全 文 ：第 3 4卷第 5期
20 03年 1 0 月
土 坡 通 报
C h l
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V o l
.
3 4
,
N心.
2 0 0 3
重金属污染土壤毒性的发光菌法与斜生栅藻法诊断
李 彬1,2 , 李培军“ , 王 晶“ , 张海荣“
( 1
. 北京科技大学 冶金与生态工程学院 , 北京 1 0 00 8 3 ; 2 . 中国科学院沈阳应用生态研究所 , 辽宁 沈阳 1 10 0 16)
摘 要 : 应用斜生栅藻 ( S 油如油仇us 蒯咖 us )和明亮发光杆菌 3T (月切如地浪“ “ m hP 俄动。 ,恻 m )对重金属污染土壤的
毒性进行诊断 , 结果表明 , 斜生栅藻的增长率和发光菌的相对发光度与土城中的重金属含 t 明显相关 ,并且随重金属投加
量的增加 , 其增长率和发光度逐渐降低 , 对 3 种测试参数进行 比较 ,发现采用细胞数增长率作为土壤毒性的检测指标比采
用光密度增长率和相对发光度更为敏感。 复合污染情况下 , 由于金属间的协同作用 ,使土壤的毒性比单一重金属污染时有
明显的增强 ,从而为污染土壤的优先修复提供了理论依据 。
关 健 词 : 藻 ; 发光菌 ;土壤 ; 毒性
中图分类号 : x 5 02 文献标识码 : ^ 文章绷号 : 05 64 · 394 5 ( 20 03 ) 0 5· 04 48 · 04
重金属作为土壤污染的一种主要的污染物 , 对环
境和人类的健康造成严重的危害 。 只有实现污染土壤
的快速诊断 , 才能更加有效的实现土壤的保护 , 为污染
土壤的预防、 治理提供依据 , 这就要求除了利用理化方
法来跟踪监测环境变化外 , 还需要通过生物法来监测
各种污染物的综合毒性和评价它们对生态系统的潜在
危害 。 最初发光菌和斜生栅藻主要用于水体污染物的
毒性检测 [’ ] , 以后逐步发展形成了一系列标准的水生
生态毒理学实验方法 2[] , 但将此法用于土壤污染物毒
性检测 , 目前尚无标准的实验方法 。 因此 , 将其用于土
壤污染毒性诊断 , 确定土壤毒性的剂量 一 效应关系 , 实
现土壤毒性的快速诊断 , 从而为清洁土壤标准的建立
提供依据 , 仍然是人们面临的艰巨任务。 本文在实验
室条件下 , 采用人工定量投毒的方法 , 应用发光菌和斜
生栅藻探讨了单一和复合污染条件下土壤毒性变化 ,
以期为实现土壤毒性的生物诊断提供理论依据 。
1 材料与方法
1
.
1 供试材料
1
.
1
.
1 供试土壤 潮棕壤 (湿润淋溶土 )采 自中国科
学院沈阳应用生态研究所十里河生态站无污染实验小
区 ( 0 一 2 0 c m ) , 实验选用过 20 目筛风干土 , 土壤 p H 6 .
2 2
, 重金属含量分别为 C d 0 . 1 2 2 、 C u 19 . 1 、 Z n 4 9 . 9 0 、
P b 2 5
.
7 m g / k g
。
1
.
1
.
2 供试污染物 dC 1C 2 · 2 . 5珑O 、 C u OS 月二 5氏O 、
P b( N场 ) 、 z n SO招. 7珑 O 均为分析纯试剂 , 以水溶液的
形式投加 , 投加量以 m g / k g 干土计算。
1
.
1
.
3 供试生物 明亮发光杆菌 T 3 (外川汉沁以曰性u m
外叫物删 m ) , 购自中国科学院南京土壤所 , 采用的培
养基为 :酵母浸出汁 0 . 5 9 , 胰蛋白陈 0 . 59 , N a C 1 3 g,
N aZ H Pq 0
.
59
,
K珑 P o4 0 . 1 9 , 甘油 0 . 3 9 , 蒸馏水
10 0m l 配制而成 , pH 6 . 8 , 1 20 磅灭菌 3 0 m i n 。
斜生栅藻 ( S肥 n翻油m u : 砧左卯 us ) 购 自中国科学
院武汉水生生物所藻种库 , 采用水生 4 号培养基 31[ ,
2 5℃ 4 0 0 0 l x 进行培养 。
1
.
2
1
.
2
.
1
实验方法
土壤酸浸液 称取 4鲍 过 20 目筛的土壤 ,
1 : 2
.
5 的 比例用 H a 0 . l mo l/ L 浸提 2 小时 , 过滤 , 取
滤液 2 0m l , 调节 pH 为 6 . 6 , 过滤定容 2 0 m l , 按 3% 的
比例添加 N a CI 0 . 6 9 , 进行生物毒性测定。
1
.
2
.
2 抖生栅藻的 同步培养 采用连续接种的方
法 4[] , 使所有的细胞个体处于 良好的条件下 , 在光照
期迅速发育 , 而后借光暗迭替 , 促使其迅速完成细胞分
裂 , 获得子细胞 (即幼期暗细胞 ) , 实现同步培养 。
1
.
2
.
3 生物毒性浏定 采用南京土壤研究所研制的
G X Y 一 2 型生物毒性测定仪测定土壤浸提液 15 m讯 的
毒性 。
1
.
2
.
4 光密度浏定 采用惠谱 7 5 5 0 分光光度计 ,
6 5Onm 处进行测定。
1
.
2
.
5 细胞数测定 采用血球记数板 , 依下式换算 :
细胞数 = s n X 10 4 (n 为 5 个中格内细胞数 )
2 结果与分析
2
.
1 斜生栅旅的同步培养
2 0 世纪 60 年代末 , 日、 美 、 欧各国学者进行了
收稿日期 : 2 0 0 3一 0 5一 0 1
鑫金项目 :中国科学院知识创新项目幻 C Q 一 SW 一 4 16 和国家自然科学基金项目(以份刀。阳 )及国家重点基础研究发展生态规划项目(1G 浇以〕1 1即 8 )资助
作者简介 :李 彬 ( 1 974 一 ) , 女 , 辽宁省沈阳市 . 硕士 , 讲师 , 主要从事污染生态和环境技术的研究 。 E m ` 1: 仙in7 4 @ y a h 为 . co m
5 期 李 彬等: 重金属污染土攘毒性的发光菌法与料生橱藻法诊断
很多有关藻类同步培养的研究5 [, “ 1, 推动了藻类生理 、
生化的迅速发展。 所谓同步培养 , 即使用某些方法使
藻类培养物中的大量细胞个体 , 从其生活周期中的某
一相同阶段出发 , 步调一致的依次经越和完成各个生
长发育阶段 , 再重新回到原来的阶段。 根据生态毒理
J`一匕尸a八J叻曰Q`21.…0000刁 les.月esl esesJ,es.光密度
( O D )
汐ǐ s口。P工巴一ldo侧却歌
细胞数 ( C N )
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时间 T jm e (h )
图 1 科生栅旅光密度和细胞数变化
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.
1 C ha n g e of Ol)
t ical d en
s it y ( O D ) 朋d c el l n u m b e r ( C N ) of
段 en ed o m us ob l吨u 山
实验的要求 , 进行毒性实验的生物应大小 、 年龄一致 ,
这样才能使结果更具有代表性和可 比性 , 因此对斜生
栅藻进行了同步培养 , 经同步培养后 的光密度和细胞
数见图 1。
从图 1 中看出 , 在栅藻同步培养的一个生长繁殖
周期中 , 光照期 , 细胞数基本稳定 , 即无形成和释放子
细胞的过程 , 但光密度直线增长 , 这是细胞生长期的特
征 。 停止光照 42 小时后 , 细胞数直线上升 , 而光密度
基本稳定 , 这是细胞分裂后期的特征 。 光密度和细胞
数在光照期和黑暗期的这些特征性变化 , 说明经同步
培养后 , 斜生栅藻已经达到同步生长状态 , 为本实验方
法的确立提供了良好的前提条件 。
2
.
2 单一重金属污染条件下的土壤毒性对发光菌 、斜
生栅藻的影响
图 2 是 3 种检测指标下 , 4 种重金属 dC 、 uC 、 nZ 、 bP
污染土壤酸浸液毒性对发光菌和斜生栅藻的影响 。 从
图中可以看出重金属的投加量与发光菌的发光度 、 斜生
栅藻光密度增长率、 细胞数增长率密切相关。 对不同检
测方法进行比较 , 结果表明斜生栅藻细胞数增长率作为
检测指标最敏感 , 其次是光密度增长率 , 这和文献的报
导完全一致川 , 而发光菌相对发光度敏感性最低 。
发光菌相对发光度
斜生栅藻光密度增长率
斜生栅藻细胞数增长率
:
▲m团. 发光菌相对发光度
印如。
O 田 旬 印 田 l田 」2 ) 0 器 40 印 田 10 1加
发光菌相对发光度
:发光菌相对发光度
们田。ǎ岁à。花名石蛋口日并事势
斜生栅藻光密度增长率
斜生栅藻细胞数增长率
菠 . . . 上
_ 一一~
一 口一一 _
_
~ 一一一一一
斜生栅藻光密度增长率
斜生栅藻细胞数增长率:nUU八nùōU0OU八d孟Q`` .人
0 15 0 0 3 0 0 0 咬5 0 0 6 0 0 0 0 团 叨 姗 幼 助 朋 肋
元素投加量 E le m e n t a d d e d ( m gk/ g )
图 2 盆金属污染土城浸提液对发光菌和斜生栅旅增长率的影晌
F谊 . 2 R e】a t i o n , h iP be wt e en th e con e ent r a t i o n of m e t瓦卜 日d d de 协 50 11 an d th e g~ th
r at e o f s 粉` 如m su 以忽卯公 a耐 月咖助以勿月“ m 乃。和。 甘 u m
土 维 通 报 3 4卷
mg / kg
、
Z n 80吨 / kg 、 u C0 0 2m 岁 kg 、P b 20 0mg / kg ;
以斜生栅藻细胞数增长率 5 0%为标准 , 4 种重金属的
临界值为 C d < 3 0 m g / k g 、 Z n < 8 0 m g / k g 、 C u < 2 0 0
mg / k g
、
bP < 2 0 0 mg / k ;g 以发光菌相对发光度 50 % 为
标准 , 4 种重金属 的临界值为 C d 2 0 m g / k g 、 Z n 4 0 m g /
k g
、
uC 3 0 0 m g / k g
、
P b 2 0 0 m g / k g
。
论
首次应用斜生栅藻生长抑制实验对重金属
结
,去
.
QO
不同重金属污染土壤的毒性强度也不同 , 造成这
种现象的原因 , 一方面在于土壤对重金属吸附能力不
同 , 余国营在对土壤吸附能力的研究中发现上壤对 P b
的吸附量最大 , dC 的吸附量最少 , 在同样重金属投加
量的条件下 , 以游离态存在的 dC 离子要高于 P b 离
子 , 这就使 cd 表现出 比 Pb 更强的毒性 v1[ , 同时土壤
本身的理化性质 ( PH 、 E h 、 C E C )等都会影响重金属的
毒性 。 另一方面不同重金属对生物的生理 、 生化指标
及种群数量的影响作用大小不同 6[] 。 另外不同的重
金属毒害作用的机制是不同的 , dC 主要结合在藻类的
细胞质和细胞的多磷酸体中 , 使这些细胞内含物的元
素组成发生离子变化 s[] , c u 主要是影响藻类的生长和
光合作用 , 改变原生质膜的渗透性 9[] , P b 对藻类的影
响主要是在细胞的叶绿素形成方面 t 10 , 所以当研究重
金属污染土壤毒性时 , 既要考虑土壤对重金属的吸附
特性 , 又要考虑生物对不同重金属 的敏感性和毒性作
用机制 。
2
.
3 复合污染条件下的土壤毒性对发光菌 、 斜生栅藻
的影响
单个重金属污染虽有发生 , 但在自然界和现实生
活中 , 重金属 的污染多为伴生性或综合性 〔` 〕, 在以往
的研究中 , 对单一重金属污染条件下的土壤毒性进行
了大量的研究 8[, ’ “ 1, 但对复合污染条件下土壤研究还
不多 , 对单一重金属污染土壤毒性的研究虽然有助于
制定环境标准和环境容量 , 但根据不足 , 缺乏说服力 ,
往往制定的标准与现实不符 , 甚至会造成严重后果 , 因
此有必要对土壤复合污染条件下的毒性进行研究 , 从
而确定清洁土壤的标准 。
从表 l 可以看出 , 由于复合污染 , 重金属之间的相
加 、协同 、 竞争等作用 , 使草甸棕壤的毒性在复合污染
的情况下与单一重金属污染时相 比有了明显 的改变 ,
对 4 种重金属在复合污染条件下对生物的影响进行极
差分析 ,结果表明 : 当采用斜生栅藻细胞数增长率和光
密度增长率作为诊断指标时 , Z n 对斜生栅藻细胞数增
长率和 光密度增长率的影响最大 , R (极差 )分别为
7
.
4
、
8
、
29
, 其次为 cd 、 c u 、 P b 。 当采用发光菌相对发
光度作为诊断指标时 , C d 对发光菌发光度的影响最
大 , R (极差 )为 8 . 1 3 , 其次是 Z n 、 C u 、 P b , R 值分别为
9
.
8
、
1 9
.
0 4
、
2 8
.
3 0
。
由于本实验采用的正交实验方法 , 难以具体对各
金属间的相互作用进行判断 , 但对研究复合污染条件
下影响毒性的主要因素进行判定 , 对确定复合污染条
件下的警戒值还是有重要意义的 。 以斜生栅藻光密度
增长率 50 % 为标准 , 4 种重金属 的临界值为 dC 30
污染土壤的毒性进行诊断 , 证明此方法是可行的 。
3
.
2 重金属的投加量与斜生栅藻的增长率和发
光菌的发光率之间有 明显的相关性 , 随土壤重金属投
加量的增加 , 斜生栅藻的增长率和发光菌的相对发光
率明显降低。
表 1
T a b le l
草甸棕壤场 ( 3今 )正交实验结果分析
R es 过st of o rt ho g o x l al a r r a y 与 ( 3` )
姗ō棚舷郭映几恤甸oJ吨闻吞吮甸cd吮甸实验号南 . 细胞数增长率% G刃 w山拍妞 of 己
p 喊哪听
发光菌相对
发光度%
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1 1( 10)
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3 1( 10)
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5 2( 20 )
6 2 (20)
7 3 (30)
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9 3 (3 0)
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一
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友一 2 (2 · 2水平总计) 蛇 .?3
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凡一 3 (3 一 3水平总计) 必 .牡
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2( 40 ) 2 (20 ) 2 (叨 0 )
3(匆 ) 3 (3的 ) 3( 7的 )
l ( 10) 2 (20 ) 3 (70 )
2( 40 ) 3 (3 0 ) l (2 00)
3 (劝 ) 1( 10 ) 2 ( 50 )
1(10 ) 3(3 0 ) 2( 50 0)
2 (40 ) 1( 10() ) 3(70 )
3( 80 ) 2 (20 ) 1( 20 )
1加 .拍 1肠 ,龙 1历 .叨
1犯 . 肠 1刀 .盯 145 46
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劝 . 印 31 .驹 27 . 然
松 胎 4 刀 37 . 男
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谷 . 龙 24 . 91 盆 . 田
41
.
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7, 4 18
.
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.
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xl-XI耘称lR凡
3
.
3 对 3 种测试参数进行比较 , 证明采用细胞数
增长率作为毒性检测指标 , 其敏感性最高。
5期 李 彬等: 重金属污染土峨毒性的发光菌法与抖生姗藻法诊断 4 51
3
.
4 复合污染条件下 , 由于重金属的协同作用 ,
毒性比单一重金属污染条件下有明显的增加 , 4 种重
金属的 E 5C o值 , 以斜生栅藻光密度增长率 50 % 为标
准 , 4 种重金属的临界值 C d 30 呢 / k g 、 Z n 80 m盯k g 、
C u 2 0 0 m g / k g
、
P b 2 0 0 m g / k g ;以斜生栅藻细胞数增长
率 50 % 为标准 , 4 种重金属的临界值 dC < 30 m g / k g 、
Z n < 8 0 吨 / k g 、 uC < 2 0 0呢 /掩 、 P b < 2 0 0 m g / k g ; 以发
光菌相对发光度 50 % 为标准 , 4 种重金属的临界值 dC
2 0 m g / k g
、
Z n 4 0 m g / k g
、
uC 3 0 0 m g / k g
、
P b 2 0 0
m岁k g 。
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