全 文 ：第 36卷 第 3期 东　北　林　业　大　学　学　报 Vol.36 No.3
2008年 3月 JOURNALOFNORTHEASTFORESTRYUNIVERSITY Mar.2008
天女木兰幼胚离体培养及组织快繁 1)
陆秀君　徐　石　李天来　张丽娟　高　爽
(沈阳农业大学 ,沈阳 , 110161)
　　摘　要　利用正交试验进行了天女木兰的幼胚离体增殖培养的研究 ,对基本培养基类型、活性炭 、糖、BA、IBA的质
量浓度都进行了仔细的筛选。结果表明:幼胚培养所需要的最适培养基为附加 BA(0.01mg· L-1)、IBA(0.01mg· L-1)、
糖(50.0g· L-1)、活性炭(1.5g· L-1)的 B
5
培养基 ,幼胚萌发率可达 100%。天女木兰实生苗最适的增殖培养基为 B
5
+
BA(2.0mg· L-1)+NAA(0.04mg·L-1)+IBA(0.5mg·L-1)+活性炭(1.0g· L-1),此时繁殖系数大于 3.6,可以满足
生产需要。最适生根培养基为 1/2MS+0.5mg·L-1IBA+1.0mg· L-1DA-6,生根率可达 60%。
关键词　天女木兰;幼胚离体培养;快繁
分类号　Q949.747.1;S723.1EmbryoCultureandRapidPropagationofMagnoliasieboldi/LuXiujun, XuShi, LiTianlai, ZhangLijuan, GaoShuang(ColegeofForestry, ShenyangAgriculturalUniversity, Shenyang110161, P.R.China)//JournalofNortheastForestryUniversity.-2008, 36(3).-5 ～ 7AnexperimentwasconductedtostudytheembryocultureandrapidpropagationofMagnoliasieboldiibyorthogonaldesigninordertoselecttheoptimalbasicmedium, contentsofsugar, BAandIBA.Resultsshowthattheoptimalmedium
forembryocultureisB5 mediumsupplementedwithIBA(0.01mg· L-1), BA(0.01mg· L-1), sugar(50.0g· L-1)andactivecarbon(1.5g· L-1), exhibitinga100% germinationrate.TheoptimalmediumforsubcultureisB5 withBA(2.0mg· L-1), NAA(0.04mg· L-1), IBA(0.5mg· L-1)andactivecarbon(1.0g· L-1), showingapropagation
coeficientof3.6 atleast.Themostsuitablerootingmediumis1/2MSsupplementedwith0.5mg·L-1 IBAand1.0mg·
L-1 DA-6, yieldingarootingrateof60%.Keywords　Magnoliasieboldii;Embryoculture;Rapidpropagation
　　天女木兰(Magnoliasieboldi)为木兰科木兰属落叶小乔
木 , 是木兰科树种中最抗寒的品种 ,其数量稀少 ,仅分布在辽
宁长白山脉和黄山一带 , 为国家三类保护植物 [ 1-2] 。树高可
达 10m以上。叶后开花 , 色泽洁白 ,美丽 , 富有香气 , 花期长 ,
可达 1个月以上。果于 9月成熟 , 种子鲜红色 ,有珠柄细丝悬
挂于果外 , 极为美观 ,堪称园林观赏植物之珍品 [ 3];同时又有
很高的经济价值 , 木材可以做家具 ,花可入药制浸膏 , 叶可以
提取香精油 , 含油量 2%,是重要的轻工业原料之一。但天女
木兰育苗栽培技术十分复杂 , 繁殖难度很大 , 目前多用种子繁
殖或者扦插繁殖 , 因为其种皮具有蜡质 , 需要经过冬季催芽之
后翌春才有可能出苗 , 繁殖速度非常慢 , 当年播种苗平均苗高
15cm左右。据报道扦插生根有难度 , 嫩枝也需要 3个月以
上 [ 4-7] 。据调查表明 ,天女木兰种质资源已日趋濒危 ,亟待引
种繁殖 [ 8-9] 。本研究主要对天女木兰幼胚组织培养技术进行
研究 , 目的是找出快速培育天女木兰苗木的方法 , 以扩大开发
利用 , 适应市场的需求 [ 10-12] 。
1　材料与方法
外植体的选择及灭菌:将天女木兰种子进行如下 3种处
理 , 即:Ⅰ 是带外种皮的天女木兰种子;Ⅱ是带中种皮的天女
木兰种子;Ⅲ是带内种皮的天女木兰种子。每种天女木兰的
种子均用自来水冲洗 10min后 , 分别放在已经灭菌的锥形瓶
中 , 均用 70%的酒精浸泡 30s,再用 0.1%升汞消毒 ,每组进行
6个处理 ,即:不消毒 、消毒 2、 4、 6、 8、10min, 消毒后立即用无
1)沈阳农业大学博士后基金项目(777-230409)。
第一作者简介:陆秀君 ,女 , 1966年 8月生 ,沈阳农业大学林学
院 ,教授。
通讯作者:李天来。
收稿日期:2007年 9月 11日。
责任编辑:程　红。
菌水冲洗 4 ～ 5次 , 在超净台上将天女木兰幼胚从种子中剥离
出来 ,及时接种。每种处理接种 40个幼胚 ,试验重复 2次。
初始培养基的选择:将天女木兰幼胚接种于 5种不同的
培养基上 , 即 MS、SH、B5、WPM和改良 White。培养条件均为
组培室中光照培养 , 培养温度(25 ±2)℃, pH为 5.8 ～ 6.2, 光
照时间和光照强度分别是 14h和 1 000 ～ 1 200lx。 30d后记
录每个培养基上的发芽率 , 试验重复 2次。
活性炭质量浓度的选择:将天女木兰幼胚分别接种到附
加不同质量浓度的活性炭的 B5培养基中 ,即:0、0.5、1.0、1.5、
2.0、2.5、3.0g· L-1 , 1个月后调查萌发及成苗情况 , 试验重
复 2次。
其他影响因素的选择:采用 L
9
(34)正交设计 , 研究 BA(A
因素)、IBA(B因素)、糖(C因素)3个因素的各个水平对天女
木兰幼胚萌发及成苗的影响。各因素水平安排见表 1。
表 1　天女木兰幼胚萌发及成苗影响因素的 L9(34)正交试验设计
水平 因　　素BA/mg· L-1 IBA/mg· L-1 糖 /g· L-1
1 0.001 0.001 30
2 0.010 0.010 40
3 0.100 0.100 50
　　增殖培养基的选择:采用 L16(45)正交设计 , 研究培养基
类型(A因素)、BA(B因素)、NAA(C因素)、IBA(D因素)、
活性炭(C因素)5个因素的各个水平对幼苗增殖的影响。 各
因素水平安排见表 2。
生根培养基的选择:将继代增殖的无菌苗接种在 6种生
根培养基上 , 即 R1:MS+0.5mg· L-1IBA+2.0mg· L-1DA-
6;R2:MS+1.0mg· L-1IBA+1.0mg· L-1DA-6;R3:MS+
2.0mg· L-1IBA+0.5mg· L-1DA-6;R4:1/2MS+0.5mg·
L-1IBA+1.0mg· L-1DA-6;R5:1/2MS+1.0mg· L-1IBA+
0.5mg· L-1DA-6;R6:1/2MS+2.0mg· L-1IBA+2.0mg·
L-1DA-6。
表 2　天女木兰幼苗增殖影响因素的 L16(45)正交试验设计
水平
因　　素
培养基 BA/mg· L-1
NAA/
mg· L-1
IBA/
mg· L-1
活性炭 /
g· L-1
1 MS 1.0 0.01 0 1.0
2 B5 2.0 0.02 0.5 1.5
3 WPM 3.0 0.03 1.0 2.0
4 改良 White 4.0 0.04 2.0 2.5
2　结果与分析
2.1　不同消毒时间及方法之间的差异
随着消毒时间的增加 , 各种类型的外植体污染率均不断
下降 , 而萌发率和成苗率均呈先升后降的趋势 , 其原因是消毒
时间过长 , 消毒剂渗入幼胚 ,造成对幼胚的毒害而使其不易萌
发和成苗。
表 3　不同外植体在不同消毒时间下的最优排列
外植体类型 消毒时间 /min 污染率 /% 萌发率 /% 成苗率 /%
Ⅲ 4 0 100 70.0
Ⅲ 6 0 90 55.6
Ⅲ 8 0 75 53.5
Ⅲ 2 0 90 50.0
Ⅰ 8 10 80 50.0
　　由表 3可见 , 天女木兰幼胚离体培养中最好的消毒方式
是将带内种皮的天女木兰种子用 0.1%升汞消毒 4 min, 其他
方式均不太理想 , 成苗率低。 Ⅱ型的试材在最优排列中未曾
出现。 Ⅰ型 、Ⅱ型的试材均有一定的污染 , 而且萌发率和成苗
率都不高 , 其原因是天女木兰种皮坚硬 , 消毒不易彻底 ,加上
必须在培养皿内剥去种皮才可以剥离出幼胚 , 增加了剥胚难
度并使操作时间延长 ,从而使污染率增高。
2.2　不同培养基对天女木兰幼胚的发芽和生长的影响
通过观察和统计 ,不同基本培养基下天女木兰幼胚均可
以发芽 , 但发芽率有很大差异。
幼胚萌发的效果从好到差依次为 WPM、B5 、改良 White、
Monnier、MS。其中接种在 WPM培养基上的幼胚发芽率最高
可达到 95%, 其次是 B5 (90%), 改良 White(85%)。 在
WPM、B5培养基上的幼苗长势旺盛 , 在 B5培养基上的幼苗尤
为粗壮 , 叶色浓绿 ,有明显高生长 , WPM培养基上的幼苗虽然
发芽率很高 , 但是幼苗长势一般 , 叶发黄。而在 MS和 Monni-
er培养基上的幼苗则十分瘦弱 ,不适合天女木兰的幼胚培育。
各个培养基下的天女木兰幼苗均有褐化现象。通过对培养基
的成分分析 , 笔者认为 ,由于不同培养基中的大量元素和微量
元素有着明显的区别 , 在 WPM、B5培养基中 , Ca2+和所有的
大量元素几乎是 MS培养基中的 2倍 , B5中K+的量更是远远
超出 WPM和 MS, 这可能是加快幼胚的发芽的原因。
2.3　不同活性炭质量浓度对天女木兰幼胚的影响
天女木兰种子含酚类物质较多 , 在幼胚的组织培养中经
常出现组织褐化的现象 ,通过加入活性炭可以防止植物自身
的酚类物质的排泌和变褐老化。
由表 4可以看出 , 在加入活性炭的培养基上 ,当加入量为
小于 2.0g· L-1时 ,幼胚的萌发率都比较高 ,各个处理结果差
异不显著 , 其中加入量为 1.5和 2.0 g· L-1时 , 萌发率最高 ,
可达 90%;但当加入量超过 2.0g· L-1以后 , 萌发率明显下
降 , 其原因可能是活性炭质量浓度过高 , 使培养基呈现黑色吸
收光照 ,容易使培养基内温度急剧升高 ,影响幼胚的正常生长
萌发。但从各个处理的幼胚的成苗率上看 , 活性炭的加与不
加 ,加入量的大小都对其产生较大的影响。 成苗率随活性炭
加入量的增加而逐渐提高 , 当加入量为 1.5g· L-1时 , 成苗率
达到最高峰 , 为 88.89%, 此时幼苗生长极其健壮 , 有明显的
高生长 , 个别苗还出现了根系 ,褐化现象得到了明显的改善。
表 4　不同活性炭质量浓度对天女木兰幼胚萌发及成苗的影响
活性炭 /
g· L-1
接种
数 /个
萌发
率 /%
成苗
率 /% 生长情况
0 40 85 35.29 苗长势弱
0.5 40 85 52.93 生长一般
1.0 40 85 70.59 生长良好 ,成苗率高
1.5 40 90 88.89 苗高 ,生长健壮 ,个别苗长根
2.0 40 90 72.22 生长良好 ,有高生长
2.5 40 60 50.00 生长一般 ,高生长不明显
3.0 40 40 37.50 苗矮小 ,真叶小 ,子叶肥大
2.4　其他影响因素的选择
由表 5可见 , 根据 T值大小可以看出 3个因素的各个水
平最佳组合为 A2B2C3 , 也就是说 A因素(BA质量浓度)以 A2
为最佳 , 即 0.01mg· L-1 , B因素(IBA质量浓度)以 B2为最
佳 ,即 0.01mg· L-1 , C因素(糖质量浓度)以 C3 为最佳 , 即
50.0g· L-1。 R值越大因素对试验结果的影响越显著。因为
RA>RB>RC, 则试验中的各个因素中 A因素为试验主导因
子 , 即细胞分裂素 BA的加入量对天女木兰幼胚的萌发率有
极其显著的影响 ,各因素影响效果的主次关系为 BA质量浓
度 >IBA质量浓度 >糖质量浓度。 方差分析结果表明:3个
因素中 , 对天女木兰幼胚萌发率影响从大到小依次为 BA质
量浓度 >IBA质量浓度 >糖质量浓度 , 与直观分析的结论一
致 ,试验所安排的 3个因素对萌发率的影响无显著性差异。
可见 , 天女木兰幼胚在加入糖 50.0 g· L-1、BA0.01mg·
L-1 、IBA0.01mg· L-1的 B5培养基上的萌发率最高 , 而且此
时胚的成苗率也较高 , 幼苗长势旺盛 ,较为粗壮。
表 5　天女木兰幼胚培养正交设计统计结果
试验号 BA/mg· L-1 IBA/mg· L-1 糖 /g· L-1 萌发率 /%
1 0.001 0.001 30 57.5
2 0.001 0.010 40 75.0
3 0.001 0.100 50 82.3
4 0.010 0.001 50 85.7
5 0.010 0.010 30 100
6 0.010 0.100 40 82.7
7 0.100 0.001 40 65.0
8 0.100 0.010 50 76.8
9 0.100 0.100 30 72.7
T1 214.8 208.2 230.2T2 268.4 251.8 222.7
T3 214.5 237.7 244.8X1 71.6 69.4 76.7
X2 89.5 83.9 74.2
X3 71.5 79.2 81.6
R 18.0 14.5 7.4
2.5　增殖培养基的选择
从正交表(表 6)直观分析看 , 根据 T值的大小得出天女
木兰幼苗增殖系数最高的培养条件为 B5 +BA2.0mg· L-1 +
NAA0.04mg· L-1 +IBA0.5 mg· L-1 +活性炭 1.0g· L-1。
根据 R值的大小可以看出 BA为主导因子。各因素影响的主
次关系依次为 BA>培养基 >IBA>活性炭 >NAA。方差分析
6 　　　　　　　　　　　东　北　林　业　大　学　学　报　　　　　　　　　　　　　　　第 36卷
结果表明:5个因素中 ,对天女木兰萌发率影响从大到小依次
为 BA质量浓度 >培养基 >IBA质量浓度 >活性炭质量浓度
>NAA质量浓度 , 与直观分析的结论一致;5个因素之间 BA
质量浓度和培养基种类与 NAA质量浓度之间有极显著差异 ,
与活性炭之间有显著性差异 , IBA质量浓度与 NAA质量浓度
之间也有显著差异 , 其他各项之间的差异均不显著。通过上
述试验 , 认为在天女木兰幼苗增殖培养中 , 最适的培养基组合
应该为 A2B2C4D2E1 , 即 B5 培养基附加 BA2.0 mg· L-1、
NAA0.04mg· L-1、IBA0.5 mg· L-1 、活性炭 1.0g· L-1 , 此
时增殖系数最高 , 可达 3.6以上 ,本试验中繁殖系数最高的培
养基为 2号培养基 , 即附加 BA2.0mg· L-1 、NAA0.02mg·
L-1、IBA0.5mg· L-1 、活性炭 1.5g· L-1的 MS培养基 , 增殖
系数为 3.6。
表 6　天女木兰继代增殖培养正交设计统计结果
试验
号 培养基
BA/
mg· L-1
NAA/
mg·L-1
IBA/
mg· L-1
活性炭 /
g· L-1
平均增
殖系数
1 MS 1.0 0.01 0　 1.0 2.5
2 MS 2.0 0.02 0.5 1.5 3.6
3 MS 3.0 0.03 1.0 2.0 1.7
4 MS 4.0 0.04 2.0 2.5 0.4
5 B5 1.0 0.02 1.0 2.5 3.1
6 B5 2.0 0.01 2.0 2.0 3.4
7 B5 3.0 0.04 0 1.5 3.1
8 B5 4.0 0.03 0.5 1.0 2.9
9 WPM 1.0 0.03 2.0 1.5 1.2
10 WPM 2.0 0.04 1.0 1.0 3.0
11 WPM 3.0 0.01 0.5 2.5 2.3
12 WPM 4.0 0.02 0 2.0 0.2
13 改良 White 1.0 0.04 0.5 2.0 2.4
14 改良 White 2.0 0.03 0 2.5 1.8
15 改良 White 3.0 0.02 2.0 1.0 0.9
16 改良 White 4.0 0.01 1.0 1.5 0.2
T1 8.20 9.20 8.40 7.60 9.30T2 12.50 11.80 7.80 11.20 8.10T3 6.70 8.00 7.70 8.00 7.70T4 5.30 3.70 8.90 5.90 7.60X1 2.05 2.30 2.10 1.90 2.33X2 3.13 2.95 1.95 2.80 2.03X3 1.68 2.00 1.93 2.00 1.93X4 1.33 0.93 2.23 1.48 1.90
R 1.80 2.02 0.30 1.32 0.43
　　生根培养:木兰科植物生根较难 [ 13] , 本次试验尝试选用
1种新型植物生根剂 DA-6, 它的诱导生根特点是生根快 、根
量大 、根活力强 、移栽后苗成活率高。 40d后 , R4培养基上的
苗开始生根 , R5、R6 上的苗少量出现愈伤组织。 60 d后 , R4
培养基上的苗生根率可达 60%,其他结果未见生根。天女木
兰增殖与生根情况见图 1。
3　结论与讨论
天女木兰幼胚离体培养的最适基本培养基是 B
5
, 其次是
WPM,这表明在天女木兰的幼胚组织培养中需要丰富的大量
元素和微量元素 , 尤其是 Ca2+和 K+。天女木兰幼胚离体培
养褐化现象较严重 , 活性炭的加入对幼胚褐化现象有明显的
改善作用 ,并且随着活性炭质量浓度的增大幼胚萌发率增高 ,
当活性炭质量浓度增大到一定水平后萌发率明显下降。天女
木兰幼胚培养的最佳活性炭质量浓度为 1.5g· L-1。天女木
兰幼胚离体培养的最适培养基是 B5 +BA0.01 mg· L-1 +
NAA0.01mg· L-1 +糖 50.0g· L-1 , 发芽率可达 100%。 BA
质量浓度对增殖有明显的影响 , 天女木兰幼胚离体培养的最
适增殖培养基是 B5 +BA2.0 mg· L-1 +NAA0.04mg· L-1 +
IBA0.5mg· L-1 +活性炭 1.0g· L-1 ,增殖系数超过 3.6。在
生根培养中 , 选用新型植物生根剂 DA-6, 得出最适生根培养
基是 1/2MS+0.5mg· L-1IBA+1.0mg· L-1DA-6, 生根率
可达 60%。试验中仅得到少量愈伤组织 , 继代成活率较低 ,
未分化成苗。
本试验建立了天女木兰幼胚离体培养快速繁殖体系。 从
无菌体系建立到增殖继代培养 、均得到了较为成熟的技术。
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图 1　天女木兰增殖与生根情况
1、 2为天女木兰继代增殖苗;3为天女木兰生根苗。
7第 3期　　　　　　　　　　　　　　　陆秀君等:天女木兰幼胚离体培养及组织快繁