 、 少数患 者一过性外周血 白细
胞及血 小板下降 、 A L T 升高外 , 均 未发现其他 明显不 良作
用 ,在联合保肝降酶药物情况下可顺利完成疗程 。
表 1 两组抗纤维化及抗病毒作用比较
抗纤维化作用 抗病毒作用 [ n( 写 )〕
组别 显效 有效 无效 总有效率 (写 )
H B V D N A
治疗组
对照组
1 1 6 5
1 7 1 5
9 ( 2 8
.
1 )
,
O ( 0 )
阴转率
8 ( 2 5
.
0 )
1 ( 5
.
0 )
P < 0
.
0 5
, `
P < 0
.
0 1 与对照组比较
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仁作者简介〕 张文瑾 (1 9 62 一 ) ,女 (汉族 ) , 主任医师 .
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