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菲油果种苗的组织培养技术研究



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上海农业科技 2015-3
菲油果种苗的组织培养技术研究
蒋建平1 卜顺法2 李 彪2 姚德彪3 汤桂钧3 (1上海市闵行区动植物检测检验中心 201109;
2上海市闵行区三农综合服务中心 201109;3上海旭东园艺有限公司 201112)
近年来,在众多绿化植物新秀中,菲油果脱颖而出。菲
油果(Feijoa sellowiana)又名肥吉果、费约果,为桃金娘
科菲油果属常绿灌木或小乔木,原产地为南美洲的巴西、阿
根廷等,目前已在世界上亚热带气候温暖地区广泛种植应
用,如澳大利亚、新西兰将其作为重要的水果种植生产,其
果实售价高出猕猴桃五倍以上。我国在21世纪初从国外少量
引种,在上海、浙江、江苏、湖南、广东等地少量应用。
菲油果四季常绿,适应性较强,能耐-10 ℃~45 ℃的
温度,对土壤要求不严,较耐盐碱及抗海风。叶革质有光泽,
对生椭圆形,长5~7 cm;花单生两性,花瓣粉红色、呈倒
卵形,雄蕊及花柱鲜红色,十分美丽;在沪、浙地区,一般
于春季4月中旬~5月上旬开花,花期可达20多d。花谢后
结椭圆形果实,长3~6 cm,果皮灰绿色,至深秋初冬成熟,
果肉甘甜,有菠萝香味,十分可口,除鲜食外,还可制作果
酱、果冻等食品[1]。
从菲油果生物学特性及生理生态习性可知,它是一种集
绿化、观赏、食用为一体的多用途树种,可谓“叶常绿,花
奇美,果可食”,其发展前景十分广阔。菲油果目前尚未在国
内大量应用,究其原因主要是因扦插、播种等繁殖方法效果
不佳,缺乏种苗。要想获得大量菲油果优质苗木,最佳方法
是应用组织培养技术,但碍于多种原因,目前大多研究停留
在胚胎培养、愈伤组织诱导等阶段[2],更未达到产业化生产
与应用的程度。笔者经过近3年的试验研究,以菲油果当年
成熟果实种子及当年萌发新芽半木质化枝条茎尖为外植体,
对整套组培快繁技术进行了系统研究,建立和掌握了关键技
术体系,生产出批量试管苗,为菲油果大量推广应用奠定了
基础,现将试验研究结果报道如下。
1 材料与方法
1.1 外植体选择与处理消毒
于当年秋季11月中旬采摘成熟果实。将果实洗净切开,
用针棒挑出似芝麻粒大小的黄白色种子,包在纱布中反复揉
搓掉果肉并用洗洁精清洗2次,剔除粘连种子上的果肉;种
子消毒:先用75%酒精消毒1 min,无菌水清洗1次,再用
2%洁尔敏消毒15 min,无菌水清洗1次,最后用5%次氯酸
钠加数滴吐温80消毒13 min,无菌水清洗4次。此外,选
择当年春季及秋季萌发的半木质化新芽枝条,包于纱布中用
洗洁精清洗3次,置自来水下冲洗2 h沥干;消毒方法同种
子消毒。
1.2 外植体接种与无菌系诱导
在超净工作台上将经消毒的材料接种于发生培养基上,
其中种子诱导发生培养基为MS0(即不添加外源激素);新
枝新芽诱导发生培养基配制了6种,以MS为基本培养基,分
别添加BA、ZT、NAA、IBA等外源激素,以筛选合适的培
养基配方。种子发生培养每瓶接种3~6粒。新枝诱导培养,
将已消毒的嫩枝切成1 cm长茎段,每段带1~2个茎节;用
镊子及解剖刀剥取新枝茎尖,长度约0.5 mm,连同下端
0.5~1 cm长的嫩茎段切下,分别接种于培养基上,每瓶接
种1段(个),以诱导茎尖或茎段萌发新芽,从而培养出无菌
系。培养基中添加蔗糖30 g/L、琼脂粉5.5 g/L,调节pH值
至5.8,培养室温度24 ℃,光照强度3 000 lux左右,每天
光照12 h。
1.3 无菌系培养及继代增殖
当种子萌发或茎尖培养诱导出的新芽不断生长并形成丛
生苗后,将其转至增殖培养基继代增殖。配制了6种增殖培
养基配方,分别添加BA、IBA、ZT等激素,从中筛选出适
宜配方,每30~45 d增殖1次,培养基的基本条件及培养室
的光温条件同发生培养。
1.4 生根培养
将丛生芽切成单芽,长度2~3 cm,转至生根培养基进
行生根培养,育出试管苗。培养基配方为1/2 MS+IBA 0.5
mg/L,其中蔗糖浓度20 g/L,铁盐不减半,其他条件同增
殖培养。
1.5 试管苗炼苗
将生根的试管苗移出培养室至光照下炼苗24 h,用镊子
取出幼苗,置清水中漂净根部所沾琼脂。炼苗基质为“泥炭
+椰糠+珍珠岩”(配比为2∶1∶1),混合后平铺在塑料大棚
———————
收稿日期:2015-02-27
摘 要:菲油果是一种多用途的经济绿化树种,但由于其繁殖技术未能攻克,致使种苗缺乏,未能得到广泛
应用。为解决这一难题,进行了菲油果组织培养快繁技术研究。经大量试验,掌握了菲油果以成熟种子及新芽茎
尖为主的外植体发生培养及整套组培快繁技术:种子发生培养基配方为MS0,茎尖发生培养基配方为MS+ B A 1 . 0
mg+IBA 0.1 mg/L;继代增殖培养基配方为MS+BA 1.0mg+IBA 0.1 mg/L,增殖率达1∶2.15~3.5;生根培养基
配方为1/2 MS+IBA 0.5 mg/L,生根率达96%。试管苗炼苗存活率达95%以上。
关键词:菲油果;种苗;外植体;组织培养;快繁技术
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苗床上,厚度8 cm左右。将试管苗浅栽入基质中,然后浇
足清水,用塑料小环棚覆盖以防失水。从第2天开始,每天
叶面喷水雾3~5次,以防失水萎蔫,如遇晴天高温,则用75%
遮光率的遮阳网遮光降温。炼苗15 d后,待新根、新叶长
出后施肥保生长,用0.1%硝酸铵、0.1%磷酸二氢钾、0.1%
硫酸镁溶液混合后浇灌,每月浇1~2次。
2 结果与分析
2.1 种子发生培养结果
据观察,种子经10 d培养后开始萌动发芽,培养15 d
时萌发率已达70%左右,多数幼苗长至0.5 cm左右,有的
长达1 cm左右,其双子叶陆续长出、展平并开始转绿。本
试验中污染率均为零污染,说明其消毒方法十分有效。这一
结果与国内类似相关报道有吻合之处[3],这与种子外表光滑
且深藏在果实中间有关。培养4周后其萌芽率高达96%,绝
大部分幼苗根系已下扎并长出第1对真叶,叶片均已转绿展
平,苗高达1~1.5 cm。
2.2 新枝嫩茎段与茎尖发生培养结果
据观察,新枝嫩茎段在初始培养的7 d内生长正常,但
第7天以后开始出现茎段褐化现象,以霉菌为主的污染率极
高,且在数次重复试验中表现相同。经过30 d左右的培养,
褐化率高达95%以上,污染率达95%~100%,经数次培养仍
未成功。究其原因,可能与木本植物经离体消毒后其酚类物
质外渗有关[4],从而导致嫩茎段细胞组织褐化死亡,且在不
同培养基中表现相同,说明与培养基无关。对多种培养基的
高污染率进行观察分析,主要原因是菲油果枝条、叶片上有
较厚的绒毛,消毒剂很难渗透进枝条组织结构中,故即便经
过严密的消毒清洗程序,亦无济于事(见表1)。
表1 不同培养上新枝茎段发生培养结果比较
茎尖培养的结果好于嫩茎段培养。在培养基上经15 d培
养后,其茎尖开始缓慢生长;培养30 d后茎尖叶原基生长
并长成幼叶,叶片展开且转绿。但试验发现,其污染率亦较
高,一般可达70%左右,但褐化程度远轻于嫩茎段培养(见
表2)。这可能是由于茎尖的组织结构与茎段的组织结构不同
所致,因为茎尖十分幼小,在超净台剥取的长度仅0.5 mm
左右,其叶原基尚未有绒毛生长或生长量较小,在幼嫩状态
下且经消毒后微生物不能轻易侵染生长。同时,茎尖生长势
较强,是新枝新芽的雏形,故相对容易萌发新芽成幼苗,对
于组织培养而言,利用茎尖培养是上策。
从茎尖和茎段发生培养结果可知,茎尖的培养效果显著
优于茎段,虽然从众多的培养实践与结果来看[5、6],茎段培
养速度快于茎尖,这是因为茎段茎节内藏着隐芽,经刺激后
可萌发出新芽,而茎尖是新芽的雏形,虽生长缓慢,但脱毒、
杀菌、防褐化的效果较为显著,因而茎尖培养是菲油果发生
培养的有效选择方法之一。
2.3 不同培养基对继代增殖培养的影响
将种子发生及茎尖发生培养成功的无菌系转至继代增殖
培养基进行不断增殖,以扩大瓶苗基数,即将单个幼苗育成
丛生苗。在3种增殖培养基配方试验结果比较中,其增殖系
数差别不大,综合比较,以MS+BA 1.0 mg+IBA 0.1 mg/
L较好,瓶苗生长健壮,叶色深绿(见表3)。
表3 继代增殖不同培养基增殖率
2.4 生根培养结果
将继代增殖的丛生苗切成单株,转接至生根培养基作生
根培养,长度2 cm左右,配方为1/2 MS+IBA 0.5 mg/
L。培养7 d后便可见根原基长出,15 d左右根系陆续伸长,
20多d后根系完全长成,长度1 cm左右,每株有根3~5条,
根尖乳白色。生根率达96%,有时可达100%,育成了完整的
试管苗,幼苗叶色深绿,生长健壮,叶片数5对左右。
2.5 试管苗炼苗结果
试管苗移栽至基质中炼苗,在“泥炭+椰糠+珍珠岩”混
合基质中,经过精细管理,其成活率高达95%以上。但成活
率高低与移栽季节密切相关,在春季3~5月及秋季9~11月
成活率最高,甚至可达100%,其他季节成活率不理想,尤其
是在6~8月,在高温高湿条件下,在无降温控温设施的塑料
大棚内成活率很低,有时会全部烂苗死亡;12月~翌年2月
如保温措施良好,亦可获得较高的成活率,但幼苗生长缓慢,
有时会因寒冻影响而形成“红苗”、“僵苗”等情况。桃金娘
科植物一般不耐寒冻,笔者在多年前进行“淘金彩梅”(又名
风蜡花)的试管苗炼苗时深有实践体会[7],故应做好防冻保
暖措施。
3 讨论与小结
菲油果是一种集绿化、观赏、食用为一体的多用途常绿
树种,在欧美、大洋洲地区已有广泛栽培与应用,不失为名
贵品种,且有良好的发展前景;菲油果在国内由于缺乏种苗
而未能得到大量应用,有的地区即使有应用,也只是从国外
进口种苗后作盆栽或绿化观赏之用,而作为果树栽培十分罕
见,且国内在种苗规模化生产方面亦未见报道。
本研究经过近3年的不断探索,掌握了菲油果以种子、茎
尖为外植体的组织培养技术体系,生产出了批量种苗并应用
配方
编号
1
2
3
4
5
6
培养基配方
MS+BA0.5 mg+IBA0.05 mg/L
MS+BA1.0 mg+IBA0.1 mg/L
MS+BA1.5 mg+IBA0.15 mg/L
MS+ZT1.0 mg+IBA0.1 mg/L
MS+ZT1.5 mg+IBA0.15 mg/L
MS+ZT2.0 mg+IBA0.2 mg/L
污染
率(%)
100
100
100
100
100
100
褐化
率(%)
95
95
98
95
96
99
瓶数
(个)
60
60
60
60
60
60
萌芽
数(个)
0
0
0
0
0
0
配方
编号
1
2
3
培养基配方
MS+ZT1.0 mg+IBA0.1 mg/L
MS+ZT1.5 mg+IBA0.15 mg/L
MS+ZT2.0 mg+IBA0.2 mg/L
接种数
(个)
50
50
50
污染瓶数
(个)
33
31
35
污染率
(%)
66
62
70
褐化数
(个)
35
32
30
褐化率
(%)
70
64
60
萌芽数
(个)
15
18
20
表2 不同培养基上新枝茎尖发生培养结果比较
瓶苗生长
状 况
苗稍瘦弱
苗健壮、叶深绿
苗偏细长、 叶稍淡
配方
编号
1
2
3
培养基配方
MS+BA0.5 mg+IBA0.05 mg/L
MS+BA1.0 mg+IBA0.1 mg/L
MS+BA1.5 mg+IBA0.15 mg/L
接种数
(瓶)
100
100
100
增殖数
(瓶)
210
215
212
增殖率
(倍)
2.10
2.15
2.12
(下转第92页)
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30~35 d开始加温催芽,整个催芽过程要注意热源调控,防
止温度过高,姜芽徒长、瘦弱甚至烤坏姜种,或温度偏低,不
出芽甚至烂姜。催芽温度前3~5 d保持20~23 ℃,随后
升高至24~27 ℃,保持湿度75%~80%;20~25 d后、姜
芽萌动时,温度应降至20 ℃以下,以减少养分消耗,促使
芽身健壮、芽头圆钝肥胖如花生米状,即为壮芽。当大部分
姜芽长到1~1.5 cm时,应停止加温,将温度逐渐降到14~
16 ℃时待播种。
2.4 土壤处理与种植密度
田块尽量每年轮换种植,早姜收获后最好种植水稻,实
行水旱轮作。结合整地做畦做好施足基肥和土壤处理等工
作,每667 m2施腐熟农家肥1 500 kg、三元复合肥50 kg
及适量硼、镁复合微肥作基肥,每667 m2撒施生石灰75~
100 kg调节土壤酸碱度,然后翻松土壤,再用喷雾器将甲
醛50~100倍液均匀地喷洒在地面上进行土壤消毒,然后稍
翻土,再用薄膜覆盖或直接密闭大棚,5~7 d后定植(定植
前要掀开地膜、棚膜挥发掉气体)。
大棚种植生姜主要是为了提早上市,因此需要密植。耙
地平整后起垄,每垄之间间距50~60 cm,垄高20~30 cm,
垄宽30 cm,每垄中每穴株距5~8 cm;每个种姜一般掰成
50~70 g大小,每片种姜上只留1个粗壮嫩芽(少数姜种也
可保留2个壮芽),其余幼芽全部抹去,以使养分集中供给主
芽,保证苗齐苗壮。
2.5 田间管理
种姜定植后应注意肥水管理和保温防寒。生姜不耐渍,
应做好开沟排水。出苗期生长缓慢需水不多,土壤湿度不宜
过大,过大则发育、出苗趋慢,并易导致种姜腐烂。生长盛
期需水量大大增加,并需要不断从土壤中吸收养分来满足其
生长所需,因此,在苗高10~15 cm时宜追施提苗肥,一般
每667 m2用45%复合肥10~20 kg对清水浇施,以后视苗
情和采收情况施用追肥,宜采取少量多次方式。同时,经常
保持土壤湿润,最好采取喷溉,选择在晴天上午11时~下午
2时进行,水量不宜过多,以土壤湿度保持在65%~75%为
宜。定植后应注意保温防寒,出苗后,如天气晴好、温度较
高,可适时于中午少许放风。种植完后进行畦面芽前除草,每
667 m2用50%乙草胺乳油75~100 mL对水喷雾,喷施时
姜田土壤要保持湿润,齐苗后若垄上仍有杂草,应进行人工
拔除。
2.6 病虫害防治
早姜主要病虫害有姜瘟、姜螟和地下害虫。姜瘟病应以
预防为主、化学防治为辅,发现病株,及早清除,满足采收
条件的可直接采收上市,同时在病穴内撒生石灰消毒,并喷
施农用硫酸链霉素、姜瘟宁、可杀得等农药防治。姜螟可用
敌百虫、速灭杀丁等防治。地下害虫可用辛硫磷、敌敌畏、毒
死蜱等灌根防治。
———————
参考文献
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于实际。研究结果表明,以秋季成熟果实种子作发生培养外
植体,在试管内经消毒后瓶内发芽,而后成为丛生苗,育成
无菌系,再经继代增殖后将幼苗转接至生根培养,成为合格
的试管苗。种子在MS 0培养基上启动发芽,培养10 d后
开始萌芽,15 d后大部分萌芽,30 d后长成幼苗并从叶腋
间长出腋芽成为无菌系,即可进行继代增殖培养。增殖培养
基以MS+BA 1.0 mg+IBA 0.1 mg/L较为适宜,增殖率
为1∶2.15,瓶苗生长健壮,无玻璃苗现象,当培养基中BA
浓度高达1.5 mg/L时,瓶苗生长不良,甚至有轻度玻璃化
(虽然增殖系数高),这可能是由于激素浓度较高时,植物体
内积累过多的细胞分裂素,导致丛生苗过多而使叶片缺乏叶
绿素,因而生长受阻。
以当年萌发、半木质化的新枝作外植体,一般常以嫩茎
段、茎尖等组织作诱导培养出新芽,但在近3年的试验研究
中,嫩茎段培养未获成功,究其原因主要是茎段经消毒后培
养会褐化死亡,即使采取多次间隙消毒及消毒前作脱醛化处
理亦效果甚微;同时,以真菌为主、细菌为次的微生物污染,
因茎段密披绒毛而消毒效果差,导致污染严重而失败,故笔
者认为此技术方法不适用于菲油果嫩茎段离体培养。作为组
织培养中优选外植体之一的茎尖培养,经反复试验终获成
功,虽然发生成功率稍低,但在培养贵重品种中能获得无菌
系亦不失为难能可贵。研究得出,其增殖培养基与种子外植
体无菌系增殖培养配方相同。
生根培养与试管苗炼苗试验研究中,获得了96%的高生
根率及95%以上的高成活率,培育出了高质量的试管苗,最
终获得了优良种苗。经过3年的研究探索,菲油果组织培养
技术终获成功,为今后菲油果种苗规模化生产和应用奠定了
扎实的基础。
———————
参考文献
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