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收稿日期: 2010-07-28
基金项目:四川省中医药管理局( 2010-79) ;四川省科技支撑计划( 2010SZ0007)
作者简介:王跃华( 1963-) ，女，教授，主要从事药用植物的教学、科研工作; Tel: 13980021790，Fax: 028-83341003，E-mail: wangyaohua888@
yahoo. com. cn。
·资源·
川贝母细胞团块悬浮培养生产生物碱的研究
王跃华，何宗晟，孙雁霞，马良良，刘益丽，林抗雪
( 成都大学生物产业学院，四川 成都 610016)
摘要 目的:建立川贝母细胞团块悬浮培养体系，筛选出快速获取细胞团块增殖的最佳培养条件和激素配比。
方法:以 MS培养基为基本培养基，比较了接种量、激素配比和生长调节物质等对川贝母细胞团块悬浮培养的影响，
并比较了细胞团块在不同培养条件下的生长情况，测定了增殖细胞团块中总生物碱含量。结果与结论: 用川贝母
细胞团块进行悬浮培养，其生长速度明显快于固体培养;细胞团块中总生物碱含量均高于市售川贝母和野生川贝
母鳞茎;川贝母细胞团块悬浮培养最适的接种量为 30 g /L，最佳培养基为 MS + 6-BA 2. 0 mg /L + NAA 0. 2 mg /L。
关键词 川贝母;细胞团块颗粒;悬浮培养;生物碱
中图分类号: R282. 71 文献标识码: A 文章编号: 1001-4454( 2011) 02-0183-04
Study on the Production of Alkaloid by Cell Mass Suspension
Culture of Fritillaria cirrhosa
WANG Yue-hua，HE Zong-sheng，SUN Yan-xia，MA Liang-liang，LIU Yi-li，LIN Kang-xue
( Department of Biological Engineering，Chengdu University，Chengdu 610160，China)
Abstract Objective: Set up Fritillaria cirrhosa cell mass suspension culture system to rapidly screen the best culture conditions
for cell mass proliferation and hormone combination. Methods: Using MS medium as the basic medium，the impact of inoculum size，hor-
mone combination，growth regulators for Fritillaria cirrhosa cell mass suspension culture were compared，and also the growth of cell mass
at different culture conditions was compared，and the total alkaloids content in proliferative cell mass was measured. Results and Con-
clusion: Fritillaria cirrhosa grow significantly faster in cell mass suspension culture than in the solid culture. The total alkaloid content
in cell mass is higher than commercial and wild bulb of Fritillaria cirrhosa. The optimal inoculum size for cell mass suspension culture
is 30 g /L and the optimal culture media is MS + 6-BA 2. 0 mg /L + NAA 0. 2 mg /L.
Key words Fritillaria cirrhosa D. Don; Cell mass particles; Suspension culture; Alkaloid
自从 1956 年 Routine和 Nickel首次提出用植物
细胞培养技术生产次级代谢产物以来，国内外学者
利用植物细胞培养技术生产次生代谢产物的植物已
达百种以上〔1〕，其中人参、毛地黄、紫草、日本黄连
等都已实现了工业化生产〔2〕。而近年来王素芳等
在进行植物细胞培养生产次生代谢物的研究中发
现，采用细胞团块进行悬浮培养可使团块颗粒中心
至表面形成一个传质梯度，起到了一个类似细胞分
化的作用，这在一定程度上有利于次生代谢产物的
形成，进而能够明显提高植物次生代谢物的含
·381·Journal of Chinese Medicinal Materials 第 34 卷第 2 期 2011 年 2 月
DOI:10.13863/j.issn1001-4454.2011.02.023
量〔3〕。许建峰在培养高山红景天的愈伤组织中发
现，成团生长的红景天细胞其红景天苷的含量明显
高于松散生长的细胞〔4〕。刘佳佳等对银杏细胞团
块颗粒悬浮培养的研究发现，当银杏细胞团块粒径
为 3 ～ 4 mm时，银杏内酯含量最高能够达到细胞干
重的 0. 0631%〔5〕;而在银杏细胞悬浮培养物中银杏
内酯仅为 0. 0099%〔6〕，银杏细胞团块悬浮培养生产
的银杏内酯比银杏细胞悬浮培养物产生银杏内酯高
出 5 倍多。
由此可见，在进行植物悬浮培养时，以细胞团块
作为培养材料是提高培养物中有效成分的重要途径
之一。本实验以名贵中药材川贝母 ( Fritillaria cir-
rhosa D. Don) 细胞团块为悬浮培养材料，通过对川
贝母细胞团块最佳悬浮培养条件的筛选，获得有效
成分含量高、生长快速的川贝母培养物，实现川贝母
细胞团块大规模悬浮培养生产生物碱的目的。
1 材料
川贝母细胞团块由成都大学组培室提供，将其
在超净工作台上切成 3 ～ 5 mm 左右的小块作为本
实验悬浮培养的材料; 市售川贝母药材购于成都同
仁堂药店的青贝;野生川贝母采自四川康定。
2 方法
2. 1 培养方法 悬浮培养的基本培养基为 MS，蔗
糖浓度 4%，高压灭菌前 pH 调至 6. 0。在 1000 Lx
光照条件下振荡培养，摇床转速 120 r /min，培养温
度为( 20 ± 2) ℃。
2. 2 悬浮细胞团块鲜重测定 将培养的川贝母细
胞团块用尼龙网过滤，经减压抽滤至细胞团块不再
滴水为止，称其鲜重; 将抽滤后的细胞团块置于 55
℃的烘箱中烘干至恒重后称得干重，实验重复 3 次。
2. 3 细胞生长曲线的绘制 分别取培养生长 4、8、
12、16、20、24 和 28 d 的培养瓶每组 3 个，取其培养
物称重，按“2. 2”项下方法培养，测定其细胞团块生
长量并绘制生长曲线。实验重复 3 次。
2. 4 总生物碱含量的测定 测定方法参照宋福坤
等〔7〕进行，以贝母素乙为标准品( 购于中国生物制
品检定所) ，采用分光光度法测定。在 412 nm 处测
得标准品和供试品溶液都有最大吸收，故选择 412
nm为测定波长。
2. 5 计算公式及数据分析 细胞团块接种量 =接
种后瓶重 －接种前瓶重; 细胞团块增殖倍数 = ( 收
获量 －接种量) /接种量; 细胞团块生长速率 = ( 收
获量 －接种量) /培养天数; 折干率 = 烘干重量 /鲜
重 × 100% ( 60 ℃烘 48 h) ; 细胞团块增殖倍数和生
长速率均计算平均值和标准差( 珋x ± s) 。
3 结果与分析
3. 1 不同激素配比对川贝母悬浮细胞团块生长的
影响 本实验研究了 NAA、IAA 和 6-BA 不同激素
组合对川贝母细胞团块快速增殖的影响，其中 NAA
的浓度范围为 0. 1 ～ 0. 5 mg /L，IAA 的浓度范围为
0. 1 ～ 0. 5 mg /L，6-BA 的浓度为 1 mg /L 或 2 mg /L;
实验每 4 d观察记录 1 次，培养 28 d 的统计结果见
表 1。从表 1 中可以看出不同激素配比对植物细胞
团块的增殖有很大的影响。总体来看，6-BA 与
NAA的激素组合比 6-BA与 IAA的激素组合更有利
于川贝母细胞团块的增殖。从 A1 ～ A3 培养基中的
激素配比可以看出，在 6-BA的浓度为 1. 0 mg /L时，
细胞团块的增殖倍数是随着 NAA 浓度增加而递增
的;当 6-BA浓度为 2. 0 mg /L 时细胞团块的增殖倍
数不是随着 NAA浓度增加而递增，而是以 NAA 0. 2
mg /L为最高，低于或高于此浓度的细胞团块增殖倍
数均下降。而在 6-BA 与 IAA 的激素组合中，当 6-
BA的浓度为 1. 0 或 2. 0 mg /L 时，细胞团块的增殖
倍数均随着 IAA 浓度的上升而增加，但细胞团块总
体生长速度较慢，增殖倍数也较低，其细胞团块的最
高增殖倍数仅为 2. 63 ± 0. 037，明显低于 6-BA 2. 0
mg /L与 NAA 0. 2 mg /L 激素组合的细胞团块增殖
倍数 3. 94 ± 0. 064。由此可见，在川贝母细胞团块
的悬浮培养中，以 6-BA 与 NAA 的激素组合更有利
于细胞团块的增殖，其中以 6-BA 2. 0 mg /L、NAA
0. 2 mg /L为最佳激素配比。
表 1 不同激素配比对川贝母细胞
团块悬浮培养的影响
编号
激素配比 / ( mg /L)
6-BA NAA IAA
细胞团块
鲜重 / ( g /L)
细胞团块
增殖倍数
细胞团块生长
率 / ( g /d·L)
A1 1. 0 0. 1 78. 96 ± 2. 225 1. 63 ± 0. 074 1. 74 ± 0. 080
A2 1. 0 0. 2 87. 84 ± 1. 425 1. 93 ± 0. 047 2. 06 ± 0. 051
A3 1. 0 0. 5 103. 1 ± 2. 127 2. 43 ± 0. 071 2. 61 ± 0. 076
A4 2. 0 0. 1 121. 75 ± 1. 550 3. 05 ± 0. 052 3. 28 ± 0. 055
A5 2. 0 0. 2 146. 46 ± 1. 866 3. 94 ± 0. 064 4. 23 ± 0. 068
A6 2. 0 0. 5 121. 68 ± 1. 489 3. 06 ± 0. 050 3. 27 ± 0. 053
A7 1. 0 0. 1 72. 22 ± 1. 616 1. 41 ± 0. 054 1. 51 ± 0. 057
A8 1. 0 0. 2 84. 80 ± 2. 230 1. 83 ± 0. 074 1. 96 ± 0. 080
A9 1. 0 0. 5 99. 40 ± 2. 266 2. 31 ± 0. 076 2. 48 ± 0. 081
A10 2. 0 0. 1 93. 66 ± 1. 815 2. 12 ± 0. 061 2. 27 ± 0. 065
A11 2. 0 0. 2 103. 65 ± 1. 642 2. 46 ± 0. 055 2. 63 ± 0. 059
A12 2. 0 0. 5 108. 87 ± 1. 112 2. 63 ± 0. 037 2. 82 ± 0. 039
3. 2 不同接种量对细胞团块增殖的影响 在悬浮
培养中，接种量的多少对细胞生长往往有较大的影
响〔8〕。实验分别接入了浓度为 10、30 和 50 g /L 的
川贝母细胞团块进行培养。每 4 d 观察一次，并记
·481· Journal of Chinese Medicinal Materials 第 34 卷第 2 期 2011 年 2 月
录细胞团块的生长情况，培养 28 d 统计实验结果见
表 2。从表 2 可以看出不同接种量对川贝母细胞团
块悬浮培养的延迟期、指数生长期和细胞团块的生
长速度有明显的影响作用。当接种量为 10 g /L，其
细胞团块的生长速率最低，仅为在每升培养液中每
天生长( 1. 82 ± 0. 052) g，而且延迟期较长需要 10 d
左右，细胞团块生长的指数期只有 12 d;当接种量增
加为 30 g /L时，川贝母细胞团块生长的延迟期缩短
为 6 d左右，同时细胞团块生长的指数期延长到了
16 d 左右，细胞团块的生长速率也明显加快，为每
升培养液中每天可生长( 4. 11 ± 0. 070 ) g; 当接种量
继续增加到 50 g /L时，细胞团块的生长速率并没有
表现出进一步增加，细胞团块生长的延迟期与 30 g /
L的接种量是一样的，但细胞团块的增殖倍数却出
现明显的下降仅为 2. 26 ± 0. 035，并且从表 2 也可
以看出其指数生长期最短仅为 9 d，这可能是由于接
种过多数量的细胞团块造成培养液中营养物质消耗
过快的缘故。结果表明，在对川贝母的细胞团块进
行悬浮培养时，接种量的多少对细胞团块的生长起
着重要作用，适宜的接种量可明显加快细胞团块的
生长速率，当接种量高于或低于其最适接种量时，细
胞团块生长均较慢，实验结果显示川贝母细胞团块
的最佳接种量为 30 g /L。
表 2 不同接种量对川贝母细胞团块悬浮培养的影响
接种量
/ ( g /L)
延迟期
/d
指数期
/d
细胞团块鲜
重 / ( g /L)
细胞团块
增殖倍数
生长速率 /
( g /d·L)
10 10 12 61. 05 ± 2. 723 5. 30 ± 0. 167 1. 82 ± 0. 052
30 6 16 145. 08 ± 1. 965 3. 84 ± 0. 066 4. 11 ± 0. 070
50 6 9 162. 93 ± 1. 774 2. 26 ± 0. 035 4. 03 ± 0. 063
3. 3 病毒唑对川贝母细胞团块悬浮培养的影响
病毒唑是一种强的单磷酸次黄嘌呤核苷脱氢酶抑制
剂，它不仅作为一种抗生素在植物组织培养的除菌
方面应用较为广泛〔9〕，而且还在植物组织培养中诱
导丛生芽有较好地促进作用。本实验在 MS + 6-BA
2. 0 mg /L + NAA 0. 2 mg /L培养液中，分别加入了三
个浓度梯度病毒唑 5、10、20 mg /L，每瓶培养液中均
接入 30 g /L的细胞团块。每 4 d观察一次，培养 28
d统计的实验结果见表 3。从表 3 中可以看出，在培
养液中加入不同浓度的病毒唑对川贝母细胞团块的
增殖有不同的影响作用。当培养液中加入的病毒唑
药剂浓度为 5 mg /L时，在培养 5 d左右的细胞团块
的表面和伤口处都开始产生小细胞团块，培养 28 d
后统计其细胞团块的生长速率最高即为每升培养液
中每天可生长 5. 44 ± 0. 076 g;而当病毒唑药剂浓度
增加到 10、20 mg /L时，细胞团块的生长速率反而出
现减慢的趋势，细胞团块鲜重、细胞团块增殖倍数也
减小，均低于对照组( CK) ，并且观察发现在培养细
胞团块的伤口处出现了较严重的褐变现象。分析其
原因可能是由于病毒唑药剂结构与核苷类相似，具
有与核苷类细胞分裂素类似的活性〔10〕，在通常的情
况下，低浓度病毒唑对细胞团块增殖有促进作用，但
高浓度病毒唑对细胞团块增殖就会产生一定的抑制
作用。
表 3 不同浓度病毒唑对川贝母
细胞团块悬浮培养的影响
病毒唑浓度
/ ( mg /L)
细胞团块
鲜重 / ( g /L)
细胞团块
增殖倍数
生长速率 /
( g /d·L)
0( CK) 147. 20 ± 0. 968 3. 90 ± 0. 032 4. 19 ± 0. 034
5 182. 36 ± 2. 128 5. 08 ± 0. 071 5. 44 ± 0. 076
10 141. 60 ± 2. 549 3. 72 ± 0. 085 4. 00 ± 0. 090
20 119. 98 ± 2. 142 2. 97 ± 0. 032 3. 18 ± 0. 035
3. 4 不同培养方式对川贝母细胞团块增殖的影响
以 30 g /L的接种量将川贝母细胞团块接入 MS +
6-BA 2. 0 mg /L + NAA 0. 2 mg /L 的液体培养基中，
并且在固体培养基中也接入相同量的川贝母细胞团
块，每 4 d取样称重并观察记录细胞团块的生长情
况，分别绘制细胞团块在液体和固体培养基中的生
长曲线见图 1。从图 1 可以看出不同培养方式对川
贝母细胞团块的生长影响很大，细胞团块在液体培
养基中的生长速度明显快于在固体培养基中。
图 1 不同培养方式下细胞团块的生长曲线
从 2 种培养方式绘制的生长曲线看，在液体培
养基中细胞团块的生长延迟期为 6 d 左右; 然后进
入对数生长期，并开始迅速增长，对数生长期持续时
间为 16 d 左右，此时间段细胞团块的鲜重增殖近 3
倍达到最大生产量; 此后，进入平稳期，但处于平稳
期的时间很短，随后开始进入衰退期，细胞团块生长
速度明显减慢，这主要是由于培养过程中增殖的细
·581·Journal of Chinese Medicinal Materials 第 34 卷第 2 期 2011 年 2 月
胞团块较多，培养液中营养物质已大量耗尽以及细
胞团块的生存空间减少的缘故。
与液体培养相比，川贝母细胞团块在固体培养
中的生长周期明显延长。从固体培养的生长曲线可
以看出，在细胞团块培养过程中的延迟期需要 8 d
左右，而在对数生长期细胞团块鲜重的最大生产量
为 60 g，增殖了 2 倍左右，明显低于液体培养; 这主
要是由于液体培养基具有更好的分散性，川贝母细
胞团块在液体培养基中能更容易地吸收各种营养物
质的缘故。实验结果可以得出川贝母细胞团块的液
体培养方式更有利于细胞团块的增殖生长。
3. 5 总生物碱含量测定 实验采用分光光度法以
贝母素乙为标准品，测定比较了市售川贝母、野生川
贝母和川贝母悬浮培养细胞团块的总生物碱含量，
结果见表 4。用悬浮培养方式生产的川贝母细胞团
块其总生物碱含量是 3 种测定样品中最高的，明显
高于野生川贝母和市售川贝母，其总生物碱含量是
市售川贝母的 2. 04 倍。
表 4 总生物碱含量测定
材料种类 材料干重 /g 总生物碱含量 /%
市售川贝母 0. 5 0. 068
野生川贝母 0. 5 0. 109
悬浮细胞团块 0. 5 0. 139
4 讨论
当前国内外学者已对一些药用植物细胞悬浮培
养进行了研究，并取得了一定的成功; 但对贝母属植
物细胞的悬浮培养研究报道很少，仅有樊君〔11〕等人
进行了伊贝母细胞悬浮培养的研究，而对采用川贝
母细胞团块悬浮培养方式生产总生物碱的研究目前
还未见报道。在组织培养中，常规的固体培养方式
存在细胞团块在培养基中分散性较差，因此细胞团
块吸收营养物质不及悬浮培养充分，从而使得细胞
团块生长速度慢、周期长。另外，多数悬浮培养是以
单个细胞作为外植体进行培养的; 虽然单个细胞的
分裂能力强，但分化程度极低，不利于培养细胞中次
生代谢产物的产生和积累，并且单个细胞不能形成
一个传质梯度，也会影响到次生代谢产物的产生。
本实验以川贝母细胞团块为悬浮培养材料，主
要探索了川贝母细胞团块在悬浮过程中的各种影响
因素。实验结果显示，川贝母细胞团块悬浮培养过
程中受许多因素条件的影响，其中不同激素浓度组
合对川贝母细胞团块的增殖有明显的影响; 而接种
量对川贝母细胞团块的启动时间和生长速率也有较
大的影响;对于培养获得的川贝母细胞团块进行总
生物碱含量的测定结果得知，培养获得的川贝母悬
浮培养细胞团块中的总生物碱在所测定的三种样品
中是最高的，由此可见，采用悬浮培养方式生产川贝
母细胞团块不仅可以大大地缩短生产周期，而且细
胞团块培养物中的总生物碱含量也明显增高，更进
一步证实了开展川贝母细胞团块悬浮培养研究具有
重要的意义。
近年来在植物细胞悬浮培养液中，通过加入一
定数量的前体物来增加培养物中有效成分含量已得
到了广大研究者的重视，吕东平〔12〕等人已通过在对
水母雪莲悬浮培养液中加入苯丙氨酸、肉桂酸、乙酸
钠三种前体物，均增加了培养物中的黄酮含量;因此
能否通过研究在川贝母细胞团块的悬浮培养液中添
加一定种类和数量的前体物质来增加的其总生物碱
含量还有待进一步的研究。
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