全 文 ：学 报
JournalofChinaPharmaceuticalUniversity　2010, 41(3):226-230
川贝母药材分子鉴定方法研究
徐传林 1 ,李会军 2＊ ,李 　萍 1＊＊ ,张　艺 3 ,王　曙 4
(1中国药科大学现代中药教育部重点实验室 ,南京 210009;2中国药科大学生药学教研室 ,南京 210009;
3成都中医药大学民族医药研究所 ,成都 611137;4四川大学华西药学院 , 成都 610041)
摘　要　川贝母基源鉴定对于其临床用药的安全性 、有效性非常重要 , 但基于性状 、显微或化学成分的鉴定方法缺乏
专属性 , 因此 ,建立专属性强的川贝母分子鉴定方法具有重要意义。本研究在本实验室前期研究工作的基础上 , 建立了一
种适用于川贝母商品药材(干鳞茎)的简便可行的聚合酶链反应-限制性酶切图谱(PCR-RFLP)分子鉴定法 ,即称取贝母干
鳞茎 20mg,依次用 75%乙醇和灭菌超纯水清洗后 , 以新型广谱植物基因组 DNA快速提取试剂盒提取基因组 DNA,以所提
取的 DNA为模板进行 ITS1区 PCR扩增和酶切反应 ,最后将酶切液进行琼脂糖凝胶电泳 ,所得图谱显示川贝类核糖体 DNA
的 ITS1区存在限制性内切酶 SmaⅠ的酶切位点 , 在 100 ～ 200 bp之间有 2条清晰的酶切条带 ,而非川贝类均不能被酶切 , 没
有这两条特征性条带 。该方法应用于 12批贝母商品药材的鉴定 ,可将川贝类药材与非川贝类药材区别开来。
关键词　川贝母;干鳞茎;分子鉴定;PCR-RFLP
中图分类号　R282.5　　文献标识码　A　　文章编号　1000 -5048(2010)03 -0226 -05
MolecularmethodfortheidentificationofBulbusFritilariaeCirrhosae
XUChuan-lin1 , LIHui-jun2＊ , LIPing1＊＊ , ZHANGYi3 , WANGShu4
1KeyLaboratory ofModern Chinese Medicines (China PharmaceuticalUniversity), Ministry ofEducation, Nanjing
210009;2 DepartmentofPharmacognosy, ChinaPharmaceuticalUniversity, Nanjing210009;3EthnomedicineInstituteofChengduUni-
versityofTraditionalMedicine, Chengdu611137;4 WestChinaSchoolofPharmacy, SichuanUniversity, Chengdu610041 , China
Abstract　TheoriginidentificationofBulbusFritilariaeCirrhosaeisessentialforclinicalsafetyandefica-
cy.Previouslyreportedidentificationmethodsbasedonmacroscopical, microscopicalorchemicalcharacteristics
lackspecificity, therefore, themolecularidentificationmethodisofsignificance.Basedonthecontinousinvestiga-
tionontheidentificationofBulbusFritilariaeCirhosaeinourlaboratory, asimpleandfeasiblePCR-RFLPmeth-
odwasnewlydeveloped.Theexperimentalprocedurewasdescribedasfolows:afterthepretreatmentof20 mg
driedbulbsofFritilariawith75% ethanolandsterilizedultrapurewater, genomicDNAwasextractedwiththe
novelanduniversalplantgenomicDNAextractionkit, thenPCRamplificationofITS1 regionsandrestrictionen-
zymedigestionreactionwascarriedoutsuccessively.TheresultantelectrophoresisspectrumshowedthatITS1 re-gionsofBulbusFritilariaeCirrhosaewererecognizedbyrestrictionenzymeSmaⅠwithproviding2 distinctfrag-
mentsbetween100 bpand200bp, whileotherspeciescouldnotbedigested.Finaly, 12 batchesofcommercial
BulbusFritilariaewerecorectlydiferentiatedthroughtheabove-mentionedmethod.
Keywords　BulbusFritilariaeCirrhosae;driedbulbs;molecularidentification;PCR-RFLP
ThisstudywassupportedbytheNationalKeyTechnologyR＆DProgramofChina(No.2007BAI40B05)
　　贝母为常用止咳化痰中药 ,中医传统上将贝母
分为 “川贝” 、“浙贝”两大类别。当前 ,随着对我国
贝母属植物资源的深入研究以及长期用药实践 ,
《中华人民共和国药典 》[ 1]共收载有 5大类贝母:
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＊ 收稿日期　2010-01-22　　通讯作者　　＊Tel:025-83271382　E-mail:cpuli@163.com
＊＊Tel:025-83271379　E-mail:liping2004@126.com
基金项目　国家科技支撑计划资助项目(No.2007BAI40B05)
第 3期 徐传林等:川贝母药材分子鉴定方法研究
即川贝母 [ 1] 25-26、平贝母[ 1] 65、伊贝母[ 1] 95-96 、浙贝
母 [ 1] 205和湖北贝母[ 1] 242-243。由于川贝母资源短
缺 、价格高 ,药材市场常出现以次充好 、以假乱真的
现象 ,如用小平贝 、小浙贝混充川贝母 ,因此建立川
贝母的基源鉴定方法十分必要 。
传统的鉴定方法(性状 、显微结构及化学鉴定
方法)容易受到药材生长环境 、生长年限以及产地加
工等诸多因素的干扰 ,很难将川贝类与非川贝类区
别开来。由于核糖体 DNA(nrDNA)中的 ITS区(被
5.8SrDNA分隔为 ITS1和 ITS2两个片段)进化速率
快 ,具有高度重复 、长度适中稳定(约 700 bp)、不易
受药材外部环境和加工等因素影响的特点 ,成为植
物系统发育与分类研究的重要分子标记 [ 2] 。
本课题组对贝母属 ITS区 DNA测序[ 3]发现 ,
药用贝母第 75位碱基(ITS1区)可作为鉴定川贝
母的独特碱基位点 , 即川贝类在第 75位碱基为
“C”,而非川贝类为 “T” ,据此建立了一种具有高
灵敏度及专属性的分子鉴定方法———聚合酶链反
应 -限制性酶切图谱 (PCR-RFLP)鉴定方法 [ 4] ,即
川贝类均有限制性内切酶 SmaⅠ(该酶的识别序列
为 CCCGGG)的酶切位点 ,而非川贝类此位点处的
DNA序列为 CTCGGG,没有该酶切位点 ,从而能够
鉴定川贝与非川贝类 。但是 ,该项研究中所用供试
材料大多是新鲜鳞茎和叶片 ,且基因组 DNA提取
耗时长 ,不适用于川贝母药材(干鳞茎)的常规鉴
定。本研究旨在筛选出适合于贝母药材基因组
DNA的提取试剂盒 ,并在此基础上对 PCR-RFLP
方法进行优化与方法学考察 ,从而建立起适用于川
贝母药材的 PCR-RFLP鉴定方法 。
　材　料
1.1　药　材
实验用各种贝母对照药材中 ,湖北贝母 、平贝
母 、伊贝母 、浙贝母购自中国药品生物制品检定所
(NICPBP),川贝母收集自各贝母主产地(表 1),种
名经中国药科大学李萍教授 、四川大学王曙教授及
成都中医药大学张艺教授鉴定;实验用 12批川贝 、
非川贝类商品药材购自南京市各药店(表 2)。
Table1　ReferencedrugsofFritilariausedinthisstudy
No. Chinesename Latinname Habitat/Source
R1 Anzibeimu F.unibracteataHsiaoetK.C.Hsia. Maocounty, Sichuan
R2 Gansubeimu F.przewalskiMaxim. Yeduo, Qinghai
R3 Juanyebeimu F.cirhosaD.Don. Kangding, Sichuan
R4 Suoshabeimu F.delavayiFranch. Luding, Sichuan
R5 Taibaibeimu F.taipaiensisP.Y.Li Chengkou, Chongqing
R6 Wabubeimu F.wabuensisS.Y.TangetS.C.Yueh Songpan, Sichuan
R7 Hubeibeimu F.hupehensisHsiaoetK.C.Hsia NICPBP
R8 Pingbeimu F.ussuriensisMaxim. NICPBP
R9 Yibeimu F.palidifloraSchrenk NICPBP
R10 Zhebeimu F.thunbergiMiq. NICPBP
NICPBP:NationalInstitutefortheControlofPharmaceuticalandBiologicalProducts
Table2　CommercialdrugsofFritilariausedinthisstudy
No. Commercialname Originalsource
S1 Hubeibeimu Hubei
S2 Pingbeimu Heilongjiang
S3 Pingbeimu Jilin
S4 Yibeimu Xinjiang
S5 Yibeimu Xinjiang
S6 Zhebeimu Zhejiang
S7 Chuanbeimu(Songbei) Gansu
S8 Chuanbeimu(Qingbei) Gansu
S9 Chuanbeimu(Lubei) Anhui
S10 Chuanbeimu(Qingbei) Yunnan
S11 Chuanbeimu(Lubei) Sichuan
S12 Chuanbeimu(Songbei) Sichuan
1.2　试　剂
Wizard基因组 DNA纯化试剂盒 , Tris碱(美国
Promega公司);植物干粉 DNA提取试剂盒 [天根
生化科技(北京)有限公司 ] ;植物基因组 DNA提
取试剂盒 (北京三博远志生物技术有限责任公
司);通用基因组 DNA提取试剂盒 Ver.3.0(大连
Takara公司);新型广谱植物基因组 DNA快速提取
试剂盒(北京盖宁金诺生物技术有限责任公司);
TaqDNA聚合酶 , 100bpDNALadder, SmaⅠ酶(立
陶宛 Fermentas公司);GelRad(美国 Biotium公
司);dNTP,引物(上海生工生物工程有限公司);
琼脂糖(西班牙 Biowest公司);其他试剂均为国产
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学 报 　 JournalofChinaPharmaceuticalUniversity 第 41卷
分析纯 。
1.3　仪　器
Mastercycler梯度 PCR仪(德国 Eppendorf公
司);GelDoc2000凝胶成像系统(美国 Bio-Rad公
司);EPS-100电泳仪(上海天能科技有限公司)。
　方法与结果
2.1　贝母干鳞茎 DNA的提取
以瓦布贝母(R6)为实验材料 ,比较了常用的
5种试剂盒即 Wizard基因组 DNA纯化试剂盒 、植
物干粉 DNA提取试剂盒 、植物基因组 DNA提取试
剂盒 、通用基因组 DNA提取试剂盒和新型广谱植
物基因组 DNA快速提取试剂盒对贝母干鳞茎
DNA的提取效果 ,结果发现只有后两种试剂盒能
用于提取贝母干鳞茎 DNA,但通用基因组 DNA提
取试剂盒的提取条件是干鳞茎用量 100 mg、65 ℃
水浴 1h,而新型广谱植物基因组 DNA快速提取试
剂盒只需 20 mg干鳞茎 、65 ℃水浴 10 min,而且提
取效果优于通用基因组 DNA提取试剂盒 ,因此选
用新型广谱植物基因组 DNA快速提取试剂盒提取
贝母干鳞茎 DNA。各贝母对照药材 DNA电泳结
果见图 1。
Figure1　ElectropherogramsofextractedDNAfromreferencedrugs
R1-R10:SeealsoatTable1
2.2　PCR-RFLP实验条件优化
参考文献 [ 5]操作步骤 ,以瓦布贝母 (R6)为
实验材料 ,对 PCR扩增的各阶段时间和循环次数
以及酶切时间进行优化。
2.2.1　ITS-1区 PCR扩增程序优化　对 PCR扩增
各阶段时间分别进行了考察 ,从电泳效果和节省时
间角度考虑 , 确定各阶段时间分别为:预变性
4 min,变性 30 s,复性 30 s,延伸 30 s,最后延伸
5 min。
2.2.2　ITS-1区 PCR扩增循环次数考察　比较了
20、25、30个循环的电泳结果 ,三者均能得到扩增
条带 ,只是 20个循环条带太弱 ,易造成阴性判断 ,
25个循环能看到清晰的条带 ,但亮度明显小于 30
个循环 ,为了使降解严重的 DNA也能扩增出清晰
条带 ,将循环次数定为 30。
2.2.3　酶切时间考察　以酶切率为考察指标 ,其
中酶切率 =(119 bp峰强度 +188 bp峰强度)/
(119 bp峰强度 +188 bp峰强度 +307 bp峰强度)
×100%。实验发现 ,酶切 1 h就能得到清晰的酶
切条带 , 1, 2, 4, 8 h的酶切率依次为 64%, 70%,
67%和 63%,因此确定酶切时间为 2 h。
2.3　PCR-RFLP方法学考察
以瓦布贝母 (R6)为实验对象 , 对 ITS-1区
PCR扩增 、电泳和酶切稳定性进行考察。
2.3.1　PCR扩增稳定性　按 ITS-1区 PCR扩增条
件平行扩增 5管 ,电泳结果用 Bio-Rad软件分析 ,
峰强度依次为:120.98、 114.48、 107.31、 121.84、
98.80, RSD为 8.62%(≤10%),说明 PCR扩增稳
定性好。
2.3.2　电泳稳定性　按 ITS-1区 PCR扩增条件进
行扩增 ,从同一管内取 5份 PCR液进行电泳 ,结果
用 Bio-Rad软件分析 , 峰强度依次为:80.42、
87.21、 84.32、 75.69、 74.58, RSD为 6.75%(≤
10%),说明电泳稳定性好 。
2.3.3　酶切稳定性　为了检查限制性内切酶 Sma
Ⅰ对川贝 DNA酶切的稳定性 ,本实验延长反应时
间至 16 h,平行 5管(依次编号为 1 ～ 5)考察酶切
稳定性 ,电泳结果用 Bio-Rad软件分析 (见表 3)。
结果发现平行 5管的酶切率 RSD为 3.02%,说明
限制性内切酶 SmaⅠ的稳定性良好。
Table3　StudyonstabilityofdigestionofITS-1ofFritilariawabuensis
bySmaⅠ
No. Peakdensity
119bp 188bp 307bp
Digestion
rate/%
1 41.58 66.19 76.80 58
2 43.90 56.29 64.25 61
3 36.03 51.49 59.92 59
4 28.27 46.36 56.07 57
5 26.63 55.91 52.31 61
2.4　PCR-RFLP方法的建立
在上述实验条件优化和方法学考察的基础上 ,
最终确定川贝母药材的 PCR-RFLP鉴定方法:称取
贝母干鳞茎 20mg,依次用 75%乙醇和灭菌超纯水
清洗 ,待干后按照新型广谱植物基因组 DNA快速
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第 3期 徐传林等:川贝母药材分子鉴定方法研究
提取试剂盒说明书提取基因组 DNA,然后用所提
取的 DNA为模板进行 ITS-1区 PCR扩增和酶切反
应 ,最后将酶切液进行琼脂糖凝胶电泳得到鉴定图
谱 。其中 ITS-1区 PCR反应体系为:在 200 μL
PCR反应管中依次加入 10 ×PCR反应缓冲液
3 μL, 25 mmol/LMgCl2 2.4 μL, 10 mmol/LdNTP
0.6μL, 30μmol/L引物 [ ITS-P1(5′-CGTAACAAG
GTTTCCGTAGGTGAA-3′)和 ITS-P3(5′-GCT
ACGTTCTTCATCGAT-3′)]各 0.5 μL, TaqDNA
聚合酶 1 U, DNA模板 1 μL,无菌超纯水补足反应
体积至 30μL;扩增程序为:95 ℃预变性 4 min,然
后 95℃变性 30 s, 55 ～ 58 ℃复性 30 s, 72℃延伸
30 s,共计 30个循环 ,最后于 72℃延伸 5 min。酶
切反应体系为:在 500 μL离心管中依次加入 PCR
反应液 6 μL, 10×酶切缓冲液 2 μL, SmaⅠ 5 U,无
菌超纯水补足反应体积至 20 μL,酶切反应在 30
℃水浴中进行 2h。
由贝母对照药材 PCR-RFLP图谱(图 2)可知 ,
所有川贝类(包括暗紫贝母 、甘肃贝母 、卷叶贝母 、
梭砂贝母 、太白贝母 、瓦布贝母)均能被酶切 ,在
100 ～ 200bp之间出现两条酶切条带 ,而非川贝类
(包括湖北贝母 、平贝母 、伊贝母 、浙贝母)只在 300
bp左右出现一条 PCR扩增条带 ,与文献 [ 3]报道
结果一致。
Figure2　PCR-RFLPelectropherogramsofreferencedrugs
M:100bpDNAladder;R0:Blankcontrol;R1-R10:SeealsoatTable1
2.5　贝母商品药材 PCR-RFLP鉴定结果
按 “2.4”项所建立的方法对贝母 12批商品药
材进行 PCR-RFLP实验 ,结果见图 3。由图可知 ,
所有 6批川贝类商品药材(S7 ～ S12)均能被酶切 ,
在 100 ～ 200bp之间出现两条酶切条带 ,而其余 6
批非川贝类商品药材(S1 ～ S6)均不能被酶切 ,只
在 300bp左右出现一条 PCR扩增条带。该结果表
明该方法专属性强 ,能准确鉴定川贝类与非川贝类
商品药材。
Figure3　PCR-RFLPelectropherogramsofcommercialdrugs
M:100bpDNALadder;S0:Blankcontrol;R1-R12:SeealsoatTable2
　讨　论
符合要求的 DNA是对中药材进行分子鉴定的
必要条件 ,但商品药材大多经过晒干 、烘烤等干燥
加工处理 ,导致基因组 DNA的提取较难顺利进行 。
据报道[ 6] ,贝母中淀粉含量占到整个鳞茎的 80%
左右 ,常规的 DNA提取方法得到的 DNA黏度大 ,
4℃放置一段时间后会褐变和浑浊 ,不能直接进行
后续的分子鉴定实验 。本实验选用试剂盒提取贝
母干鳞茎 DNA,与常规方法 [ 3]相比 ,大大缩短了提
取时间(可在 1 h内完成),且所提取的 DNA进行
电泳能得到清晰的 DNA条带 ,不需经过进一步的
纯化处理即可直接用于后续实验操作。
2005年版 《中华人民共和国药典》收载的川贝
母包括 4种基源植物 , 即卷叶贝母 F.cirhosa
D.Don、 暗 紫 贝 母 F.unibracteata Hsiao et
K.C.Hsia、甘肃贝母 F.przewalskiMaxim.exBatal、
梭砂贝母 F.delavayiFranch,考虑到目前市场上川
贝母供应短缺问题 , 2010年版《中华人民共和国药
典》新增了与它们亲缘关系较近并具有长期药用
历史的太白贝母 F.taipaiensisP.Y.Li与瓦布贝母
F.wabuensisS.Y.TangetS.C.Yueh作为川贝母的
基源植物。从本研究结果来看 ,新增的这两个基源
能产生与原来的 4个基源相同的酶切条带 ,属于川
贝母类 ,从而与其他贝母区别开来 。
本实验所建立的 PCR-RFLP方法与传统的性
状 、显微及理化鉴别方法相比 ,体现出明显的专属
性优势 ,同时方法还具有快速 、简便 、可操作性强等
优点 ,可作为川贝类商品药材的有效鉴定方法 。
参 考 文 献
[ 1] 　国家药典委员会.中华人民共和国药典:一部 [ M].北京:化
229
学 报 　 JournalofChinaPharmaceuticalUniversity 第 41卷
学工业出版社 , 2005.
[ 2] 　赵　欢(ZhaoH),吴　卫(WuW), 郑有良(ZhengYL), 等.
核糖体DNAITS序列分析在药用植物研究中的应用 [ J] .时
针国医国药(LishizhenMedMaterMedRes), 2009, 20(4):959
-962.
[ 3] 　王冲之(WangCZ).中药质量控制的分子生物学方法研究
[ D].南京:中国药科大学 , 2003.
[ 4] 　WangCZ, LiP, DingJY, etal.Simultaneousidentificationof
BulbusFritilariaecirrhosaeusingPCR-RFLPanalysis[ J].Phy-
tomedicine, 2007, 14(9):628-632.
[ 5] 　彭　昕(PengX).分子生物学方法鉴定药用贝母的研究
[ D] .南京:南京农业大学 , 2003.
[ 6] 　GaoWY, FanL, PaekKY.Ultrastructureofamyloplastsandin-
trecelulartransportofoldandnewscalesinFritilariaussuriensis
[ J] .JPlantBiol, 1999, 42(2):117-123.
·新趋势 ·
2009年全球新药上市介绍
最新研究显示 , 2009年全球首次上市的新活性物质(NASs)有 25个(只包括新化学实体或生物制剂 ,不包括新配方和
大流行流感疫苗), 比 2008年减少 20%,也低于过去 9年年均 29个产品的平均值。虽然全球新药上市增速放缓 , 但抗癌
药物 、糖尿病药物新品涌现 ,制药企业并未放慢研发的脚步。
2009年全球新药上市(25个)
通用名(商品名) 公　司 适应证
agomelatin(Valdoxan) 施维雅 抑郁发作
asenapinemaleate(Saphris) 默克 精神分裂症和双向情感障碍
besifloxacinhydrochlorice(Besivance) 博士伦 细菌性结膜炎
canakinumab(Ilaris) 诺华 cryopyrin相关周期性综合征
catumaxomab(Removab) TrionPharma 胰腺癌
dapoxetine(Priligy) Janssen-Cilag(Johnson＆Johnson) 早泄
degarelix(Firmagon) 辉凌 前列腺癌
dronedaroneHCl(Multaq) 赛诺菲-安万特 心房纤维颤动
eslicarbazepineacetate(Zebinix) Bial 癫痫
febuxostat(Uloric) Teijin 痛风
golimumab(Simponi) Centocor 类风湿关节炎
indacaterolmelate(OnbrezBreezhaler) 诺华 慢性阻塞性肺炎
liraglutide(Victoza) 诺和诺德 2型糖尿病
minodronicacid(Bonoteo/Recalbon) 安斯泰来 骨质疏松
nalfurafinehydrochloride(Remitch) Toray 尿毒症瘙痒
ofatumumab(Arzerra) Genmab 慢性淋巴细胞白血病
pazopanibhydrochloride(Votrient) 葛兰素史克 肾癌
pralatrexate(Folotyn) AllosTherapeutics T细胞淋巴瘤
prasugrel(Efient) 日本第一制药三共株式会社 预防急性冠脉综合征动脉粥样硬化
saxagliptin(Onglyza) 百时美 -施贵宝 2型糖尿病
tapentadolIR(Nucynta) Grǜnenthal 中度和慢性疼痛
tebipenempivoxil(Orapenem) 辉瑞 细菌感染
telavancin(Vibativ) Theravance 细菌性皮肤感染
tolvaptan(Samsca) 大冢 低钠血症
ulipristalacetate(ElaOne) HRAPharma 女性避孕
(中国医药报)
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