全 文 ：J o
28 5
· 第二军 医大学学报 198 6年第 7卷第 4 期
两种商陆体外诱生免疫干扰素的作用
杨嗣冲 郑玲莉 徐志工 吴 玉梅 田野苹 田 京慧 叶天 星 (微生物学教研室 免疫学研究组 )
王著禄 易杨华 (药学系 植物化学教研室 )
提要 本文报道了美洲商陆 ( P w M )和中国商陆皂武 ( E“ )在体外对正常外伤脾和病人脾细胞诱生干扰 素 的
作用 。 P w M及 Es诱生的干扰素对 p H Z或 5 6O c处理敏感 , 能被人 Y千扰素 ( I F N 一丫 ) 单克隆抗 体中 和 , 确
证是人 丫干扰素 。 10 例外伤脾以 P W M 诱生 IF N 一丫平均效价为 3 . 4 8 士 0 . 59 oL g : 。 c IP : 。 U /ml 。 以 sE 诱生
效价为 2 . 92 士 0 . 犯 L叩 ; 。 C班 : 。 U / m l。 两者效价有显著差异 ( p < 。 . 0 5 ) 。 8例病人脾细胞 以 P w M或 sE 诱
生 I F ’N 一丫 效价平均达 3 . 6 9 士 0 . 3 5 1 一。 9 1 。 C p l : 。 U / m l 和 3 。 0 1 士 0 . 35 L o g J。 C P I · 。 U /。 l 。 E , 对病入脾 细 胞
诱生 I F N 一丫的作用显若地低于美洲商陆〔p < 。 . 0 1 ) 。
关键词 免咬干扰素 中国商陆皂贰 美洲商陆
许多有丝分裂原 ,如植物血凝素 (P H A ) 。
刀豆蛋 白A ( co n A ) 及菊 稿球菌肠 毒 素 , 某
些 化 学 品 ( t e t r a d e e a n o y l p h o r b o l 一 1 3 一 a c e t e
T P A )
,特异抗原 ( P . P . D , O )T 及抗 T 细胞 一单
克隆抗体对人 的淋巴细胞都能诱生 出不 同效
价的 I F N 一丫。 丫干扰素与 a 干扰素的性质不 同。
它对 56 ℃及 p H Z不稳定 , 可被抗 I F N 一丫的
抗体中和 , 除具有一定的抗病毒活性外 , 又
有较高效能的免疫调节作用 。 此外还能抑制
细胞生长和较强的抗肿瘤效用 , 这包括能增
强 N K 细胞 、 K 细胞活性 , 还可能增高致 敏
的 T细胞对靶细胞的细胞毒性作用 , 一般 相
信它可能在临床治疗上有较好 的作用 。 但生
产I F N 一丫需要大贫的 T 淋 巴细胞 , 由于人的
血源供应困难 , 而人脐血又不适于诱生 IF N
叮 , 所以我们试用正常人外伤脾及某些病人
切除脾的细胞作为诱生细胞 。 又因已报道的
诱生方法 , 除 p h or b ol 与有丝分裂原合用 可
诱生较高效价 I F N 一 丫外 l[ ’ 5 〕但该化学 品有 致
癌作用 , 而其他诱 生 剂诱 生 的 IF N 一丫 , 效
价一般都不太高 z[] , 我们试用美洲商陆及 中
国商陆电贰对人脾细胞在 体 外 诱 生 I F N 一丫
以比较它们的诱生效果 , 中国商陆皂贰有免
疫增强作用 13」,
道 。
但尚未见有诱生干 扰素的狄
材料与方法
(一 ) 材料
1
. 人脾脏 : 由医院外科手术室切 脾 后
供给 。
2
.
11`国商陆皂贰 ( e s e u l e n t o s i d e ) 由本
校药学系植化教研室提纯供给。
3
. 美洲商陆 : 美国 is g m a 化学公 ,司 出
口
p IJ o
4
. 检测系统 : 人羊 膜 细 胞 ( w IS H 株
及水泡性 口腔炎病毒 (V S V ) 。
5
. 人血清白蛋 白: _ L海生物制品 研 究
所产品 。
6
. 氨基酸 一 山梨醉 : 天津第二生化制药
厂生产 。
7
. 抗 IF N 一丫单克隆抗体由美国纽 约 大
学 V i l e e k 教授和 J u m i n g L e e l枣士赠
送 。
(二 ) 方法
1
. 人脾细胞悬液的制备 : 将外科 手 术
摘除的脾脏 , 以 H a n ks 液洗去脾脏表面的血
艺 5 9
液 , 无菌条件下剥去脾包膜 , 用长解剖刀在
脾表面轻轻刮取组织 , 放入摇珠瓶内 , 加拍
倍体积的 E ag le s 液 , 在 冰 浴 中 用 力 振 摇
30 m in
, 使细胞充分分散 , 然后用两层 纱 布
过滤 , 将获得的细胞悬液 , 加入 3倍体积的
。 . 5 3 ;石N H 3 C I 溶 液 ,放置 4 oC 冰箱 1 5m i n 使
红细胞溶解 , 再 以 H an ks 液洗 涤 三 次 , 最
后悬于无血清培养基中备用 。
2
. 丫 干扰素的制备
将人脾细胞悬液 , 用无血清 培 养 基 稀
释 , 调整脾细胞浓度成每 m l 含 有 5 x l护一
1护个细胞 , 然后按每 m l 分别加入美洲商陆
l叩 g 或中国商陆皂贰 20 林g , 分装于大 号 克
氏瓶中 , 平放在 5% C O Z 孵箱中培养 7 2 h 后 ,
将培养物放入离心管中 , 每分钟 1 0 0 0 0 转离
心 3 o m i n , 收取上清检测 , 产生有 丫干扰素
者 , 于 一 20 ℃冰箱中贮存。
3
. 效价测定 : 采用病变抑制 法 , 按 照
iF nt er 因 方法加以改进为二步法 。 将待测的
丫干扰素样 品用 1 6 4 0 培养液按倍比稀 释后 ,
每一稀释度取 o . s m l 分装入小 瓶 内 , 再 加
0
.
5m l 的 W I S H 细胞悬液一 起孵 .育 24 小时
后 , 弃去上清液 , 加 入 5 0 0一 1 0 0 0 T C xD S 。 /
ml 的水泡性 口腔炎病毒 , 37 ℃孵育 24 小时
以上 , 观察病毒对照管的细胞致病效用达到
份~ 姗时 , 即记录全部试验结果 , 凡能保护
50 %的细胞不出现细胞致病效用的干扰素最
高稀释度作为干扰素效价 ( C PI 50 u / m l) 的终
点。
(三 ) 丫干扰素的鉴定 : 用美洲 商 陆 或
中国商陆皂贰对正常人外伤脾及各种病人脾
细胞诱生 出的于扰素经下法鉴定 , 确定其为
IFN
一 Y
o
1
. 酸敏感试验 : 在被试的干扰素 中 加
NI H CI 使 p H 降至 2 , 在 4℃冰箱中放置 3
~ s 天 , 然后 用 I N 的 N a O H 调至 p H 7 , 再
用w ls H细胞检测干扰素效价 , 对细胞致病
效用的保护消失 > 90 %者或测得 效 价 低 于
100 C p I 5 0 U / m l 者为阳性 。
艺. 耐热性公协众: 将被试的干扰素 在 水
浴中加热 邱 ℃ 月 、 : n , 检测对细胞致 病 效
用的保护力夜失丫矛勺 I F N 一丫。
3
. 抗 了 一 l二打。 索草克隆抗体中和 试 验 :
抗 , 卜扰京的 , 一江克隆杭体 , 艰 1 6 4 0培 养 液
作 1 : 5 稀释 , 将待测的粗制 I F N 一丫 作 Z f音
递增稀释 , 灯稀释度那入等觉 1 : 50 稀释的
单五隆抗体兹合 , 仪 3 7℃ h1 使抗体与 干 扰
素充分中和然后测定效价 。 以 I F N 一 丫完全或
90 %失去保护细胞抗病毒活性者 为 中 和 阳
}生。
结 果
拍例正常人外伤脾细胞分别加 P w M 及
中国商陆宅成 , 7 2 h 后检测诱生 出的干扰 素
效价 , 结果 以 P w M 诱生的效价平均为 3 . 48
土 0 . 5 9 , 此中国商随 .皂贰诱生的效价为 2 . 鸵
土 0 . 42 , 两者有显著差别 (P > 0 . 0 5) , 经 加
热 、 p H Z及抗 I F N 一丫单克隆抗体 鉴定 为 免
疫干扰素 ( I F N 一丫) 。
8 例各种疾病切除的脾 细 胞 , 以 P w M
诱生干扰素效价平均为 3 . 6 , 土 。 . 3 5 , 以中国
商陆皂试诱生的币抽丸索效价 平 均 为 2 . 95 土
0
.
42
, 两 者 相 左 有 极 显 著 的 差 别 ( r <
0 0 1 )
。
讨 沦
脾脏是人体内坛大的淋巴器官 , 含有丰
富的 T 、 B 淋巴细胞 、 巨噬细胞及与免疫 有
关的其他细胞 (如 N K 细 、 K 乡迸胞及树 突细胞
等 ) , 玉互于尘产干扰素 , 其中 T 淋巴细胞 己
被多数研究者 证 实 是 IF N 一丫的主 要 生 产
者 口’ 。 ] , 也有人证明 B 淋巴细胞 口 ’ “ 3 , 甚 至
非 T 魂卜B 淋 巴细胞 阴也可产 生 I F N 一丫。 我们
用正常人外伤脾及病人脾细胞 , 在体外以美
洲商陆及 甲国商陆皂伏刺激 , 皆诱生出高效
价的 I F N 一丫 , 这是否 自于同时激活了 T 细胞
及 B 细胞听致 , 我们未作进 一步的验证 , 但
考 虑到美洲商陆曾被证明是 T 细施及 B 细胞
.26 0
.
表 正常人外伤脾细胞以美洲商陆及
中国商陆皂试诱生 l于N 一 丫的效价比较
C o mp ar i sn o of !N F
一丫 ti tr e in d u e ed
f r o m tr a u m a ti e sl p e en e elP l b y讥一 M
n ad E s
试验例 数
( te s tCZ s e s )
丫 f 扰素效价
( F IN
一 r ti ter )
美洲商陆
( P WM )
I
J o g ]。 CP I 50 U / ml
中国商 陆皂戒
( e s e ul en to sd i e )
3
。
8 6 0
3
。
8 06
3
.
10 7
3
.
50 3
魂。 l( 飞 7
连. 八 0 53
26 02
2
。
90 3
2
.
6 2 0
2
.
6 2 0
它 _ 9( 1 3
诱生干扰素的产量 。
在本实验中我们采用的8 例 病 人 脾 细
胞 , 绝大多数都 是 取 自门脉 高 压 脾 亢 的
病人 , 一例是胃癌转移 , 一例是血吸虫脾 ,
它们之间的产量高低不等 , 其中癌症转移的
脾细胞不宜采用 , 一 方面诱生的 I F N 一丫 效价
不如非癌病人脾细胞产量高 , 另一方面因癌
症病人脾 , 由其诱生的干扰素 , 给人使用有
不安全的顾虑 , 我们皆废弃不用 。
1 0
m e a n 士 S D
2
.
9 0 3
3
。
10 7
3
.
4 8 土 0 . 5 9
3
.
1吸〕从
2
.
6 0 2
3
。
8 0 6
2
.
6 0 2
2
.
9 0 3
2
.
9 2士 0 . 4 2
两者的有丝分裂原 ,
P < 0
.
0 5
由它同时刺激两者细胞
产生 I F N 一丫 或许是 , 1于能 的 , 有待 进一 步 查
明 。
在我们的资料中美洲商陆及中国商陆皂
贰虽都能使脾细胞诱生出 I F N 一 丫 , 但中国商
陆皂贰 , 无论对正常人外伤脾或病理脾细胞
诱生的 I F N 一丫效价都比美洲商陆为 低 , 两者
相差皆有显著性 , 这种差别显然是因为两种
商陆的物理化学性质不 同外 , 又 可能与它们
能否同时刺激 T 、 B 两群淋巴细胞有关 。 美洲
商陆是一种糖蛋白 , 有抗原性 , 能刺激 T 细胞
产生多种集落刺激因子 ( C S F )及 自细胞 介素
2 ( I L
一
2 )
, 而 中国商陆皂贰是一种三菇皂贰 ,
由 ,卜国商陆的根中提取的 , 分子量较小 , 实
验证明对小 白鼠自细胞的吞噬功能有显著促
进作用 , 又能提高小鼠细胞 合 成 D N A , 被
认为是一种免疫增强剂 , 有治疗 肿 瘤 的 效
用。 由于此物质无免疫原性 , 又无毒性 , 用
它诱生粗制干扰素 , 虽然效价较美洲商陆诱
生者稍低 ,但不需除去该物质 , 即可应川于人
体 , 是共便利之处 。 今后应位得研究提高其
参 考 文 献
1
.
T a n i g u e h i T
,
P a n g R P L
, e t a l
.
P a r t i a l e h a r a
-
e t e r i z a t i o n o f 丫 ( i m m u n e ) i n t e r f e r o n m R N A
e x t r a e t e d f r o m h u m
a n I y m P h
o e y t e
.
P r o e N a t
A e a d S e i U S A 19吕l ; 78 : 3 46日一 34 7 2 .
2
.
F i n t e r N B
, e t a l
.
I n F i n t e r N B ( e d )
:
I n te r
-
f e r o n s a n d I n t e r f e r o n i n d u e e r s 1 9 7 3 ; 1 3 5
-
1 70
。
3
. 易杨 华。 商陆有效 成份的研究 I 、 三 隋皂试的分离鉴
定 。 中草 药 1 9只叹, 1 5 ( 2 ) : 7一 1 1。
通. M a r e u e e i F
.
e t a l
.
P r o d u e t i o n o f i m m u n e
i n t e r f e r o n b y m u r i n e e e l l s e l o n e s f r o m L
o n g
t e r 一n e u l t u r e . N a t u r e 19 8 1; 2 9 1 : 7 9 一 8 1 .
5
.
N a th a n l
, e t a l
,
I m m u n
e (丫 ) i n t e r i e r o n
P r o d u e t i o n b y a 11 u m a n T l y m P h o b l a s t l i n e
.
N a t u r e 19白0 ; 艺8 7 : 4 0 1一 4 0 8 。
〔; . M o r r i s A G , e t a l
.
I m m
u n e i n t e r f e r o n s r e l a
-
s e
w h e n a
e l o n e d C y t o t o x i e T C e l l l i n e m e
-
e t s i n e o r r e c t i n f l u e n z a i n f e e t e d t a r g e t e e l l
.
N a t u r e 1 9吕吕; 2 9 5 : 1 5 0 1 5公.
7
.
E p s t e i n L B
, e t a i
.
F l u o r e s e e n e e
一 a e t i v a t e d
s o r t i n g o f h u m a n T a n d B l y m p h o e y t e s 盗,
I d e n t i f i e a t i o n o f t h e e e l l t y P e r e s P o n s i b le
f o r i n t e r f e r o n P r o d u e t io n a n d
t i o n
1 9 7 4
;
i n r e s P O n s e t o m i t
o g e n
.
e e l l P r o l i f e r a
-
e e l l I m m
u n o l
.
12
: 4 0 7
一 4 2 1
8
.
W
a l l e n W C
, e t a l
.
I n t e r f e r o n a n d t h e e e l l
一 u l a r i fn m
u n e r e s P o n s e s e P a r a t i o n o f i n te
-
r f e r o n P r o d u e t i n g e e l l s f r o m D N A
s y n t h e t i e
e e l l
.
e e l l I m m u n o l 1 9 7 3 ; 6
:
1 10 12 2
.
9
.
K i r e k n e r H
, e t a l
.
s t u d i e s o f t h e p r c d u e e r
c e l l c 下 i n t e r f e r o n i n h u m a n l y m p h o e y t e
c u l t u r e s
.
I m m u n o b i o l 1 9了3 , 1 5 6 : (15一 了5 .
1 9 8 〔i年 3月 3 日收稿 , 1 9 8 6年 5月 2 日修回
.3 22
·
ad r u gd o s e of sm g / k g
.
T h eph ot od y a nm i ed a m a g o o nt u m or s i nel o o el y e or r el at ed
t od r u gd o s e w it h a g iv e nl i gh t d o s e
.
T h eP h ot od y a nm i e ef f e et s o nd if介 r e nt t u m or s
ar e e s s e nt i al l y e o ns i st e nt w it h e a eh ot h er
.
b Ar i gh t or a ng ed
一 r ed f l u or e s e e ne e aP P e ar ed o nt l一 et u m ort i s s u e s of S 18 O s ar e o m a,
L e w i s I u n g e a r e i n o m a o r U 1 4 e e r v i e a l e a r e i n o m a l〕 e a r i n g m i e e o n e x P o s u r e t o a r g o n
l a s e r a n d /
o r U V l i g h t ( 3 6 5nm )
2 4 a n d 4 8 h a f t e r r h e i n j e C t i o n o f s m g / k g
o f p s D -
0 0 7
.
B u t n o f l u o r e s e e n e e w a s f o jt n d o n t h e n o r m a l t 一5 5 , l e s a r o u n d t h e t t lm o r s u n d e r
t h e s a m e e o n d i t i o n s
.
I t 15 s u g g e s t e d t h a t P s D
一
0 0 7 n l a y b e s P e e i f i e a l l y u P t a k e n i n t o
t h e m a l i g n a n t t i s s u e s
.
T h e i n t e n s i t y o f f l 、 l o r e e e n e e o n t 、 m o r s 1 5 d i r e e t l y P r o P o r t i o n a l
t o d r u g d o s e a n d i n v e r s e l y P r o P o r t i o n a l t o t h e t i m e i n t o r v a l b e t w e e n d r u g a dm i n i s t r a
-
t i o n a n d o b s e r v a t i o n o n t h e f i u o r e s e e n e e
.
T h e h o m o g e n e i t y o f d i s t r i b u t i o n o f l i g h t e n e r g y 入、 a s
a P e r t u r e ” P l a e e d b e t w e e n t h e l i g h t s o u r e e a n d i r r a d i a t e d
i nr P r o v e d b y u s i n g a “ l e n ,
a n i m a l
.
A m o d e l s y s t e m w a s t h u s P r o v i d e d f o r t圣z e e v a l u a t i o n o f t h e e f f i e i e n e y o f d r u g s
i n t h e P h o t o e h e m o d i a g n o s i s a n d Ph o t o e h e m o t h e r a P y f o r a n i m a l t IJ m o r S
k e y w o
r d :
, P h o t o e a r e i n o r i n 带
t a n s P l a n t e d a n im a l
t u m o r 带 P h o t o e h e m o d i a g n o s i s a n d P h o t o e h e m o t卜e r a P y 辛
t u m o r 半 p h o t o d y n a m i e e f f e e t米
( O r艺g 艺声Za l a 了亡i e l召 。 挽 p a g e 2 5 3 )
E F F EC T S O F P O K E W E E D M IT O G E N AN D E S C U L E N T O S ID E IN IN D U C IN G IM MU N E
INT E R F E R O N F R O M H U M A N S p L E E N C E L L S
Y a n g s i k u n e t a l ( D e P a r t m e n t o f M i e r o b i o l o g y )
T h e e f f e e t s o f P o k e w e e d m i t o g e n ( P WM )
a n d e s e u l e n t o s i d e ( E s ) i n i n d u e i n g
i m m u n e i n t e r f e r o n ( I F N
一 Y ) f r o m n o r m a l t r a u m a t i e s P le e n a n d P a t i e n t , 5 s P l e e n e e l l s
w e r e s t u d i e d
.
T h e i n t e r f e r o n i n d u e e d w a s P r o v e d t o b e h u m a n i m m u n e i n t e r f e r o n
( H U I F N
一 Y ) b y d e t e r m i n a t i o n o f i t s s e n s i ,注v i澳y t o P l l 2 a n d u n s t a b i t i t y a t 5 6 oC a s
w e l l a s n e u t r a l i z t i o n b y m o n o e l o n a l a n t i b o d y t o H U I F N
一
Y
.
T h e a v e r a g e t i t r e s o f I F N
一
Y ,
i n d u e ed w i t h P WM o r E s
, f r o m t h e s P I? e n e e l l s o f 1 0 t r a u m a t i c P e s o n s W e r e 3
.
40
士 0 . 5 9 a n d 2 . 9 2 土 0 . 4 2 L o g 1O C p I 5 o U / m l r e s p e e t i v e l y , a n d t h o s e f r o m t h e s p l e e n e e l l s
o f 8 P a t i e n t s w e r e 3
.
6 9 土 0 . 3 5 a n d 3 . 0 1 二吐0 . 3 5 L o g ] OC P I S O U / m l r e s p e e t i v e l y
.
T h e e f f e e
`
o f E s i n i n d u e i n g I F N
一丫 f r o m e i t h e r t r a u m a t i e o r p a t i e n t , 5 s p了e e n e e l l s w a s l o w e r
t h a n t h a t o f P WM ( P < 0
.
0 1 )
.
k e y w o r d s : i m m u n e i n t e r f e r o n 牛 P o k e w e e d m i t o g e n s e s e u l e n t o s i d e 带
( 0 7艺9 1砚 a l a 犷t玄e l e O n p a g e 2 5 8 )